本研究采用柴胡不同极性部位对CUMS抑郁大鼠模型进行实验，通过监测行为学指标和分析血清神经递质水平的变化，以筛选出最佳药效部位。通过测定肝功能指标和总胆汁酸（totalbileacid，TBA）水平，表明柴胡低极性部位可发挥肝保护作用，同时调节总胆汁酸水平。采用UPLC-MS/MS拟靶向代谢组学建立测定胆汁酸的方法，能够测定大鼠盲肠内容物胆汁酸种类和相对含量，为临床探究胆汁酸谱的具体变化提供方法，同时对柴胡通过胆汁酸代谢抗抑郁的机制研究提供依据。
1材料
1.1动物
SPF级成年雄性SD大鼠54只，体质量（180±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。动物饲养于清洁环境，温度（23±2）℃，相对湿度（45±10）%，自由进食饮水，12h光照/黑暗周期。动物实验均通过山西大学科学研究伦理审查委员会审查（批准号SXULL2019005）。
1.2药材
柴胡饮片（批号1805215131）购自安国市吉腾达药材有限公司，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为伞形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根或根茎，符合《中国药典》2020年版规定，留样于山西大学中医药现代研究中心。
1.3药品与试剂
1.4仪器
1290II型超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；3200Q-TRAP型三重四极杆串联质谱仪（美国ABSciex公司）；UPLC-QExactiveOrbitrap-MS超高效液相色谱质谱联用仪及Xcalibur工作站；Neofuge13R型高速冷冻离心机（力康公司）；MX-S型可调式混匀仪（美国Scilogex公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；LegendMicro17R型高速低温离心机；PRIME60i型全自动生化仪（美国ThermoFisherScientific公司）；旋转蒸发仪（德国艾卡公司）；DHFSTPRP-24型高通量组织研磨仪（宁波洛尚智能科技有限公司）；大鼠旷场实验测试箱（自制的无顶长方盒，长100cm、宽100cm、高70cm，盒中四壁及底面涂黑，底部白线划分成25个边长20cm的正方形格）。
2方法
2.1柴胡不同部位的提取
称取柴胡饮片适量，用8倍量95%乙醇浸泡12h，回流提取2次，每次2h，合并提取液，滤过，回收溶剂至干，加水分散，混悬液用等体积的石油醚萃取至无色，将上层萃取液回收溶剂至干即得柴胡石油醚低极性部位（出膏率1.6%）；下层混悬液用等体积的醋酸乙酯萃取至无色，将上层萃取液回收溶剂至干，即得柴胡醋酸乙酯中极性部位（出膏率1.98%）。将药渣用8倍量的水回流提取2次，每次2h，合并提取液与醋酸乙酯萃取后的下层混悬液，回收溶剂，得到柴胡水提物高极性部位（出膏率17.8%）。
2.2分组、造模及给药
54只SD大鼠适应性喂养7d后，根据体质量、糖水偏爱率、旷场实验的基线结果，随机分为对照组、模型组、盐酸文拉法辛（35mg/kg）组、柴胡低极性部位（15g/kg）组、柴胡中极性部位（15g/kg）和柴胡高极性部位（15g/kg）组，每组9只。使用课题组前期CUMS模型复制方法[24]，均采用单笼饲养，连续28d，大鼠每日给药后1h给予刺激，且每种刺激的实施随机不连续。刺激包括禁水，禁食24h，夹尾刺激2min，超声刺激3h，束缚3h，50℃热刺激5min，电击刺激（36V、10次），昼夜颠倒12h，4℃游泳5min。对照组大鼠正常饲养，每笼9只，且不给予任何刺激。造模同时各给药组ig相应药物（10mL/kg），对照组和模型组ig等体积溶剂（0.5%羧甲基纤维素钠-0.5%聚山梨酯80水溶液），1次/d，连续28d。
2.3生物样本收集
给药结束后，通过股动脉取血的方式采集血液，置于EP管中，静置30min后4℃、3500r/min离心10min，分离血清并分装；同时收集新鲜的盲肠内容物，放入液氮快速冷冻后储存于80℃冰箱中保存备用。
2.4抑郁症大鼠行为学评价
参照文献报道方法[25]，通过大鼠的体质量变化、糖水偏好实验、旷场实验（水平穿越格数和直立次数）的测定数据，观察大鼠28d内行为学变化。
2.5血清中9种神经递质含量的测定
采用课题组前期建立的LC-MS法[26]，同时测定血清中的色氨酸（tryptophane，Trp）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleaceticacid，5-HIAA）、去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）、多巴胺（dopamine，DA）、乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）、谷氨酸（glutamicacid，Glu）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）9种单胺类神经递质的含量。
2.6生化指标的测定
采用全自动生化分析仪测定γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性和血清总胆红素（serumbilirubin，TBIL）含量。
2.7盲肠内容物TBA水平的测定
按照ELISA试剂盒说明书测定各组大鼠TBA水平。
2.8UPLC-MS测定盲肠内容物胆汁酸谱
2.8.1对照品溶液的制备分别称取8种胆汁酸（CA、DCA、CDCA、HDCA、UDCA、TUDCA、TCDCA、TCA）对照品适量，结合型的水溶性胆汁酸对照品用超纯水溶解，其他胆汁酸对照品以甲醇为溶剂溶解，均配成1.0mmol/L的对照品储备液，置于80℃的超低温冰箱中储藏备用，用于盲肠内容物胆汁酸检测的辅助鉴定。内标18β-GA以甲醇为溶剂，配成1.0mmol/L的对照品储备液备用。
2.8.2样品制备从80℃冰箱取出盲肠内容物样本，于4℃下解冻，精密称定500mg置于5mLEP管，加入含内标的乙腈3mL，涡旋2min，4℃、13000r/min离心15min，取上清，取50μL进样分析。分别取样本10μL混合作为质控样本。取8种胆汁酸对照品均稀释1μmol/L，分别取50μL进样分析。
2.8.3色谱条件WatersAcquityUPLCHSST3色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱：0～2min，2%B；2～3min，2%～35%B；3～17min，35%～70%B；17～18min，70%B；18～29min，70%～98%B；29～31min，98%B；31～33min，98%～2%B。体积流量0.3mL/min；柱温45℃；进样量5μL。
2.8.4质谱条件选择FullScan扫描模式，正、负离子切换同时扫描及Target扫描模式，使用Xcalibur3.0软件对样品进行一级质谱数据采集，仪器参数为ESI源，喷雾电压＋3.0kV；喷雾电压2.7kV；毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气压力3546.38kPa；辅助气压力1013.25kPa；分辨率70000；分辨率（dd-MS2）17500，归一化碰撞能量为12.5、25.0、37.5eV；扫描范围m/z50～1200。
2.9统计学分析
实验数据使用SPSSstatistics16.0、GraphpadPrism7.0、Excel2016等软件处理。结果以表示。针对两组数据间差异性比较采用SPSS16.0软件进行t检验，作图软件为GraphPadPrism7.0。
3结果
3.1柴胡抗抑郁最佳部位筛选
3.1.1柴胡不同极性部位对CUMS大鼠行为学指标的影响如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠的基础生存状态下降，活跃程度及对四周环境的好奇心降低、快感缺失，提示抑郁模型复制成功。在实验开始时，各组大鼠体质量、糖水偏爱率、穿越格数、直立次数均无显著差异。造模21、28d，与对照组比较，模型组大鼠体质量显著降低（P＜0.05、0.001）；与模型组比较，造模28d各给药组大鼠体质量均升高。造模21、28d，与对照组比较，模型组大鼠糖水偏爱率显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠糖水偏爱率显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。造模7、21、28d，与对照组比较，模型组大鼠水平穿越格数显著降低（P＜0.05、0.001）；与模型组比较，造模14d柴胡高极性部位组大鼠水平穿越格数显著升高（P＜0.05），造模28d盐酸文拉法辛组、柴胡低极性部位组和柴胡中极性部位组大鼠水平穿越格数显著升高（P＜0.05、0.01）。造模7、14、21、28d，与对照组比较，模型组大鼠直立次数显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，造模28d各给药组大鼠直立次数均显著升高（P＜0.05、0.01）。
以上结果表明柴胡不同极性部位可提高CUMS模型大鼠的活动能力以及对新奇事物的探索能力，体质量和糖水偏爱率显著回调，但其中柴胡低极性部位效果最好。
3.1.2柴胡不同极性部位对CUMS大鼠血清中神经递质含量的影响如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中Trp、5-HT、GABA、Tyr的含量明显下降（P＜0.05、0.01），5-HIAA、Glu、ACH、DA、NE的含量也有所下降，但差异无统计学意义。与模型组比较，经不同极性部位给药处理后，柴胡中极性部位组的Trp、GABA、Glu、ACH、Tyr、NE水平明显升高（P＜0.01、0.001），DA水平升高但无统计学差异；柴胡高极性部位组的Trp、5-HT、5-HIAA、GABA、ACH、Tyr、DA和NE水平明显升高（P＜0.01、0.001）；盐酸文拉法辛组Trp、GABA、Tyr和NE水平显著升高（P＜0.05、0.01），5-HT水平升高，但差异无统计学意义；柴胡低极性部位组的Trp、5-HT、GABA、Tyr、和NE的水平明显升高（P＜0.01、0.001），DA水平升高，且与对照组相比更接近。
不同极性组分的联合应用可能会对多个靶点的作用起到一定的表征作用，而柴胡低极性部位可能具有最佳的抗抑郁效果。因此，被用于进一步研究。
3.2柴胡低极性部位改善抑郁大鼠肝功能指标
如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中γ-GT活性显著升高（P＜0.05），TBIL含量呈升高趋势，提示模型大鼠的肝功能异常，存在轻微的肝损伤。给予柴胡低极性部位后，大鼠血清中γ-GT活性和TBIL含量均显著降低（P＜0.05），ALP活性有回调趋势，表明柴胡低极性部位可改善抑郁大鼠肝功能。
3.3柴胡低极性部位对CUMS大鼠盲肠内容物TBA水平的影响
如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠盲肠中TBA水平显著降低（P＜0.01），提示抑郁模型胆汁酸代谢存在障碍。给予柴胡低极性部位后，大鼠盲肠中TBA含量显著回调（P＜0.01），表明柴胡低极性部位可以缓解抑郁模型导致的TBA水平紊乱，其发挥抗抑郁作用可能与调节胆汁酸的代谢有关。
3.4胆汁酸谱测定方法建立
3.4.1UPLC-QExactiveOrbitrap-MS仪器系统稳定性监测结果每个质控样本分别提取的36个提取离子的tR的RSD均在0.5%以下，m/z的RSD在4.02×107以内，相对峰面积的RSD均小于16%，表明仪器稳定性较好，建立的UPLC-MS测定的代谢组数据稳定可靠，满足后续代谢组分析的要求。
3.4.2质谱色谱专属性试验在本实验条件下，所有胆汁酸有较大的质谱峰和较好的分离度，经处理的盲肠内容物中其他杂质不干扰样品的分离测定。图5为不同通道下36种胆汁酸加内标液色谱图。
初级的胆汁酸类多为鼠胆酸和异构胆酸编号CA-1～CA-3，脱氧胆酸类未知的为D-1～D-3，石胆酸类未知的编号为L-1，牛磺脱氧胆酸类标号为TD-1，甘氨脱氧胆酸类GD-1，甘氨胆酸类G-1～G-4，共包括8个离子通道的17种非结合型胆汁酸和19种结合型胆汁酸。
3.5盲肠内容物中差异胆汁酸分析
采用拟靶向代谢组的方法对对照组、模型组和柴胡低极性部位组大鼠盲肠内容物中的胆汁酸进行研究，如图6所示，共检测到36种胆汁酸，总体趋势与TCA结果一致。模型组胆酸类α-MCA、ω-MCA、CA-2、CA、CA-3含量均显著下降（P＜0.05），给药后CA含量显著回调，α-MCA、CA-3呈回调趋势；模型组脱氧胆酸类UDCA、D-3、CDCA的含量显著下降，给药后UDCA显著上调，其他有上调趋势：模型组牛磺结合型胆汁酸均显著下降，给药后TLCA、TUDCA、TCDCA、TDCA的含量显著回调；模型组GLCA、GCA等甘氨类胆酸都有下降趋势，给药后显回调趋势，但无显著性差异。
将鉴定出来的36种胆汁酸类型按照分组进行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）见图7-A，结果显示不同组之间有明显的聚类和分离趋势。随后将测定出来的36种胆汁酸按照模型组和给药组进行正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，OPLS-DA）见图7-B，可见两者具有一定分离趋势，进一步设置变量重要性投影（variableimportanceprojection，VIP）≥1和t检验（P＜0.05）进行差异代谢物的筛选，筛选出2组的5种差异胆汁酸（TUDCA、UDCA、TDCA、TCDCA、TLCA），表明柴胡低极性部位主要通过回调这5种差异胆汁酸的含量来发挥抗抑郁作用。
4讨论
神经递质假说是普遍公认的抑郁症发病机制，认为抑郁症与神经突触间隙单胺类递质水平减少有关[27]。研究表明，体内神经突触间隙NE、5-HT或DA相对或绝对不足是引起抑郁症发生的重要原因，且5-HT水平受其合成前体Trp和其代谢物5-HIAA含量的影响[28]，模型组Trp、5-HT含量降低，柴胡低极性部位组可回调Trp、5-HT、5-HIAA水平，调控5-HT的代谢途径。研究发现应激性生活事件使Glu浓度升高，GABA浓度降低，引起Glu能系统过度激活，而GABA神经传递活动减退，Glu和GABA的平衡失调导致抑郁等情感障碍疾病的发生[29]。模型组GABA、GABA/Glu含量降低，给药后柴胡低极性部位组可显著升高GABA的水平，调节氨基酸神经递质比例的平衡。
本研究中模型组血清γ-GT活性和TBIL含量均有不同程度的升高，表明CUMS大鼠肝细胞可能存在一定程度的损伤，与许多文献报道一致[30-31]。而ALP的下调趋势与肝细胞损伤的结果相反，临床上ALP活性下降见于贫血或者营养不良，推测可能与抑郁大鼠饮食量降低造成的营养不良有关。而临床研究报道，肝功能指标γ-GT、TBIL、ALP均可在疾病的不同严重程度检测到升高，但是ALP的升高呈不规则性，个体差异较大[27]，这也可能是本研究ALP活性下降的另一个原因。给予柴胡低极性部位干预后，生化指标均有不同程度的回调，说明柴胡低极性部位具有肝保护作用。
综上，本研究筛选出柴胡低极性部位为最佳抗抑郁部位，具有较好的抗抑郁作用和保肝作用。同时具有调节胆汁酸谱的作用，基于UPLC-MS建立了拟靶向代谢组学测定方法，可同时测定36种胆汁酸的相对含量，能够用于大鼠胆汁酸谱的测定。该方法前处理操作方便快捷，灵敏度和特异性较高，对某些疾病的早期无创诊断和深入的研究具有重要意义。
参考文献（略）
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