1.通过蛋白质组学，cAMP/PKA/CREB通路可能改善突触可塑性；
2.补阳还五汤可以改善MCAO大鼠神经元的突触可塑性；
3.补阳还五汤含药血清可改善（OGD/R）SH-SY5Y损伤。
论文ID
原名：BuyanghuanwudecoctionimprovessynapticplasticityofischemicstrokebyregulatingthecAMP/PKA/CREBpathway
译名：补阳还五汤通过调节cAMP/PKA/CREB通路改善缺血性脑卒中突触可塑性
期刊：JournalofEthnopharmacology
IF：4.8
通讯作者：王利胜&邝惠珍&刘仔
通讯作者单位：广州中医药大学&东莞市中医院
实验设计
结果
1.蛋白质组学分析
表1HPLC条件
表2梯度洗脱程序
表3液相条件
表4Q-exacting质谱仪条件
3.生物信息学分析
GO富集结果如图2A-B所示。与假手术组相比，生物学过程表明，模型组的DEPs主要参与突触中的囊泡介导的运输、突触囊泡循环和突触组织。细胞成分涉及突触后膜、谷氨酸突触、突触后致密区等。分子功能涉及肌动蛋白结合、钙调素结合、蛋白激酶结合等。经补阳还五汤治疗后，MCAO大鼠脑组织中差异蛋白的功能涉及生物过程，包括化学突触传递的调节、突触可塑性的调节和突触信号传递。细胞成分涉及谷氨酸突触、突触后致密区、树突棘等。分子功能主要包括突触后致密区的结构成分、突触结构成分、PDZ结构域结合等。
图2生物信息学分析。（A-B）GO富集分析显示模型组与假手术组和补阳还五汤组与模型组的差异表达；（C-D）KEGG富集分析显示模型组与假手术组和补阳还五汤组与模型组的差异表达。
图3cAMP信号通路图和DEPs
cAMP信号通路在中枢神经系统内的突触可塑性中起着关键作用。PKA-CREB是NMDAR和Psd95表达和激活的关键上游调节因子，p-CREB调节BDNF以保护神经元功能，改善突触可塑性，并确保突触后NMDAR和AMPAR的正常运作。当中风发生时，cAMP表达的减少会导致PKA、CREB和BDNF通路中重要蛋白质的合成减少，从而导致海马神经元的损伤，这可能进一步导致突触损失和LTP的异常诱导。此外，谷氨酸（Glu）是中枢神经系统中一种重要的兴奋性神经递质，由于缺血性卒中后氧气供应不平衡和能量代谢紊乱，其在突触前过度释放，与突触后NMDAR结合。这不仅会导致大量Glu的耗竭，还会在兴奋后引发NMDAR的失活，最终导致突触功能障碍。本研究的结果表明，补阳还五汤可能通过多种靶点和信号通路对突触重塑产生影响，包括谷氨酸能突触、钙信号通路、多巴胺能突触和cAMP信号通路。cAMP信号通路参与上述突触通路的调节，反映了其在建模前后以及药物干预前后的重要作用。因此，本研究计划在以后的体内和体外实验中进一步验证蛋白质组学筛选结果，重点研究补阳还五汤基于cAMP/PKA/CREB信号通路改善缺血性卒中后突触可塑性的机制。
4.补阳还五汤减轻大鼠MCAO/R损伤
模型建立后，模型组和补阳还五汤治疗组的大鼠体重均显著降低（P<0.01，图4A）。给药后第三天，与模型组相比，其他组的体重出现了统计学上的显著增加。（P<0.05）。与模型组第一天相比，第七天的体重也略有增加，没有统计学差异。实验结果表明，补阳还五汤能有效提高MCAO大鼠的体重，促进身体恢复。
图4补阳还五汤增强MCAO大鼠的神经功能。（A）补阳还五汤对MCAO大鼠体重变化的影响（n=13）。（B–C）TTC染色和MCAO后梗死体积分析（n=3）。（D）HE染色（n=3，比例尺=100μm）。受损的神经细胞由红色箭头突出显示。*P<0.05，**P<0.01。
5.补阳还五汤能有效减少脑梗死体积
TTC染色用于评估脑损伤的严重程度（图4B-C）。正常大鼠脑组织被染成红色，而缺血再灌注的梗死区被染成白色。模型组脑梗死体积明显增加（P<0.05）。经补阳还五汤（10g/kg和20g/kg）处理后，脑梗死体积显著减少。结果表明，补阳还五汤可显著减少MCAO大鼠的脑梗死体积。
6.补阳还五汤改善缺血引起的病理变化
我们使用HE染色评估组织形态变化（图4D）。各组脑组织结果表明，假手术组皮质和海马神经元形态正常，胞质丰富，核清晰，排列有序。与其他组相比，模型组缺血皮质和海马表现出不同程度的坏死，具体表现为脑基质疏松、水肿和血管周围空间增加，尤其是在皮质和海马的CA1区，组织损伤更为严重。此外，缺血皮层和海马体中大量神经元丢失，大部分剩余神经元表现出细胞质萎缩和核萎缩。一些神经元随意聚集在一起，破裂并肿胀。补阳还五汤治疗后，缺血皮质和海马中一些神经元的病理状态有所改善。细胞空间变窄，固缩细胞数量减少。补阳还五汤（10g/kg和20g/kg）干预后，皮质和海马的神经元结构显著增强。细胞边界和细胞核更清晰，完整细胞和健康细胞的数量大幅增加。脑组织损伤减轻，进一步表明补阳还五汤能有效减轻缺血再灌注引起的脑损伤。
7.补阳还五汤减轻突触变化和神经元损伤
透射电子显微镜用于观察皮质（图5A）和海马（图5D）突触的超微结构。在假手术组中，皮质区的神经元细胞核呈椭圆形轮廓，形态规则，核膜完整。我们观察到更多的突触，它们显示出不同的轮廓和完整的结构，与海马区相似。相比之下，MCAO大鼠的大脑表现出严重的神经元损伤，包括细胞体肿胀和聚集、细胞膜收缩和变形以及核膜不完整。突触数量显著减少，许多突触结构溶解，突触轮廓变得模糊。给药后，受损的突触显示出显著的改善，神经元细胞损伤减少，线粒体数量增加。细胞核和小泡清晰可见，突触结构相对完整，突触数量显著增加。突触后致密区的厚度显著增加，而突触接触的曲率明显增加（图5B-C）。各组大鼠海马区突触的超微结构与皮质区相似。补阳还五汤显著改善了海马区突触的损伤，突触后致密区的厚度和突触界面的曲率显著增加（图5E-F）。
图5补阳还五汤改善了大鼠皮质和海马区突触的超微结构（n=3）。（A）皮质区突触的超微结构（比例尺=2μm）。（B）皮质区突触后致密区的厚度。（C）皮质区突触界面的曲率。（D）海马区突触的超微结构（比例尺=2μm）。（E）海马区突触后致密区的厚度。（F）海马区突触界面的曲率。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。
8.补阳还五汤能有效改善树突和树突棘的形态变化
Golgi染色法用于评估细胞体、树突和树突棘的形态变化（图6A-D）。从结果可以看出，20-60μm交点处的分布最高，然后逐渐减小。从分布图中还可以看出，高剂量组的趋势与假手术组非常相似。与其他组相比，模型组在每个距离的交叉值最低，表明补阳还五汤可以改善树突的形态（图6E-F）。Golgi-Cox染色显示，脑缺血再灌注后，顶端和基底树突之间的交叉点总数显著减少（图6G-H）。补阳还五汤（10g/kg和20g/kg）干预后，顶端和基底树突交叉的数量显著增加（P<0.05）。此外，我们测量了V层神经元顶端和基底树突分支的总长度（图6I-J）。在模型组中，脑缺血再灌注后，顶端和基底树突分支的总长度显著缩短。然而，补阳还五汤治疗组顶端和基底树突分支的总长度显著增加（P<0.05）。
同时，我们对每组前额叶皮层的第五层锥体神经元进行了研究。在假手术组中，前额叶Ⅴ层锥体神经元的顶部和底部有许多树突棘（图6K）。模型组树突棘少，密度显著降低（P<0.01）。与模型组相比，补阳还五汤低、中剂量组前额叶皮层Ⅴ层锥体神经元的顶端树突棘密度增加，基底树突棘密度没有显著变化。然而，大剂量补阳还五汤给药后，大鼠额叶皮层锥体神经元顶部和底部的树突棘密度显著增加（P<0.01）。此外，神经元顶端和基底部分的成熟和未成熟树突棘密度显著增加（图6L-P）。
9.补阳还五汤可减少神经元凋亡
TUNEL法用于检测神经元凋亡（图7）。TUNEL阳性信号显示为红色。假手术组TUNEL阳性细胞数量减少，只有少数细胞凋亡。模型组TUNEL阳性细胞显著增加（P<0.05），但补阳还五汤治疗组TUNEL阳性神经元明显减少（P<0.05），尤其是10g/kg和20g/kg的BYHWD。
图7补阳还五汤可减少大鼠缺血再灌注后脑神经元的凋亡（n=3）。（A）TUNEL染色结果（比例尺=100μm）。（B）TUNEL阳性细胞的定量百分比。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。
10.不同浓度空白血清和补阳还五汤含药血清对SH-SY5Y细胞的影响
研究结果显示，正常对照组（10%FBS）和空白血清对照组的OD值相当，表明空白血清的作用与10%FBS相当，促进SH-SY5Y细胞的生长（图8A）。由于25%空白血清的OD值与10%空白血清相比略有降低，因此选择10%空白血清的浓度进行后续实验。与OGD/R模型组的空白血清相比，血清浓度为5%、10%和25%的补阳还五汤可以显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率，其中10%的效果最好。为了保证测试结果的可信度，后续实验中使用的含药物血清的最终浓度选择为10%。
11.含补阳还五汤的血清可以提高（OGD/R）SH-SY5Y细胞的存活率
使用显微镜检查细胞形态，并使用CCK-8试剂盒评估细胞存活率（图8B-C）。模型组细胞存活率和细胞密度显著降低（P<0.01）。H89组可降低细胞存活率（P<0.05）。经5%补阳还五汤血清组和10%补阳还五汤血清+H89组处理后，细胞形态和细胞存活率略有改善（P>0.05）。含10%补阳还五汤血清组、福司柯林组和含10%补阴还五汤+福司柯林组合显著提高了细胞存活率，改善了细胞形态，并逐渐从皱纹变为纺锤形。细胞密度也显著增加。
12.含补阳还五汤的血清对（OGD/R）SH-SY5Y细胞具有一定的抗凋亡作用
在凋亡试剂盒中，绿色荧光表示细胞处于枯萎的早期阶段，而红色荧光表示细胞在枯萎或坏死的晚期阶段。模型组中具有红色和绿色荧光的细胞数量显著增加，表明总凋亡率增加。与模型组相比，含5%BYHWD血清的总凋亡率变化不大，而含10%BYHWD的血清的总细胞凋亡率显著降低，表明凋亡率随着含药物血清剂量的增加而降低，具有一定的浓度依赖性。H89组也增加了细胞凋亡率。此外，含10%补阳还五汤+H89组、福司柯林组和含10%补阳还五汤+福司柯林处理组均能显著降低刺激后的细胞凋亡率。结果表明，含补阳还五汤的血清对（OGD/R）SH-SY5Y细胞具有一定的抗凋亡作用（图8D）。
图8含补阳还五汤血清对SH-SY5Y细胞存活率的影响。（A）不同浓度的空白血清和药物血清对OGD/R细胞的影响（n=6，#P<0.05，##P<0.01，与对照组相比有显著性差异。与OGD/R模型（10%FBS）组相比，◇P<0.05，◇◇P<0.01具有显著性差异。与5%空白血清OGD/R组相比，△P<0.05、△△P<0.01具有显著性差异。与10%空白血清OGD/R组相比，*P<0.05、**P<0.01具有显著性差异。与25%空白血清OGD/R组相比，○P<0.05、○○P<0.01）。（B）不同组别的细胞存活率（n=6，#P<0.05，##P<0.01与对照组相比有显著性差异。*P<0.05、**P<0.01与模型组相比有显著性差异）。（C）药物处理后不同组细胞的形态学图像（n=6，比例尺=100μm）。（D）含补阳还五汤血清对SH-SY5Y细胞凋亡的影响（n=3）。白色箭头突出了凋亡的晚期。
图9含补阳还五汤血清对SH-SY5Y细胞蛋白质含量的影响（n=3）。（A）荧光显微镜图像（比例尺=50μm）。（B）每组的Psd95、Syn1和Syt1的荧光强度值。与对照组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。
14.补阳还五汤可以影响cAMP/PKA/CREB通路上的mRNA水平
MCAO/R大鼠皮质（图10A-B）和海马（图11A-B）中Bcl-2、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1和BDNF的相对mRNA表达显著降低。补阳还五汤处理后，各给药组皮质和海马中的mRNA表达均有所增加。OGD/R模型组的结果也非常相似（图12A-B），Bcl-2、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF和Creb1mRNA的相对表达水平显著降低，而BaxmRNA的相对表示水平升高。给药后，各给药组Psd95、Shank2、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2和Creb1的mRNA表达增加，而BaxmRNA的相对表达降低。H89组Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2和Creb1mRNA的表达受到一定程度的抑制。在给予含10%补阳还五汤的血清组、福司柯林组、含10%补阴还五汤血清+福司柯林的组后，各给药组中Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2、Bcl-2/Bax和Creb1的mRNA表达均显著升高。用于RT-qPCR的引物序列如表5所示。
图10补阳还五汤对皮质区脑损伤的影响被逆转。（A–B）使用RT-qPCR分析大鼠皮质区Prkacb、Syt1、BDNF、Creb1、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Psd95、Shank2和Syn1的mRNA表达（n=3）。（C–E）代表性免疫印迹图像和cAMP、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Bcl-2、Syt1、BDNF、p-Creb1、Creb1和Bax的定量（n=3）。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。
图11补阳还五汤对海马区脑损伤的影响被逆转。（A-B）采用RT-qPCR分析法测定大鼠海马中Prkacb、Syt1、BDNF、Creb1、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Psd95、Shank2和Syn1的mRNA水平（n=3）。（C–E）代表性免疫印迹图像和cAMP、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、Bcl-2、BDNF、p-Creb1、Creb1和Bax的定量（n=3）。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。
表5用于RT-qPCR的引物序列
15.补阳还五汤激活缺血性脑组织cAMP/PKA/CREB通路
MCAO/R大鼠皮质和海马中cAMP、Psd95、Shank2、Bcl-2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF和p-Creb1的表达水平显著降低（p<0.05），而Bax的表达水平则显著升高（图10C-E、图11C-E）。与模型组相比，补阳还五汤给药大鼠皮质和海马中的蛋白质表达呈相反趋势（P<0.05），特别是在高剂量补阳还五汤组（P<0.01）。在OGD/R细胞模型中观察到类似的效果，模型组cAMP、Bcl-2、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF和p-Creb1的表达水平降低，而Bax的表达水平升高（P<0.05，见图12C-E）。含5%BYHWD血清组和含10%BYHWD+H89血清组给药后，cAMP、Psd95、Syt1、Bcl-2、Prkacb、BDNF、p-Creb1和Bcl-2/Bax的表达增加。H89组给药后对Prkacb有一定的抑制作用。含10%补阳还五汤血清组、福司柯林组、含10%补阳还五汤+福司柯林处理组给药后，各组cAMP、Psd95、Bcl-2、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2/Bax和p-Creb1的相对表达水平呈上升趋势（p<0.05）。
图12含补阳还五汤的血清可以逆转SH-SY5Y细胞中Prkacb、Syt1、BDNF、Creb1/p-Creb1、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Psd95、Shank2、cAMP和Syn1的mRNA和蛋白质表达。（A–B）mRNA表达（n=6）。（C–E）代表性免疫印迹图像和定量（n=3）。与对照组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。
与模型组相比，中、高剂量补阳还五汤组在连续给药7天后显著降低了MCAO大鼠的神经功能评分和梗死体积，同时增加了MCAO鼠的体重。结果表明，补阳还五汤改善了中风后的神经功能缺损，促进了身体的恢复。结果与之前的研究一致。中风后脑氧供应不足可能会引发一系列不可避免的事件，如兴奋毒性、细胞凋亡和炎症反应。HE结果表明，补阳还五汤中剂量组和高剂量组在组织病理变化方面表现出更明显的改善，炎症减少。此外，TUNEL检测结果表明，补阳还五汤可以缓解脑缺血再灌注损伤期间的细胞凋亡，其中高剂量组的效果最为显著。细胞实验结果还表明，含补阳还五汤的血清有效地改善了OGD/R细胞的形态，降低了其凋亡率。
不同类型的树突棘具有不同的功能和作用。树突棘的形成或增大表明突触连接增强，而树突棘的收缩或消失表明突触连接减弱。成熟的树突棘（蘑菇形，短粗）在神经突触的发育、成熟、稳定性和突触连接中起着至关重要的作用，而未成熟的树突棘（薄，丝状）有助于增加将发育中的轴突与靶树突连接的可能性。本研究结果表明，与模型组相比，补阳还五汤中、高剂量组显著增加了V层锥体神经元顶端和基端成熟和未成熟树突棘的密度，表明补阳还五汤促进突触发生和发育，增加树突复杂性，改善突触可塑性，从而减轻缺血再灌注引起的神经元损伤。
结论
通过动物和细胞实验，结果表明，补阳还五汤及其含药血清激活了cAMP/PKA/CREB信号通路，增加了MCAO大鼠脑组织或OGD/R细胞中cAMP、PKA、p-Creb1蛋白的表达水平，随后调节了BDNF、Syt1、Syn1和Psd95等下游蛋白的表达，改善了细胞突触可塑性，减轻了细胞凋亡。