作者|万权松单位|泸州市中医医院医学检验科2021年8月3日
临床生化工作中，要做好质量控制，校准无疑是不可缺少的一部分，那么关于校准，你是否都清楚呢？
事件经过
早秋到，检验科迎来新的一批实习同学，一张张稚嫩的脸庞下，藏匿着他们对知识的渴望。
半月后，基本熟悉生化组流程的同学，对知识渴望不由得从腼腆变得大胆起来，于是就有了以下整理的对话：
问题一
Q
老师老师，校准是什么？为什么要校准？
A
生化仪的测定原理是基于朗伯比尔定律，对患者标本+试剂的反应进行检测，仪器只会得到一个吸光度，而我们所需要的是物质的浓度等，因此需要将吸光度换算成浓度才具有临床意义。那么就需要将仪器所检测到的吸光度与物质的浓度建立一定的关系。
校准的过程就是用生化仪去检测已知一定浓度的校准品，得到对应的吸光度，将吸光度与已知浓度的校准品的浓度进行曲线拟合，得到物质浓度和吸光度之间的关系曲线即校准曲线，那么我们将生化仪检测到的患者标本+对应试剂反应的吸光度带入校准曲线中，就可以得到患者标本相应物质的浓度了。
简单的说，就比如去市场买西瓜，卖瓜的告诉你，这个瓜是10斤，那我说是20斤，那么怎么判定是10斤而不是20斤的呢，这就是需要对1斤进行定义，把一定的重量定义为1斤，那么称重的时候是10倍，显然得出的是10斤而不是20斤了。
如果不校准，仪器检测仅有吸光度，这个吸光度没办法换算为浓度，也就没办法得到患者标本的结果了。
问题二
为什么有时候看到老师拿一个校准品去校准，有时候需要拿好几个呢？
这是因为不同的项目，试剂厂家制定了不同的校准类型，目前科室中主要采取的有两点校准和多点校准；两点校准一般是以水为零点，校准品为另外一个点，以直线Y=aX+b建立标准曲线；多点校准的就需要拿好几个校准品，科室两台生化仪器主要采用的是样条函数法（spline）和对数曲线（Logit-Log4P、Logit-Log5P）。
问题三
为什么有些项目校准比较频繁，有些项目都没见过校准呢？
目前科室的尿素、乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶等项目相对稳定性较差，血清总蛋白、电解质钾钠氯等，由于正常情况下在体内波动相对较小，加上国家标准（GB/T20470-2006）（血清总蛋白允许TEa≤5，血清钾≤6%，钠、氯≤4%）相对较严苛，为了保证质量，更好的满足于临床需求，因此需加强校准；而像胱抑素C、谷氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶等项目稳定性较好，在质控稳定以及试剂批号未更换的情况下会延长校准的周期。
问题四
我看到老师在校准的时候，一台生化仪器校准品中总蛋白值为84.25，另外一台生化仪器上则为83.17，明明是同一个校准品，为什么值不一样呢？
你是想表达的是明明是同一个校准品，那么校准品里面的总蛋白等浓度应该是一样的对吧
这点要注意，我们用的校准品上总蛋白的标示值并不是总蛋白的真实浓度，同一个校准品那么总蛋白的浓度那肯定是一样的，但是校准品只是用于校正系统的，是用于修正不同厂商对仪器参数设置的不同和不同试剂制造商试剂组分的区别的。我们临床实验室的最终目的是要让患者的结果在不同检测系统（仪器和试剂的组合）上具有可比性，故而校准品的值就可能因不同仪器与试剂组合的不同而不同。
问题五
既然这样，那么校准品的标示值是怎么来的呢？
这个问题对于你们可能有点复杂，一般项目结果溯源最好是溯源到参考方法甚至决定性方法。例如：为某试剂商的校准品中葡萄糖赋值，如果直接用参考方法检测校准品中葡萄糖的浓度，得到的会是该校准品中葡萄糖的真实浓度，但若是用此结果直接校准临床实验室的检测系统后得到的患者标本结果将可能是不可靠的，因为校准品毕竟是试剂商制造，与实际临床标本是有很大差异的，我们最终是服务于临床患者标本，两者之间可能会因基质效应的存在，导致校准后所测患者标本结果不可靠，而用参考方法检测该校准品中葡萄糖的值可以作为初始赋值。接下来就是重点了：
但是由于校准品与临床患者标本基质的区别，加上在国内市场上仪器与试剂的搭配组合各异，往往结果是不可接受的，那么就需要根据回归曲线调整校准品的值，直至可接受为止，因此当使用不同组合的检测系统，校准品需根据相应的系统进行赋值，这也就解释了为什么同一个校准品在不同的检测系统中的标示值不一样了。当然，如果被赋值校准品的基质与临床标本差异较大，那么有可能是无法调整的。
问题六
校准品需要加去离子水配制，质控品从冷冻冰箱拿出来复融就可以用，为什么校准品不能像质控品一样用液体的呢？这样就不用担心老师让我配制校准品的时候担心配制不准确了。
冷冻干燥能极大的延长校准品的有效期，方便储存和运输并且校准品要求基质与临床患者标本尽可能的相似，因此在制作中添加物质不能过多，添加的稳定剂成分越多，那么导致的基质效应可能会越明显。质控品要求较高的稳定性，需添加较多的稳定性以保证质控品成分的稳定，因此质控品可以采用液体也能有较长的有效期，当然质控品采用干粉储存效期一般会更长。两者对于临床实验室的作用不一样，就用不同的方式运输储存了。
问题七
完了，那校准品都需要配制，配制的不好怎么办？
也不是所有的校准品都是需要配制的，有些项目在液体状态下有较好稳定性，像胱抑素C、超敏C-反应蛋白等，试剂厂家会直接包装为液体校准品使用的，一般我们需要配制的主要是复合校准品、载脂蛋白AI、载脂蛋白B等，在配制前，先仔细阅读校准品的使用说明书，了解配制、混匀的注意事项，然后按照说明书的要求吸取需要的去离子水的量进行配制，可以使用A级以上的移液管吸样，也可采用定期校准的具有较高精度的加样枪进行配制，目前好的加样枪最大吸液量程处误差可在0.6%以下，相比用移液管配制误差还更小。
但是既是人为，那么误差就不好估计，那么怎么来评估存在的误差呢？当按要求配制好校准品，照说明书要求混匀后，在检测系统稳定的情况下，可把校准品当标本反测，用于估计配制所产生的误差大小。这样即使配制过程存在一定的误差，我们也可以在校准品不确定度允许的范围内修正校准品的标示值。
问题八
老师，说到不确定度，我看到校准品说明书标示值的后面有一栏写的不确定度（K=2），K=2是什么意思啊？
K=2，实际上代表的是取2标准差约95%的可信程度，因为在给校准品赋值的过程中，可能会经过很多次的调整，而检测系统会存在一个固有误差，可能因加样、温度环境变化而导致，这个误差可以通过多次检测大致确定一个范围，一般临床上大多采用95%的置信区间。
问题九
老师老师，那我校准之后，我怎么知道我校准的结果是好的呢？
仪器开始校准前，确保校准品的标示值以及校准品所放置的位置正确，将校准品加入生化专用杯时要避免气泡的产生，查看需要校准项目的校准因子即K值并记录（一定要记录，科室每次校准的K值都会记录保存，便于查看总结），仪器校准结果出来后，查看校准的曲线和校准数据，一般生化仪器的校准在每个浓度水平都会进行两次吸样,要注意观察两次吸样校准之间吸光度的差异，一般仪器状态良好，校准品未变质的情况下，每个浓度点上对应的两次吸光度的结果应是差异不大的，即校准曲线图上同一个浓度上的两个吸光度的点基本上是很接近的。
对于两点校准来说，如果校准的试剂批号未更换，那么校准前后K值即斜率差异也是不大的。如果校准前后K值差异较大，那就需要再次核查校准的情况，比如校准品的标示值、放置位置是否正确，放入生化杯的校准液是否存有气泡，仪器状态，水机的水质等情况后再次校准，得到校准后的K值与第一次校准时记录的K值差异不大时，那么说明校准就成功了。
生化的很多常规项目在试剂厂商未进行试剂升级的情况下，一般即使更换新批号试剂K值变化也不会太大，但当发现K值变化较大，而我们又确认校准过程、仪器状态没问题时，我们就需要比对患者样品了，选取5例具有浓度梯度的患者标本（选取患者标本对比的时候还应注意对应项目在患者标本中的稳定性），进行结果的比对（仪器稳定时检测的患者结果与校准后检测的患者结果比对或是有多台仪器时，用另一台仪器稳定时检测患者的结果与校准后检测的患者结果比对），如果比对的结果可接受（最好满足行业标准的1/3TEa内）那么说明校准是成功的。
另外，如血糖等不稳定的项目，还可在校准后用正确度控制品进行校准结果的评价，以确保校准的可靠性。此处最好不用质控去判断校准结果，质控品跟患者标本可能存在较大的基质效应，以质控去判断校准结果会误导操作老师，导致出现错误的患者结果。这是基于目前国内试剂生产商在对试剂进行改良升级，更换新批号试剂时，新批号试剂可能由于改良升级，导致质控出现失控，而患者标本却并未有明显改变的情况。
多点校准可以通过查看校准曲线和校准数据，即校准曲线上同一浓度上两次吸样检测的吸光度的点都很接近甚至重合在一起，校准项目吸光度变化呈递增关系且吸光度变化有一定比例关系，可采用比对患者结果的方式进行校准结果的确认，质控有时候只能代表质控物所在水平点的值可能未发生明显变化，并不能代表整个结果区间患者样品的结果，因此最好校准后选取具有代表性的患者标本结果进行比对，必要时需修正质控品的靶值。综上，基本就可以判断校准是否成功了。
总结
实习同学不可小看，一个个针对专业的灵魂拷问差点没能应付过来，看似天天在接触的东西，也不一定能真正解释清楚，也感谢这些同学让我更深入的去理解校准。
以上是个人对同学校准疑问回复的拙见，烦请大家批评指正！
参考文献
[1]冯仁丰.临床检验质量管理技术基础[M].第二版.上海：上海科学技术文献出版社，2007.
[2]尹一兵，倪培华.临床生物化学检验技术[M].第五版.北京：人民出版社，2016.