通用名称：高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
【包装规格】:
作I者：疾控科研试剂博客
联I系：I99I-4747-I94
单管单人份，24人份/盒。
【预期用途】
本试剂盒适用于定性检测人宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种高风险HPVDNA，包括(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82），其中，可特异性区分16型和18型HPV。
本试剂盒采用4种荧光标记物，其中，HEX标记常见高风险型HPV16型探针，TEXRD标记常见高风险型HPV18型探针，FAM标记另外16种HPV基因型（26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）探针，CY5标记内标基因探针，实现了在同一管扩增体系中检测18种HPV基因型。
本试剂盒检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。
【检测原理】
本试剂盒以HPV基因组L1变异区为靶区域，设计针对18种高风险HPV基因型的特异性引物探针组合，用不同的荧光标记将常见的高风险型别HPV16型（HEX标记），HPV18型（TEXRD标记）与另外16种基因型（FAM标记）区分开来，并设计了内标引物探针（CY5标记）对样本和实验过程加以监控。配以DNA聚合酶等成分组成核酸扩增试剂；样本提取采用快速核酸提取方法，提取的病毒核酸加入配制好的核酸扩增反应体系中，使用荧光PCR仪进行快速PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，实现对未知样本的检测。
【主要组成成分】
试剂盒组分名称
规格
数量
主要成分
细胞裂解液
1200μl/管
1
Tris-HCl
HRHPVPCR反应管
单管单人份
24
Taq酶、UNG酶、特异性引物、特异性探针、固体封盖剂（石蜡）、Tris盐酸Buffer
阴性质控品
100μl/管
纯化水
HPV阳性质控品
HPV18型感染的Hela细胞
注：1.需要自备的试剂：无菌生理盐水。
2.不同批号试剂盒的以上成分不可以互换使用。
3.可使用本试剂盒自带细胞裂解液进行核酸提取，也可使用商品化的核酸提取试剂盒：广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备20140038号）。
4.本试剂盒组分不包含配套的样本采集设备。
【储存条件及有效期】
试剂盒保存于-20±5℃，避免反复冻融，有效期9个月。
运输采用干冰（或者冰袋）保持低温，72小时内不影响本试剂盒的检测性能。试剂使用时开瓶（复融）8小时内其检测性能不受影响。
试剂使用前反复冻融次数不应超过4次。试剂盒生产日期详见产品标签。
【适用仪器】
AB7500RealTimePCRSystem。
【样本要求】
1.适用样本类型：宫颈脱落细胞，生殖泌尿道分泌物。
2.受检需知：
3.样本采集：
3.1宫颈脱落细胞：医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转4－6周以获取足量的上皮细胞，然后取出宫颈刷置于盛有2ml生理盐水的无菌小试管中备检。若样本黏液过多或者含血量过多应该尽量重新取样。
3.2生殖泌尿道分泌物：
3.2.1女性尿道样本：首先使用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用棉拭子插入尿道约2CM，然后捻动棉拭子，最后将棉拭子放入细胞保存液中，密闭送检。采集尿道样本时，受检者必须在采集前2个小时禁止小便。
3.2.2男性尿道样本：使用细小的尿道棉拭子，插入男性尿道2-4CM，然后捻动尿道棉拭子取出分泌物，最后将尿道棉拭子放入细胞保存液中，密闭送检。4.样本保存和运送：通常情况下，宫颈脱落细胞样本采集后置于生理盐水的无菌小试管中，生殖泌尿道分泌物样本采集后置于细胞保存液中，均可立即用于测试。如需保存，置于2-8℃保存不应超过两周，-20±5℃保存不应超过一年。样本运送时应采用0℃冰壶。
注：样本采集及保存中使用的宫颈刷和细胞保存液，推荐使用江苏健友医疗科技有限公司生产的一次性使用无菌宫颈采样器和细胞保存液。
【检验方法】
1.样本处理和核酸提取（样本处理区）
本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；HPV阳性质控品参与提取，用于PCR检测试剂的质控。
可采用广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒（核酸提取或纯化试剂：粤穗械备20140038号），具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。也可采用本试剂盒自带细胞裂解液进行核酸提取，该提取试剂含有颜色示踪剂，能指示模板加入与否。具体操作如下：
1.1振荡宫颈刷保存管或棉拭子保存管10-30秒，使细胞充分落入液体，取振荡后液体0.5ml-1.0ml（如果细胞数量少可以加大体积到1.5ml）转至1.5ml离心管中；
1.210,000rpm离心3分钟，弃上清；
1.3样品沉淀中加入1ml无菌生理盐水，洗涤沉淀，10,000rpm离心3分钟，弃上清；
1.4样品沉淀中加入50μl细胞裂解液，振荡60秒，充分悬浮细胞沉淀，备用；
1.5质控品处理：取装有HPV阳性质控品、阴性质控品的离心管，10,000rpm离心30秒，然后按1.3～1.4的处理步骤操作。2.核酸扩增试剂准备（试剂准备区，冰上操作）
2.1从试剂盒中取出HRHPVPCR反应管，5,000rpm离心5秒后,备用；
2.2往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸20μl（如样本不足20μl，请用纯化水补足至20μl后加样）及提取后的阴性质控品、阳性质控品各20μl。盖紧管盖，5,000rpm离心30秒后转移至扩增检测区。
3.PCR扩增（扩增检测区）
3.1将反应管放入仪器样品槽
3.2AB7500RealTimePCRSystem仪器设置
3.2.1打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控品（NTC）、阳性质控品以及未知样本（Unknow），并在“SampleName”一栏中设置样本名称，探针检测模式设置为：
Target
Detector
ReporterDye
QuencherDye
Name
16种常见高风险HPV基因型（26、31、33、35、39、
FAM
NONE
45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）
HPV16
HEX
VIC/HEX
HPV18
TEXRD
TEXASRED/ROX
内标基因（PPIA）
CY5
Passive
Reference
3.2.2打开instrument窗口，设置循环条件如下：
程序
温度
循环数
Segment1
50℃
3分钟
95℃
5分钟
Segment2
5秒
45
58℃（采集荧光）
31秒
反应体积50μl，保存文件，运行
4.结果分析
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），建议将阈值线调至各个通道的最高荧光值的1/20，例如本试剂盒用到四个通道，实验结束后需分别调FAM通道、HEX通道、TEXRD通道和CY5通道的阈值线至各个通道最高荧光值的1/20，点击Analysis自动获得分析结果，记录样本Ct值结果。
5.质量控制
样品名称
FAM通道
HEX通道
TEXRD通道
CY5通道（内标通道）
结果
无明显对数扩增曲线
阴性
有明显对数扩增曲线，Ct≤
阳性
37
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【阳性判断值或者参考区间】
使用本试剂盒和对照试剂盒对临床样本进行检测，两者不符的使用复核试剂盒进行检测，并根据对照与复核检测结果将样本分为阳性组和阴性组，对比本试剂盒检测的Ct值，从而确定本试剂盒参考值，当本试剂盒Ct值大于37时，均属于阴性组，当本试剂盒Ct值小于或等于37时，均属于阳性组。因此，将Ct值等于37作为本试剂盒的参考值（CUTOFF值）。
【检验结果的解释】举例说明部分可能出现的检验结果分析如下表所示：
CY5通道（内标通
结果判断
道）
Samplen
无明显对数扩增
有明显对数扩增
该样品为阴性
曲线
曲线，且Ct≤37
2
Samplen+1
该样品为除HPV16，18型外的其他16种HPV高风
险型一个或多个型别阳性
Samplen+2
该样品为HPV16型阳性
Samplen+3
该样品为HPV18型阳性
Samplen+4
该样品为HPV16型阳性和除HPV16，18型外的其
他16种高风险型的一个或多个型别的混合阳性
Samplen+5
该样品为HPV18型阳性和除HPV16，18型外的其
Samplen+6
该样品为HPV18型阳性（采样时病毒载量大，取得
曲线，且Ct≤33
的细胞核少的情况）
Samplen+7
该样品为HPV16型阳性（采样时病毒载量大，取得
Samplen+8
该样品加样浓度低于本试剂盒检测灵敏度，该样品
曲线，但Ct>37
为阴性，建议重新提取样本DNA
Samplen+9
未检测到内参基因，请重新制备待检样品，再次检
曲线，且33 测 Samplen+10 Samplen+11 除上述情况外的 请重新检测或询问技术支持人员 其它情况 1.阴性结果报告格式为：本试剂盒对该样本未检测到HPVDNA； 2.阳性结果报告格式为：本试剂盒对该样本检测到HPVDNA（并可根据需要提供检测样本的具体结果，如Ct值或曲线图作为参考）； 3采样时，在出现样本的病毒载量大，取得的细胞核少的情况下，FAM通道/HEX通道/TEXRD通道和CY5通道（内标通道）之间有可能会存在竞争，所以会出现FAM通道/HEX通道/TEXRD通道为相应型别阳性（有明显对数扩增曲线，且Ct≤33），而CY5通道（内标通道）无明显对数扩增曲线的情况，此种情况下结果判断为相应通道对应型别的阳性； 4.本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段； 5.示例：（阈值根据样本曲线调整至对数生长区，FAM、HEX、TEXRD和CY5荧光强度不同，可分别调整后输出对应Ct值，此处不再单独给出调整阈值后的实验结果曲线图） 本试剂盒为阳性检测结果的示意图如下： 【检验方法的局限性】 1.本试剂盒为定性检测试剂，可通过分析荧光来区分HPV16型（HEX标记）和HPV18型（TEXRD标记），但针对除HPV16型和HPV18型外的其他16种高风险型别，则只能确定是否存在感染，无法确定感染类型为单一或混合感染，无法给出确切的HPV感染型别。 2.本试剂盒不能检测HPV低风险型感染。 3.样本检测结果和样本收集、处理、运送及保存质量有关，其中任何失误都将可能导致假阴性结果。 4.如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。 【产品性能指标】 1.产品分析性能评估结果表明： 1.1本试剂盒可用于检测18种HPV基因型别的DNA样本，对18种HPV型别（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82）的质粒样本、质粒与阴性的宫颈脱落细胞的混合物样本、质粒与阴性的生殖泌尿道分泌物的混合物样本，各选用三个连续浓度梯度作为待测样本，使用合格的连续三批试剂，进行重复性检测，通过分析检测结果的阳性检出率，得出本试剂盒对18种HPV型别的检测灵敏度均达到5×103拷贝/ml； 3 1.2与其它非本试剂盒检出范围内的常见HPV型别（如6/11/40/42/43/44/54/61/67/69/70/71/72/81/CP8304/83）、与种属相近或引起症状相似的其他病原体（如沙眼衣原体、解脲脲原体、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、梅毒螺旋体、淋球菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫等）无交叉反应； 1.3样本中可能存在的内源性物质（血液、宫颈粘液等）对检测结果不产生干扰，其中，血液浓度达到10%时对检测结果无影响，宫颈粘液浓度达到20%时对检测结果无影响；样本中可能存在的外源性物质如α-干扰素（100万单位/ml）、壬苯醇醚（10mg/ml）、克霉唑（1mg/ml）、咪康唑（1mg/ml）、洁尔阴洗液（浓度为10%），在本试剂盒的实验条件下，对检测结果不产生干扰。 2.临床研究试验： 本试剂盒共检测样本1210例，与对照试剂相比，本试剂盒的阳性符合率为100%，阴性符合率为96.26%，总符合率为98.68%。 【注意事项】 1.本试剂盒仅用于检测以下18种高风险型HPV：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82。 2.实验前请仔细阅读本说明书。 4.仪器使用请参考仪器配套用户手册。 6.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区）；实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；使用经高压灭菌的一次性离心管和吸头或购买无DNA酶、RNA酶的离心管和吸头。 7.试剂盒中组分需在效期内使用，不使用本试剂盒提供的组分进行实验将可能导致错误结果。 8.PCR检测试剂使用前要完全解冻，瞬时离心后使用，但应避免反复冻融。 9.完成样本核酸处理后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20±5℃待用。 10.如果在标本处理中存在交叉污染，可能出现假阳性。 11.对每次实验进行质量控制。 12.标本处理时“弃上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀。 【参考文献】 1.WrightTCJr,SchiffmanM:AddingatestforhumanpapillomavirusDNAtocervical-cancerscreening.NEnglJMed.2003;348:489–90. 2.MuozN,BoschFX,deSanjoseS,etal.Epidemiologicclassificationofhumanpapillomavirustypesassociatedwithcervicalcancer.NEnglJMed.2003;348(6):518-27. 3. UngerER,DillnerJ,editors.HumanPapillomavirusLaboratoryManual.1st EditionGeneva: World HealthOrganization; 2009. 4. BouvardV,BaanR,StraifK,etal.Areviewofhumancarcinogens-PartB:biologicalagents.LancetOncol.2009;10:321–2. 5. CastlePE, SchiffmanM,WheelerCM,etal.Impactofimproved classificationon the associationofhuman papillomaviruswithcervical precancer. AmJEpidemiol.2010;171:155–63. 6.DeSanjoseS,QuintWG,AlemanyLetal.Humanpapillomavirusgenotypeattributionininvasivecervicalcancer:aretrospectivecross-sectionalworldwidestudy.LancetOncol.2010;11(11):1048-56. 7.KatkiHA,KinneyWK,FettermanB,etal.Cervicalcancerriskforwomenundergoingconcurrenttestingforhumanpapillomavirusandcervicalcytology:apopulation-basedstudyinroutineclinicalpractice.LancetOncol.2011;12(7):663–72. 8.SaslowD,SolomonD,LawsonHW,etal.AmericanCancerSociety,AmericanSocietyforColposcopyandCervicalPathology,andAmericanSocietyforClinicalPathologyscreeningguidelinesforthepreventionandearlydetectionofcervicalcancer.CACancerJClin2012;62(3):147–72.