本发明属于生物检测领域，具体涉及用于现场快速检测布鲁氏杆菌的恒温扩增技术的通用型引物组、试剂盒及方法。
背景技术：
由于布病的症状缺少特异性、潜伏期长(一般为14d～180d)，故而漏诊、误诊率较高，如治疗不及时可引发慢性炎症，长期危害患者健康。因此，早期诊治具有重要意义。目前，国内外报道的布鲁氏杆菌检测方法主要有血清学方法和分子生物学方法。血清学方法灵敏度高、检测快速、操作简便且价格合理，常用于布鲁氏杆菌病的初筛和监测，但其前期病原菌培养易对实验人员造成污染并且结果由实验人员观察所得，受人为因素干扰较大，且对实验人员有较高的感染风险，因此更加安全的分子生物学检测方法近年来应用广泛。liu等建立了一种常规pcr方法检测布鲁氏杆菌，该方法灵敏度与特异性较低，操作繁琐，无法用于现场检测。杜琳等建立了生鲜乳中布鲁氏杆菌的多重pcr检测方法，但是该方法灵敏度只能达到1×105cfu/ml，较单一pcr检测方法灵敏度有所下降且同样不适用于现场检测。张太翔等建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的taqman实时荧光定量pcr方法，该方法具有灵敏度高、特异性好的特性，但对实验人员、实验室均有较高要求，不适用于现场快速检测。布鲁氏杆菌传染性极强，因此建立适合现场快速检测的检测方法对于阻断布鲁氏杆菌的传播，降低二次传播风险具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供用于检测布鲁氏杆菌通用型的引物组、试剂盒及方法。该引物组可特异、灵敏扩增布鲁氏杆菌，该检测方法操作简单、快速准确、特异性好、灵敏度高、覆盖布鲁氏杆菌常见的牛、样、猪、犬生物型，不会存在漏检的可能性。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：用于现场检测布鲁氏杆菌的通用型引物组，其特征在于，所述引物组由下述引物组成：
bru-ofcccgacttgatcgcattgaseqidno.1；
bru-obcgttgggagcgagctttgseqidno.2；
bru-ifatttccggcgcaggcgaaaatattggcaaccgagccattcseqidno.3；
bru-ib
ttcgcgatcagaccaccaatcgtttttccgtatcggcactggseqidno.4；
bru-lbgataataggttccggctgtgcseqidno.5。
一种用于现场检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组成物：
(1)用于现场检测布鲁氏杆菌的通用型引物组：
bru-lbgataataggttccggctgtgcseqidno.5；
(2)恒温扩增的反应体系20～50μl：2.6～3.0mmol/ldntpmixture、30～50mmol/ltris-hcl、10～30mmol/lkcl、12～20mmol/lmgso4、10～30mmol/l(nh4)2so4、1.2～2.0mol/l甜菜碱、6～10u/μlbstdna聚合酶、1.4～1.8μmol/lbru-if、1.4～1.8μmol/lbru-ib、0.1～0.3μmol/lbru-of、0.1～0.3μmol/lbru-ob、0.6～1.0μmol/lbru-lb、depc水；
(3)阳性对照和空白对照，所述阳性对照为含如seqidno.6所示序列的阳性质粒，所述空白对照为去核酸的超纯水。
所述恒温扩增的反应体系总体积为25μl，其中，所述反应体系中包括2.8mmol/ldntpmixture、40mmol/ltris-hcl、20mmol/lkcl、16mmol/lmgso4、20mmol/l(nh4)2so4、1.6mol/l甜菜碱、8u/μlbstdna聚合酶、2×sybrgreeni、1.6μmol/lbru-if、1.6μmol/lbru-ib、0.2μmol/lbru-of、0.2μmol/lbru-ob、0.8μmol/lbru-lb、样品dna模板1～100ng，depc水。
一种采用所述试剂盒现场检测布鲁氏杆菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤s1、从样品中提取dna；
步骤s2、对所述dna进行恒温扩增；
步骤s3、结果判定：
若有“s”型荧光信号扩增曲线，ct值<35，则判断为阳性；
若无“s”型荧光信号扩增曲线，无ct值或ct值>45则判断为阴性；
若ct值在35-45之间，重复实验，若ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
在步骤s2中，所述恒温扩增的反应体系为25μl，包括以下反应混合物：2.8mmol/ldntpmixture、40mmol/ltris-hcl、20mmol/lkcl、16mmol/lmgso4、20mmol/l(nh4)2so4、1.6mol/l甜菜碱、8u/μlbstdna聚合酶、2×sybrgreeni、1.6μmol/lbru-if、1.6μmol/lbru-ib、0.2μmol/lbru-of、0.2μmol/lbru-ob、0.8μmol/lbru-lb、样品dna模板1～100ng，depc水。
在步骤s2中，所述恒温扩增的程序，使用荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪，63℃30秒；然后，63℃15秒，63℃45秒，45个循环，在每一循环的63℃45秒结束时收集fam荧光信号。
在步骤s2中，同时设置以如seqidno.6所示序列的质粒阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。
本发明提供的试剂盒与检测方法操作简单，快速准确，特异性好，灵敏度高，基因型覆盖全面，不会存在漏检的可能性，适合规模性推广和应用。
附图说明
图1为布鲁氏杆菌保守序列在brucella种内比对结果；
图2为布鲁氏杆菌保守序列在brucella种外比对结果；
图3为采用布鲁氏杆菌第一组引物组的恒温扩增荧光曲线；
图4为采用布鲁氏杆菌第二组引物组的恒温扩增荧光曲线；
图5为采用布鲁氏杆菌第三组引物组的恒温扩增荧光曲线；
图6为采用布鲁氏杆菌第四组引物组的恒温扩增荧光曲线；
图7为采用布鲁氏杆菌第五组引物组的恒温扩增荧光曲线；
图8为采用布鲁氏杆菌第六组引物组的恒温扩增荧光曲线；
图9为采用布鲁氏杆菌最佳引物组对20份10pg/μl阳性对照进行重复性恒温扩增观察荧光扩增曲线的结果(阳性有扩增曲线，阴性无扩增曲线)；
图10为采用布鲁氏杆菌最佳引物组对20份100fg/μl阳性对照进行重复性恒温扩增观察荧光扩增曲线的结果(阳性有扩增曲线，阴性无扩增曲线)；
图11为采用布鲁氏杆菌菌最佳引物组对20份阴性对照进行重复性恒温扩增的结果(阳性有扩增曲线，阴性无扩增曲线)；
图12为采用布鲁氏杆菌最佳引物组进行恒温扩增检测的特异性验证结果，其中1～8分别为2个猪型布鲁氏杆菌、2个牛型布鲁氏杆菌、2个羊型布鲁氏杆菌、2个犬型布鲁氏杆菌；
图13为布鲁氏杆菌灵敏度检测结果，扩增曲线，其中1～6分别为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl，每个浓度三个平行样本均检出，7为1fg/μl，三个平行样本中仅一个样本检出，，0.1fg/μl和阴性对照无扩增曲线；
图14为从8份免疫血清核酸阳性样本中检测为阳性的结果，其中1为2个阳性对照，2为2个猪源免疫血清样本，3为2个牛源免疫血清样本，4为2个羊源免疫血清样本，5为2个犬源免疫血清样本。
具体实施方式
实施例1
用于现场检测布鲁氏杆菌的通用型引物组，所述引物组由下述引物组成：
上述布鲁氏杆菌恒温扩增的引物组设计及筛选：
1.引物组设计
表1本发明设计的六组布鲁氏杆菌现场快速检测的恒温扩增引物组
2.特异性扩增基因片段的序列比对
图2为布鲁氏杆菌保守序列在brucella种外比对结果。
3.引物组筛选
对本发明设计的布鲁氏杆菌六组引物组进行筛选优化，筛选试验结果表明，第一组引物组阳性对照在63℃反应13分钟时出现扩增曲线，阴性对照无扩增，扩增结果如图3所示；第二组引物组阳性对照在63℃反应32分钟时出现扩增曲线，阴性对照在第35分钟出现假阳性，扩增结果如图4所示；第三组引物组阳性对照无扩增，阴性对照也无扩增，扩增结果如图5所示；第四组引物组阳性对照在63℃反应12分钟时出现扩增曲线，阴性对照无扩增，扩增结果如图6所示；第五组引物组阳性对照在63℃反应6分钟时出现扩增曲线，阴性对照倾斜向上，存在二级结构，扩增结果如图7所示；第六组引物组阳性对照在63℃反应44分钟时出现扩增曲线，阴性对照无扩增，扩增结果如图8所示。由此可见，第四组引物组扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线，阴性对照均无扩增，表明本发明所设计的布鲁氏杆菌恒温扩增第四组引物组具有很好的特异性。因此，确定选用第四组的引物组为最佳的可供特异性检测布鲁氏杆菌恒温扩增引物组序列。本实施例最终确定的布鲁氏杆菌引物组基因序列如表2所示，其中阳性对照为实施例2中制备的阳性对照品，阴性对照为去核酸的超纯水。
表2本发明设计的用于现场快速检测布鲁氏杆菌恒温扩增引物组
实施例2
引物组的特异性扩增验证
1.阳性对照品的制备
根据实施例1获得的布鲁氏杆菌最佳引物组特异性恒温扩增基因序列，选取含布鲁氏杆菌rb51chromosomei序列如seqidno.6。布鲁氏杆菌阳性对照品如seqidno.6经人工合成基因制备质粒，作为阳性对照(委托宝生物工程(大连)有限公司完成制备)，分装并于-20℃保存备用。
布鲁氏杆菌阳性对照品的基因组序列seqidno.6：
ttatttcagcacgcccgcttccttgtaaaagcgttctgcgccgggatgcagcggaataccgaggctgctcgtcgcactatcgagcttgatgagcttgcccttcgcatggcccgcatcgagtgccttgcgtgtatcctcgttccagagaaccttggtgatgttatagatgaggtcgtccggctgcttggcgctcgtcacccactgtgcggcaacggcaagggtcggtgtttccgccacgtccttataggctccggcaggaaccacatccttcgagaagaaggaatatttctccagaatcttgtccgcttccggcccggagatcggaacgagcgaaataccgttcgagatggccagttccgagattgcgcccgtcggatagccgcccacaaagaaataggcgtccagcgcaccatctttcagcctctcgcctgccggtcccggcttcaggtgttcagccttgatatcgtcttccgtgaggccgtaggcttcaagaacgatacgcgcatcgacgatggtgccagaacccggctcatccagcgaaacgcgcttgcctttcaggtctgcgaccgatttgatgtttgcatccttacgcgcaacgatatggatcgtttccgggtaaagcgtcgccagaaggcgcaaatcttccaccttgcccttgccatcataaaggccggtgccgttataggcccaataggcaacgtctgactgcgtaaagccggactccagagcgcccgacttgatcgcattgatattggcaaccgagccattcgacgaaacggccgtcgcgacgagacccggcacgcccttttcgcctgcgccggaaatcgcgttcgcgatcagaccaccaatcggataataggttccggctgtgccgccagtgccgatacggaaaaatgtcggggcctgtgcaaccgcaaagctcgctcccaacgcaatcgcgcccgccaccgccgcaacagccaagcgacggattttgcttccgaatttcat。
2.特异性验证
本发明为验证所设计的布鲁氏杆菌引物组恒温扩增特异性，选取羊型布氏杆菌核酸、猪型布氏杆菌核酸、牛型布氏杆菌核酸、犬型布氏杆菌核酸、大肠杆菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸进行检测特异性验证。
3.恒温扩增荧光检测
恒温扩增是指在恒温条件下(60～65℃左右)对目标基因进行高效扩增，因此可在水浴锅或者普通的金属浴内完成扩增反应，利用荧光染料(如sybrgreeni)为荧光检测指示剂，在反应结束后可以通过荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪观察荧光扩增曲线。
3.1恒温扩增反应体系
恒温扩增反应体系总体积为25μl，其中含有：2.8mmol/ldntpmixture、40mmol/ltris-hcl、20mmol/lkcl、16mmol/lmgso4、20mmol/l(nh4)2so4、1.6mol/l甜菜碱、8u/μlbstdna聚合酶、2×sybrgreeni、1.6μmol/lbru-if、1.6μmol/lbru-ib、0.2μmol/lbru-of、0.2μmol/lbru-ob、0.8μmol/lbru-lb、depc水、样品dna模板(1～100ng)。
具体如表3所示，其中，dntpmixture购自takara公司、sybrgreeni购自invitrogen公司，bstdna聚合酶购自newenglandbiolabs公司。
表3恒温扩增反应体系各组分
3.2进行恒温扩增反应。程序为(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)：
荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪的反应参数：63℃30秒；然后，63℃15秒，63℃45秒，45个循环，在每一循环的63℃45秒结束时收集fam荧光信号。
3.3对照扩增反应
3.3.1在恒温扩增反应的同时，设置阳性对照、空白对照。
各对照反应体系中，除模板外其余组分及反应条件与3.1相同，且阳性对照、空白对照体积也应达到试样dna模板体积要求。
3.3.2以如seqidno.6所示序列的阳性质粒作为恒温扩增反应体系的阳性对照模板。
3.3.3以去核酸的超纯水作为恒温扩增反应体系的空白对照模板。
4.结果判定
根据有无“s”型荧光信号扩增曲线判定结果。
阴性：无“s”型荧光信号扩增曲线，无ct值或ct值>45。
阳性：ct值<35，可报告为阳性。
可疑：ct值在35-45之间，建议重复实验，若ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
5.引物组的特异性扩增验证结果
利用本发明方法对羊型布氏杆菌核酸、猪型布氏杆菌核酸、牛型布氏杆菌核酸、犬型布氏杆菌核酸、大肠杆菌核酸、金黄葡萄球菌进行检测。结果如图12所示，图中只有羊、猪、牛、犬布氏杆菌核酸出现特异性扩增曲线，而其他病毒未检测到扩增曲线，说明所设计的引物组特异性强。
实施例3现场恒温扩增检测灵敏度试验
1.灵敏度试验方法
1.1外引物、内引物、环引物、mg2+浓度、甜菜碱浓度的优化
将筛选好的内引物bru-if与bru-ib浓度从1.4～1.8μmol/l以0.2μmol/l为间距递增；外引物bru-of与bru-ob浓度从0.1～0.3μmol/l以0.1μmol/l为间距递增；环引物bru-lb浓度从0.6～1.0μmol/l以0.2μmol/l为间距递增；mg2+浓度从12mmol/l至20mmol/l以4mmol/l为间距递增，甜菜碱浓度从1.2mol/l至2.0mol/l以0.4mol/l为间距递增，利用taguchi法探究摸索最佳的引物、mg2+、甜菜碱浓度。
1.2bstdna聚合酶的筛选及优化
为确定bstdna聚合酶的最佳用量和比列，分别对不同用量的bst酶(6.0u/μl、8.0u/μl、10.0u/μl)，摸索最佳用量。
1.3梯度稀释灵敏度试验
将布鲁氏杆菌体外转录dna质粒阳性对照样本以10倍差进行稀释，梯度浓度分别为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl，0.1fg/μl，经实施例1的恒温扩增反应体系进行检测，验证本发明实施例所设计的布鲁氏杆菌恒温扩增引物组所建立的现场恒温扩增检测方法的灵敏度。
2.灵敏度试验结果
2.1反应体系各物质浓度的优化的结果
通过taguchi方法进行试验设计，根据所获得的最佳浓度范围进一步进行优化，从多次重复试验中发现：内引物浓度为1.6μmol/l、外引物浓度为0.2μmol/l、环引物浓度为0.8μmol/l、mg2+的浓度为16mmol/l、甜菜碱的浓度为1.6mol/l时，恒温扩增效果良好，所以选择内引物浓度为1.6μmol/l、外引物浓度为0.2μmol/l、环引物浓度为0.8μmol/l、mg2+的浓度为16mmol/l、甜菜碱的浓度为1.6mol/l作为检测的最佳引物、mg2+和甜菜碱浓度。
2.2bstdna聚合酶的优化结果
分别对不同用量的bstdna酶检测结果进行比较，确定bstdna酶的量为8.0u/μl，即25μl反应体系用量为1.0μl；
2.3反应体积优化试验结果和最终反应体系的确定
为确定恒温扩增反应体积的差异，采用25μl体系与50μl体系进行恒温扩增检测比较，显示两种体系检测结果一致，因此选定25μl恒温扩增反应体系作为实际应用的反应体系。结合上面的优化结果，确定布鲁氏杆菌现场恒温检测方法的反应体系，见表3。
2.4梯度稀释灵敏度试验结果
按照1.3的方法进行梯度稀释灵敏度试验，结果如图13所示，浓度分别为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、0.1fg/μl的不同浓度质粒阳性对照样本。经多次试验显示，布鲁氏杆菌的10fg/μl浓度阳性质粒三个平行样本均检出，均存在明显荧光扩增曲线，且曲线形态良好。采用10fg/μl阳性质粒样本作为模板进一步进行20个重复测试，确定本发明所设计的布鲁氏杆菌现场恒温扩增检测的引物组和反应体系的检测灵敏度为10fg/μl。
实施例4
一种用于现场检测布鲁氏杆菌的试剂盒及使用方法
1.该试剂盒的组成包括：
(1)恒温扩增反应体系
表5恒温扩增反应体系配方
(2)阳性对照：所述阳性对照为含如seqidno.6所示序列的阳性质粒；
(3)空白对照：所述空白对照为去核酸的超纯水。
本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。
2.检测时所需要的器材
设备：荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪；移液器(量程0.1-200μl)；乳胶或一次性手套若干。
3.试剂盒的使用方法
3.1样本要求
适用样本类型：全血、血清、淋巴结、脾脏、肝脏、肉、肉制品、环境样品(粪便、饲料、污水等)等猪、牛、羊、犬及其制品中布鲁氏杆菌的检测。样本dna提取可以按照提取试剂盒操作进行，把样本dna用于检测实验或保存于-80℃。
3.2操作步骤
3.2.1现场恒温扩增体系配制
将试剂盒置室温使恒温扩增反应液、空白对照和阳性对照完全溶化，并混匀。取23μl恒温反应液至每个反应管内，然后加2μl所提取的样品核酸，每个反应总体积为25μl。每次检测应设立阳性对照和空白对照。在实时荧光pcr仪上进行扩增检测。
3.2.2反应程序
在荧光pcr仪上：63℃30秒；然后，63℃15秒，63℃45秒，45个循环，在每一循环的63℃45秒结束时收集fam荧光信号。
3.3依据实施例2的结果判定规则进行结果的判定。
每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
4.注意事项
上述试剂以及阳性对照品在-20℃条件下保存。
试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
实施例5
布鲁氏杆菌试剂盒在现场快速检测猪、牛、羊、犬及其制品中的应用
1.样品的收集
1.1样品采集及处理
1.1.1活猪、牛、羊、犬样品，无菌采集抗凝血或血清5ml。
1.1.2病死猪、牛、羊、犬剖检样品或屠宰场剖检样品，无菌采集死猪、牛羊、犬的脾、肝、淋巴结、扁桃体等组织样品。2～8℃低温运至实验室用于检测。
1.2样品处理
1.2.1血液样品直接用；脾、肝、肉、肉制品等样品处理方法，取适当大小的组织块放入盛有pbs缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45秒，制成约10％的组织匀浆液，5000r/min离心5分钟，取200μl上清液进行核酸提取。
1.2.2粪便、饲料样品处理方法，取适量的粪便、饲料放入盛有pbs缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45秒，制成约10％的匀浆液，5000r/min离心5分钟，取200μl上清液进行核酸提取。
1.2.3污水样品处理方法，直接取200μl污水进行核酸提取。
注：上述病毒收集方法都是报道的常用方法。
2.dna提取
采用dna提取试剂盒或自动核酸提取仪提取各类样本中的核酸。低温保存备用。
注：或采用其他商品化的提取试剂盒提取样品dna。这些方法都是报道的常用方法。
将该检测方法应用于猪血清、牛血清、羊血清、犬血清等100份血清样本及8份免疫血清核酸的检测，按照上述方法进行样品处理和提取dna，进行恒温扩增现场快速检测，检测其中是否含有布鲁氏杆菌。并采用荧光pcr检测方法进行阳性和阴性结果的验证，详见表4。
3.用本发明的试剂盒对于获取的108份样本进行了检测。结果显示，从100份血清样本中检测布鲁氏杆菌均为阴性，从8份免疫血清核酸阳性样本中检测结果均为阳性(图14)。
本发明对108份样本的检测中未发现假阳性和假阴性结果，结果见表4，进一步证实了方法的实用性。
表4采集或收集的108份样本检验结果
本发明的方法应用于动物及其制品中布鲁氏杆菌检测将具有广阔的前景，广泛适用于对动物及其制品中布鲁氏杆菌检测等领域。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。
序列表
<110>大连海关技术中心
<120>用于现场检测布鲁氏杆菌的通用型引物组、试剂盒及方法
<130>20210226
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cccgacttgatcgcattga19
<210>2
<211>18
<400>2
cgttgggagcgagctttg18
<210>3
<211>40
<400>3
atttccggcgcaggcgaaaatattggcaaccgagccattc40
<210>4
<211>42
<400>4
ttcgcgatcagaccaccaatcgtttttccgtatcggcactgg42
<210>5
<211>21
<400>5
gataataggttccggctgtgc21
<210>6
<211>990
<400>6
ttatttcagcacgcccgcttccttgtaaaagcgttctgcgccgggatgcagcggaatacc60
gaggctgctcgtcgcactatcgagcttgatgagcttgcccttcgcatggcccgcatcgag120
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ctgcttggcgctcgtcacccactgtgcggcaacggcaagggtcggtgtttccgccacgtc240
cttataggctccggcaggaaccacatccttcgagaagaaggaatatttctccagaatctt300
gtccgcttccggcccggagatcggaacgagcgaaataccgttcgagatggccagttccga360
gattgcgcccgtcggatagccgcccacaaagaaataggcgtccagcgcaccatctttcag420
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gtaggcttcaagaacgatacgcgcatcgacgatggtgccagaacccggctcatccagcga540
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accaccaatcggataataggttccggctgtgccgccagtgccgatacggaaaaatgtcgg900
ggcctgtgcaaccgcaaagctcgctcccaacgcaatcgcgcccgccaccgccgcaacagc960