关键词：大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验；16SrRNA；
大肠杆菌（Escherichiacoli）是动物体内的常见细菌，其在动物体内分布十分广泛。正常情况下作为动物体内的常在菌群，大肠杆菌与动物机体保持着一种相对平衡状态。但少数具有特定毒力因子的大肠杆菌可作为条件性致病菌，引起人畜感染，一直是研究的热点。随着社会的发展与经济水平的不断提高，越来越多的宠物作为伴侣动物陪伴人类生活，宠物源大肠感染人类的机率也在不断增大。我国对于UPEC的研究还处于初级阶段，研究主要集中在人源UPEC上，而对宠物源UPEC的研究仍比较匮乏。致病性大肠杆菌是引起人和宠物尿道感染的主要病原菌之一，也开始慢慢受到人们的重视。
本研究对猫尿液进行病原微生物的分离培养，结合分子生物学鉴定方法确定分离菌株为大肠杆菌，对该致病菌的敏感药物进行了筛选，为深入研究UPEC的致病机理、耐药机制、临床诊断与治疗防控提供科学的参考依据。
1、材料与试剂
1.1样本及培养基
样本采自深圳某宠物医院英国短毛猫，无菌采集中段尿液。自制LB营养肉汤、麦康凯与血平板等。
1.2主要仪器
生物安全柜为青岛海尔特种电器有限公司产品、细菌浊度仪为湖南长沙天地人生物科技有限公司产品、隔水式恒温培养箱为上海一恒科学仪器有限公司产品、PCR仪为美国Bio-Rad公司产品、DY-A型电泳仪为上海康达电子仪器厂产品、Hema紫外透射分析仪凝胶成像系统为珠海市黑马医学仪器有限公司产品。
1.3主要试剂
药敏片购自奥克欧德有限公司，BacterialDNAKit试剂盒、购自于OMEGA公司，核酸染料GoodView、DNAMarkerDL2000购自于TaKaRa公司，PBS与琼脂糖购自于Invitrogen公司，血平板与麦康凯平板购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
2、实验方法
2.1菌株的分离培养
无菌取少量猫尿液接种在血平板上与麦康凯平板，在生化培养箱37℃培养18~24h，观察细菌的形态、大小与排列方式。挑取单个菌落进行抹片，并进行革兰氏染色，镜检并观察细菌的形态，然后将单个菌落接种在肉汤培养基中进行增菌培养18h。
2.2引物的设计与合成
根据GenBank公布大肠杆菌的细菌16SrRNA基因全长序列，在两端保守区域设计一对扩增引物，理论可扩增片段大小为1433bp，送广州睿博生物技术有限公司合成，引物序列如下:
16SrRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
16SrRNA-R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
2.316SrRNA基因的扩增与测序
从分离纯化的血平板上挑取单个菌落到1.5mL的无菌EP管中，置于沸水中95℃5min后，然后室温12000rpm/min离心2min，然后用细菌提取试剂盒抽取DNA，对分离细菌的16SrDNA进行扩增。PCR反应体系：反应体系为25ul：2×TransTaq-TPCRSuperMix12.5ul、模板DNA1.0uL、引物各1.0uL、ddH2O，9.5uL，PCR反应程序：95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，35个循环；72℃，10min，4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶鉴定，将PCR筛选阳性产物送广州睿博生物技术有限公司测序。
2.416SrRNA核苷酸同源性比对及遗传进化树的构建
将测序所得基因序列提交至GenBank数据库进行比对。根据比对结果，利用MegAlign、DNAStar与MEGA6.0软件用邻接法构建系统进化树，分析分离菌株与参考菌株的亲缘关系，鉴定分离菌株的种属。
2.5药敏试验
取出灭菌后的比浊管加入4mL的一次性灭菌注射用水，放置比浊仪中进行调零。挑取纯菌落（可多个）稀释到比浊管中，混匀（确保完全溶解）。放置到比浊仪中进行测定，测定范围为0.48-0.52MCF。平板的涂布：在平板上标记清晰样本的编号、组号。将无菌棉棒放置于比浊管中充分吸收液体直至棉棒中的气泡全部排出（耗时10~15s）。棉棒在放入比浊瓶与拿出时确保不能碰触到瓶口，如若碰到或者污染他处，必须更换棉棒。将棉棒在平板中画一个十字，三个角度从上到下均匀涂布，角间隔120°，每次涂布后绕边两圈。贴完药敏片后将培养基倒置放入37℃恒温箱，培养16~18小时（阳性球菌放置24小时）后观察结果，按照NCCLS2009年标准，以耐药、中敏、敏感判定药敏试验结果。
3、实验结果
3.1菌株的分离与纯化
分离菌株经37℃18-24h生化培养箱中培养，在血琼脂平板上37℃培养18-24h，可见大量菌落，菌落呈圆形、直径为1.5-3.5mm左右、灰白色、边缘规则、呈β溶血，革兰氏阴性杆菌（图1、图2）。
图1分离菌株菌落的特征
图2分离菌株革兰氏染色镜检（100X）
3.2分离菌株16SrRNA的扩增结果
图316SrRNA基因PCR结果
M:DNAMarkerDL2000;1:阴性对照;2-5:PCR扩增产物
3.316SrRNA的核苷酸同源性比对及遗传进化分析
利用DNAStar软件对菌株GZLC2021与GenBank已发表的国内外代表菌株，选择8株大肠杆菌核苷酸的核苷酸序列进行同源性分析，菌株GZLC2021的16SrRNA基因序列与菌株CP040456与CP048647株的同源性最高，均为99.8%，与MK156322菌株同源性最低，为98.5%。
将测序所得的16SrRNA基因序列与在Genbank中所下载的8株大肠杆菌的16SrRNA基因序列利用生物信息学分析软件Mega6.0软件构建其遗传进化树（见图4）。包括美国分离菌株CP054236、德国分离菌株CP048647、法国分离菌株KM108493、土耳其分离菌株MK156322、巴基斯坦分离菌株MK734042、印度分离菌株FR715025、尼日利亚分离菌株MK606100、中国2个分离菌株CP040456与JQ907530，结果表明:GZLC2021菌均与MK734042、CP048647与CP040456在同一小分支，遗传关系最近，而与菌株FR715025、MK606100、KM108493与JQ907530可聚在同一较大分支，遗传关系较近，与MK156322遗传关系较远。从核苷酸序列的系统进化树上来看，与尿道致病性大肠杆菌CP040456位于同一个的遗传分枝上，亲缘关系近，故本分离菌株为尿道致病性大肠杆菌。
图4分离菌株与参考毒株核苷酸序列同源性比较
图5大肠杆菌16SrRNA基因系统进化树
3.4药敏试验结果
对分离的大肠杆菌运用临床常用的22种抗菌类药物进行药物敏感性试验，由表1可知，该分离菌株对选取的22种抗生素中有9种已产生耐药，其中包括常用的第3代头孢噻呋、头孢维星及沙星类包括恩诺沙星、马波沙星、左氧氟沙星等9种药物均耐药，该菌株大多数头孢类药物、美罗培南及阿奇霉素等12种药物均敏感，对氨苄西林中介。
4、讨论与分析
大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌引起的细菌性人兽共患病，UPEC是尿路感染中最常见的感染源之一，在人与动物之间存在交叉感染的可能性，具有很大的危险性。UPEC通常会携带一些毒力因子，以保证其在尿路上的粘附和感染，如I型菌毛、P菌毛等。绝大多数的肠外致病性大肠杆菌均携带有I型菌毛基因fimH，I型菌毛是肠外大肠杆菌进行粘附的重要毒力基因，通常致膀胱炎的大肠杆菌有关；而P菌毛常见于致肾盂肾炎的大肠杆菌；尿路感染是病原微生物在尿路中生长繁殖并入侵泌尿道黏膜或组织而引起的炎性反应。最新的流行病学调查发现，全世界每年约有1.5亿人次因各种尿路感染问题就医或住院。尿路感染具有易复发的特点，多见于女性，严重影响患者生活质量。本研究UPEC分离菌株来自于母猫，在江苏地区UPEC感染，在性别上存在一定差异，多发于母猫，对UPEC的防治得重视。
随着抗生素的不断使用和滥用，导致大肠杆菌出现严重的耐药性。本研究分离株对常用的第3代头孢噻呋、头孢维星及喹诺酮类等均耐药也产生完全耐药，均没有抑菌圈出现，因此需要调整优化抗菌谱，这一结果与刘晓强的研究结果基本一致。在抗生素药物的选择上，本研究菌株林可霉素类、磺胺+甲氧苄啶、阿莫西林等也产生耐药，而该菌株对大多数头孢类药物、美罗培南及阿奇霉素等抗生素治疗效果好。目前关于猫源UPEC的研究多集中在耐药机制与致病机理上，本研究仅仅做了菌株的分离鉴定与药物敏感性分析，对于菌株分子水平的探讨还有待进一步研究。
本研究在菌株分子生物学鉴定中，采用16SrRNA基因检测，在细菌的鉴定中得到广泛的应用，16SrRNA基因的序列保守区和多变区间隔排列，具有高度的保守性，它具有5~10个16SrRNA拷贝，使PCR检测具有较高的敏感性，在核苷酸序列、高级结构与生物功能等方面都表现出高度的保守性，正是这种高度进化与保守的二重性，使其成为目前细菌分类和鉴定研究中非常有用的分子标记。笔者参考GenBank中发表的尿道致病性大肠杆菌的16SrRNA的核苷酸序列设计引物，扩增测序后的序列，在NCBI进行Blast分析，结果表明
分离菌株GZLC2021的16SrRNA基因序列与人的尿液分离菌株CP040456与CP048647株的同源性最高，均为99.8%。在细菌形态学、染色镜检的基础之上，又对菌株16SrRNA基因进行验证，从而达到鉴别诊断的目的，本研究对1株尿道致病性大肠杆菌进行分离鉴定，同时进行药敏试验，为尿道致病性大肠杆菌病的治疗用药及科学防控奠定了良好的基础。
参考文献略
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