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蛋白质被认为是生物细胞组织的重要组成部分。食物中的蛋白质是人体唯一的氮源，具有糖、脂肪不可替代的作用。氮含量是区分蛋白质与其他有机化合物的重要指标。检测食品中的蛋白质时，通常先测定食品中的总氮含量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法于1883年首次提出，至今仍被用作标准测试方法。凯氏定氮法分为样品消解、蒸馏、吸收和滴定过程。
原则
样品消解
浓硫酸具有脱水和氧化性能，能将有机物中的碳、氢氧化成二氧化碳和水。蛋白质会分解成氨，然后氨和硫酸结合形成硫酸铵。通常添加硫酸钾和硫酸铜作为催化剂以加速蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点。一般纯硫酸的沸点在340℃左右，但加入硫酸钾后，可升至400℃以上。升高温度会加速有机物的分解。但硫酸钾不能添加过多，否则生成的硫酸铵会因温度过高而热分解成氨，造成损失。硫酸铜除了充当催化剂之外，还可以指示消化终点的到来。当所有有机物完全消化后，溶液将呈现清澈的蓝绿色。硫酸铜还可用作蒸馏过程中碱性反应的指示剂。
蒸馏
消化液中的硫酸铵在碱性环境下转化为氨。为了防止水中微量氨受热时逸出影响测量结果，蒸汽发生器内的水必须保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐。它需要足够的碱溶液才能完全反应并释放出结合的氨。此过程中必须有过量的氢氧化钠。过量的氢氧化钠会与硫酸铜反应生成蓝色。氢氧化铜沉淀，氢氧化铜受热分解成黑色氧化铜沉淀。检查蒸馏是否完全，可以用纳氏试纸法。NH4+或NH3与纳斯勒试剂反应生成棕红色碘化汞铵化合物。
吸收
加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收。硼酸具有吸收氨的作用，且由于呈弱酸性，因此不影响下次滴定时指示剂的变色反应。温度过高，硼酸吸收液的氨吸收效果会减弱，造成损失，所以一般不超过40℃。
滴定
吸收完全后，用硫酸或盐酸标准溶液进行酸碱滴定。滴定剂的浓度直接影响结果的准确性，必须按要求配制和校准。混合指示剂在中性溶液中呈灰色，滴定终点液体呈灰色。
防范措施
①所用试剂溶液应采用无氨蒸馏水配制；
②取样应具有代表性，取样前样品应充分混合；
③称量样品放入凯氏烧瓶时，不要让样品粘附在瓶颈上，以免样品消解不完全造成氮气损失；
④为保证烧瓶壁上的残渣完全消解，消解过程中应不时旋转凯氏烧瓶；
⑤消解脂肪或糖含量高的样品时，容易产生大量泡沫。为防止泡沫溢出，应将消解液持续加热并摇匀，或加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂；
⑥当样品消解液浑浊或不澄清透明时，可先将凯氏烧瓶冷却至室温，然后加入30%过氧化氢，然后继续加热消解；
⑦加碱后，漏斗必须水封，防止装置内漏气导致氨逸出，影响结果的准确性；
⑧确保蒸馏装置不泄漏；
⑨蒸馏时，反应室与外界存在压差，蒸汽可将氨带出。因此，蒸馏时要保证蒸汽均匀、充足，中途不能停止加热，防止反吸；
⑩蒸馏前，如果加碱后消化液变蓝色，且没有形成氢氧化铜沉淀，则说明加碱量不足，需要添加适量的碱；为防止蒸馏时蒸汽发生器内的液体沸腾，可加入几粒碎瓷片或大玻璃珠，玻璃珠的直径最好大于联通玻璃管的直径，以防止玻璃珠进入玻璃管，影响蒸汽均匀、充足的输出；冷凝管下端应插入硼酸吸收液面以下，以防止氨逸出。蒸馏完成后，先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟，清洗管口，然后取出吸收瓶，最后关闭热源，否则可能会出现反吸发生。
经常问的问题
1、凯氏定氮仪在蒸馏过程中剧烈滚动。会对操作者造成危险吗？
答：一般不会。凯氏定氮分析仪在蒸馏过程中剧烈翻滚。这是由于大量水蒸气进入消化管，液体翻滚所致。它不是由剧烈反应引起的。而且仪器具有超压保护装置，可以保持管道内压力正常，避免发生危险。。
2、凯氏定氮仪运行对水质有什么要求？
答：凯氏定氮仪的蒸馏水桶应装满蒸馏水或纯净水。机器长期不用时，不应将蒸馏器内的水排掉。
3、为什么凯氏定氮仪开机时没有声音？
答：凯氏定氮仪开机时没有声音。如果机器电源开关中的红灯亮起，则表明定氮仪中的保险丝已烧断。保险丝位于机器内部靠近电源开关接口5厘米处的黑色外壳内。
4、凯氏定氮仪开机后蒸馏器不加水的问题如何解决？
答：开机半分钟后，检查蒸馏水桶是否漏水。若能充满空气则属正常；检查蒸馏水桶内的水位是否超过三分之一且不够；检查蒸馏水桶的位置，低于放置仪器的台面。压力不够，无法加水；检查蒸馏水桶的进气管和进液管是否连接错误。如果连接不正确，桶内会产生气泡和声音；检查排水阀，应将其关闭。
5、凯氏定氮蒸锅不加热，不能产生蒸汽。为什么？
答：如果机器能正常加碱，但无法加热出蒸汽，则确定电热丝可能烧坏。可以用万用表测量电热丝的正负极。如果没有连接，则说明电热丝损坏，需要更换新的。
若机器不能正常加碱且开机后无声音，则判断保险丝熔断。保险丝位于机器内部靠近电源开关接口5厘米处的黑色外壳内。
6、凯氏定氮仪工作时声音较大。这是正常的吗？
答：这是正常现象。这是机器内部气泵工作的声音。
7、凯氏定氮仪工作时，不能加碱，加碱时没有声音。为什么？
8、定氮仪工作时，顶部冒出烟状气体。这是怎么回事？
答：检查冷却水进水水龙头是否打开。如果冷却水关闭或水量小，消化管出来的蒸汽就不能凝结。从机器中排出的水蒸气看起来像烟雾。
9、使用定氮仪时，发现消化管充满水。如何解决问题？
答：定氮仪在使用时，消化管内充满水。这是由于机控水位计电导率降低造成的。解决方法：打开水位计，取出探头，用砂纸打磨，去除氧化层；将3-加入蒸馏水桶中。5克实验室氯化钠，摇匀溶解。
10、使用定氮仪时，蒸馏器和水位计注满水，硼酸吸收液容器注满水。如何解决问题？
答：是机控水位计电导率降低造成的。解决方法：打开水位计，取出探头，用砂纸打磨，去除氧化层；将3-5克实验室氯化钠加入蒸馏水桶中，摇匀溶解。
11、定氮仪使用时，将消化管内的白色管子吸回。怎么解决呢？
答：如果仪器停止工作（蒸馏器停止加热），气阀未能及时关闭，就会出现反吸现象。你可以在白色管子上戳一些小孔。气阀损坏无法关闭，也会回吸。
12、定氮仪在运行过程中每隔3-5秒会发出一次声音。这是正常的吗？
答：这种声音属于正常现象。仪器工作时，蒸馏器会不断加热，产生水蒸气，消耗水。仪器会自动打开水阀补充水。该声音是水阀开启和关闭的声音，属于正常现象。
笔记：
1、每次使用仪器前，应将仪器煮沸一次，并清洗仪器内部管道。
2、仪器使用完毕后，应打开其中一个桶盖，将桶内气体排出，以延长配件的使用寿命（3个或2个桶串联，使用时只能打开一个桶盖）筋疲力尽）。
结论：凯氏定氮法经典、准确，适用于食品中蛋白质的测定。但由于样品中普遍含有一些非蛋白质含氮化合物，因此凯氏定氮结果就是样品中的粗蛋白质含量。然而，该方法实际上并不测量蛋白质含量，而是通过测量氮含量来估算样品中的蛋白质含量。消解操作的条件是凯氏定氮法产生误差的主要原因，因此必须特别注意。在实际生产实验中，每一步都应严格按照标准进行。本文是作者日常工作实验的总结，希望对实验者有一定的帮助。