本发明属于生物检测领域，涉及一种检测试剂盒，具体来是一种用于检测血清或者血浆中α-羟基丁酸(a-hydroxybutyrate，α-hb)浓度的试剂盒和方法。
背景技术：：
技术实现要素：：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱(uhplc-ms/ms)技术用于检测血清或者血浆中α-hb浓度的试剂盒和方法，所述的这种用于检测血清或者血浆中α-hb浓度的试剂盒和方法要解决现有技术中检测血清或者血浆中α-hb浓度的方法复杂，准确性不高的技术问题。
本发明提供了一种用于检测血清或者血浆中α-hb浓度的试剂盒，包括流动相a、流动相b，标准物储备液、同位素标内标物储备液、样本萃取液和稀释液，所述的流动相a为体积百分比浓度为0.01％的甲酸水溶液，所述的流动相b为甲醇和乙腈按照体积比1：1组成的溶液，所述的标准物储备液为10mg/ml的α-hb溶液，所述的同位素内标物储备液为10mg/ml的d3-α-羟基丁酸钠(d3-α-hb)溶液，所述的样本萃取液为甲醇、乙腈和甲酸按照50:50:0.01的体积比组成的溶液，所述的稀释液为不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白的浓度为50mg/ml。
本发明还提供了上述的一种用于检测血清或者血浆中α-羟基丁酸浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)一个制备流动相a的步骤，将甲酸加入超纯水中，加入后甲酸的体积百分比浓度为0.01％，混合均匀并超声脱气备用；
2)一个制备流动相b的步骤，将甲醇加入到乙腈中，甲醇和乙腈的体积比为1：1，混合均匀并超声脱气备用；
3)一个制备标准物储备液的步骤，称取α-hb，加入到质量百分比浓度为0.1％的叠氮钠水溶液中，加入后，α-hb的浓度为10mg/ml，完全溶解后保存备用；
4)一个制备同位素内标物储备液的步骤，称取d3-α-hb加入到质量百分比浓度为0.1％的叠氮钠水溶液中，加入后，d3-α-hb的浓度为10mg/ml，完全溶解后保存备用；
5)一个制备样本萃取液的步骤，量取甲醇、乙腈和甲酸，所述的甲醇、乙腈和甲酸的体积比为50：50：0.01，混合均匀后备用；
6)一个制备稀释液的步骤，称取牛血清白蛋白，所述的牛血清白蛋白不含游离脂肪酸，将牛血清白蛋白加入到磷酸缓冲盐溶液中，使得牛血清白蛋白的浓度为50mg/ml。
本发明还提供了采用上述的试剂盒检测血清或者血浆中α-hb浓度的方法，包括如下步骤：
1)一个制备标准工作液和质控品的步骤；取标准品储备液，用稀释液稀释成0.5μg/ml，1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，36μg/ml，40μg/ml的标准工作液，另外配制成2μg/ml，15μg/ml，30μg/ml的溶液作为质控品；
2)一个制备同位素内标物工作液的步骤，用体积百分比浓度为50％的甲醇水溶液将所述的同位素内标物储备液稀释成10μg/ml的工作液；
4)一个质谱分析步骤，质谱参数：自动进样器温度为4℃，柱温为50℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，α-羟基丁酸和同位素内标d3-α-羟基丁酸钠检测的离子质荷比为103.1/57.1、106.1/59.1，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为550℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-40v、-10v、-13v和-4500v；α-羟基丁酸碰撞能量为-18v，d3-α-羟基丁酸钠的碰撞能量为-17v；
5)一个制备样品的步骤，将40ul待测血清或血浆样本、不同浓度的标准工作液、质控品，分别加20ul同位素内标工作液，室温平衡1h后，加入300ul样本萃取液，涡旋振荡2min，以10000g的转速离心10分钟，转移上层清液至液相色谱专用瓶，等待上样；
6)将步骤5)制备的标准品溶液依次从低浓度到高浓度进样，每个混合标准品溶液连续进样3次，采用步骤3)和步骤4)的液相色谱串联质谱的方法分析，以α-羟基丁酸与同位素内标物浓度比为x轴，α-羟基丁酸与同位素内标的峰面积比为y轴，进行线性回归，得到α-羟基丁酸的标准曲线；
7)采用步骤3)和步骤4)的液相色谱串联质谱的方法分析步骤5)的待测样品和质控品，根据标准曲线计算样本浓度。
附图说明：
图3为空白样本检测图，可见在α-hb及内标通道均无干扰峰存在。
图4显示了α-羟基丁酸(α-hb)的检测线性范围。
具体实施方式：
实施例1血清或者血浆α-羟基丁酸(α-hb)含量的超高效液相色谱串联质谱(uhplc-ms/ms)检测方法的建立
一、仪器：高效液相色谱仪agilent1290uplc(agilent，usa)、串联三重四极杆质谱仪abapi5000(absciex,usa)，mettlertoledo天平(max＝220g，d＝0.1mg)(mettler，germany)、sb-c18快速分离高通量窄径柱(2.1mm*100mm*1.8μm)(agilent，usa)，eppendorf5424r低温高速离心机(eppendorf,germany)。
二、商购试剂：α-hb纯物质购自加拿大torontoresearchchemicals(trc)公司，纯度为98.0％；d3-α-羟基丁酸钠(sodium(±)-2-hydroxybutyrate-2,3,3-d3，d3-α-hb)同位素标记物购自加拿大c/d/nisotopesinc，同位素丰度为98.8％；甲醇(lc//ms/ms级)、乙腈(lc//ms/ms级)、甲酸(lc//ms/ms级)均购自美国fisher公司。试验用水由milli-qintegral超纯水机(德国，默克密理博，merckmillipore)制备。
三、流动相配制：
1.流动相a：0.01％甲酸水溶液
2.流动相b：50％甲醇：50％乙腈溶液
四、储备液和工作标准液的配制
1.10mg/mlα-hb纯物质储备液的配制：称取α-hb100mg，准确称量至0.1mg。将其转移至10ml容量瓶中，用自动取样器加入10ml，0.1％叠氮钠水溶液。轻轻摇动锥形瓶，使其完全溶解。用封口膜密封瓶口，置于冰箱4小时，取出后将储备液分别装入1.5mlep管中，密封并保存于-20℃冰箱中。
2.10mg/mld3-α-hb同位素内标物储备液的配制：方法同α-hb纯物质储备液的配制。
五、标准工作液和质控品的制备：
在不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白(50mg/mlinpbs)中加入标准品储备液，稀释成0.5，1，2.5，5，10，20，36，40μg/ml的标准工作液，另外配制成2，15，30μg/ml的溶液作为质控品；用50％甲醇水溶液将同位素内标物储备液稀释成10μg/ml的工作液，存放于4℃冰箱中备用。所有的标准工作液及质控品均按照样本处理。
六、实验步骤：
1.血清样品的制备
40ul待测血清或血浆样本、标准工作液、质控品，分别加20ul同位素内标工作液(10μg/ml)，室温平衡1h后，加入300ul样本萃取液，涡旋振荡2min，以10000g的转速离心10分钟，转移上层清液至液相色谱专用瓶。
2.色谱条件
3.质谱条件
自动进样器温度为4℃，柱温为50℃，使用电喷雾电离源负离子模式和多反应监测模式分析，α-羟基丁酸和同位素内标d3-α-羟基丁酸钠检测的离子质荷比为103.1/57.1、106.1/59.1，雾化气、雾化辅助加热气、气帘气和碰撞气分别为55psi、55psi、40psi和6psi，雾化辅助加热气加热温度为550℃；去簇电压、入口电压、出口电压和喷雾电压分别为-40v、-10v、-13v和-4500v；α-羟基丁酸碰撞能量为-18v，d3-α-羟基丁酸钠的碰撞能量为-17v。
4.方法学验证
1)标准曲线和定量限
y＝0.133x+0.0193(r＝0.9994)
以最低浓度标准工作溶液采用逐步稀释的方法来考察α-hb的lloq，将信噪比s/n(signal/noise)为10时的标准品浓度作为待测化合物的lloq。
2)精密度(批内、批间)和准确度
一般情况下，不精密度的可接受标准为3倍lloq浓度以内，cv<20％；其余浓度点cv<15％。考察方法为在空白血清中分别配制浓度为2，15，30μg/ml的α-hb质控品，重复测定6批，每批每个样品重复测定3次，计算cv以评价批间精密度，计算相对误差以评价准确度。
同时对两个浓度的血清样本平行处理20管以评价批内精密度，另外对两份样本各重复进样15次以考察仪器精密度。
3)稳定性
样品的稳定性可能影响检测结果，由于实验样本一般保存于4℃冰箱或置于液相进样系统(4℃)中，因此本实验通过检测于4℃保存的样品在保存一天、五天及十天后的浓度，并与初始值比较以观察其稳定性。
4)携带污染
先测定低浓度样本0.5μg/ml10次，再测定高浓度样本40μg/ml10次，再测定低浓度样本0.5μg/ml10次，观察两批次低浓度样本均值间是否存在统计学差异。
七、实验结果：
1.uplc-ms/ms技术测定α-hb方法的建立
检测α-hb时，选择母离子的质荷比为103.1、子离子的质荷比为57.1，测定同位素内标d3-α-hb时，母离子质荷比选定为106.1、子离子质荷比选定为59.1。
2.方法学评价
以α-hb与内标的浓度比为x轴，α-hb与内标的峰面积比为y轴，进行线性回归，得回归方程为y＝0.133x+0.0193，r＝0.9994，表明α-hb在0.5～40μg/ml血清浓度范围内线性关系良好，方法的lloq为0.5μg/ml，线性范围和定量限均满足对人体血清样本的检测。见表1。
本方法的批间精密度≤3.5％，方法精密度好；相对误差≤2.3％，说明准确度好，适合血清样本的测定。结果见表2。
表2批间准确度、精密度
由表3数据可知，批内cv≤1.1％，仪器cv≤0.6％，结果表明本方法批内精密度、仪器精密度良好。
表3批内精密度、仪器精密度
观察3个浓度血清样本在4℃放置24h、五天和十天后α-hb的浓度与初始值比较，误差为0～5％，表明样品稳定性良好。结果见表4
表4稳定性结果
先测定低浓度样本0.5μg/ml10次，再测定高浓度样本40μg/ml10次，再测定低浓度样本0.5μg/ml10次，两批次低浓度样本均值间无统计学差异。见表5.
表5携带污染结果
实施例2α-hb检测临床初步应用
一、研究对象
血清样本采集于上海市东方医院完成。
t2dm组：受试者为2016年12月至2017年2月间在该院内分泌科门诊确诊为t2dm的患者72例，其中男40例，女32例，平均年龄57.8岁。
诊断标准：
(1)糖尿病症状(多饮、多食、多尿、体重减轻)+随机血糖≥11.1mmol/l；
(2)fpg≥7.0mmol/l；
(3)ogtt实验中，2hpg≥11.1mmol/l。
满足以上任意一项，使用任一方法复查确认后，诊断成立。
nafld组：受试者为2016年12月至2017年2月间在该院中医科脂肪肝专病门诊确诊为nafld的患者100例，其中男43例，女56例，平均年龄55.5岁。
(1)无饮酒史或饮酒折合乙醇量小于140g/周(女性＜70g/周)；
(2)除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性、自身免疫性肝病等可导致脂肪肝的特定疾病；
(3)肝脏超声检查符合弥漫性脂肪肝的诊断标准；
(4)血清丙氨酸氨基转移酶(alt)或天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、γ-谷氨酰基转移酶(ggt)持续增高半年以上。
nafld分级标准：以b超检查为主，结合临床症状，作为分级依据。
(1)轻度脂肪肝：b超表现为近场回声增强，远场声衰减不明显，肝内管状结构仍可见。自觉症状不明显，肝功能基本正常。
(2)中度脂肪肝：b超表现为前场回声增强，后场回声衰减，肝内管状结构模糊。自觉肝区不适，食欲不振，肝功能轻度异常。
正常对照组：同期于上海市东方医院体检中心的健康体检者50例，其中男22例，女28例，平均年龄53.8岁。明确fpg、肝、肾功能正常，无糖尿病史，无感染性疾病，无恶性肿瘤，无手术外伤史。
血清样本采集后保存于-20℃冰箱中备用。
二、研究方法
1、稳态法评估胰岛素抵抗
根据基础状态下的血糖水平和胰岛素水平，利用稳态模型法(homainsulinresistance,homa-ir)评价胰岛素抵抗。
homa-ir＝空腹胰岛素(1u/ml)×空腹血糖(mmol/l)/22.5。
2、仪器与材料
同实施例1
3、样本α-hb的检测
上述所有血清样本按照实施例1所示操作步骤集中进行检验，每批次检测均设0.5～40μg/ml标准曲线及空白样本、质控样本。
4、常规生化指标检测：采用德国罗氏诊断产品公司全自动生化分析仪及其配套试剂，按照临床检验常规检测上述样本血糖、胰岛素(in)、胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)、c-反应蛋白(crp)，应用日本tosohg8型糖化血红蛋白分析仪及配套试剂检测糖化血红蛋白(hba1c)。
三、统计分析
四、结果分析
4.1.1临床特征
受试者临床特征见表7，除病例组平均年龄较正常对照组稍大，差异有统计学意义(p<0.05)外，两组在身高、体重及bmi上均无明显差异。
表7受试者临床特征
4.1.2生化指标测得值
采用常规方法对受试者生化指标进行检测，测定值见表8，t2dm组fpg及ins均高于正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。α-hb在t2dm组中的测得值显著高于对照组测得值(p<0.001)。nafld组ast、alt均高于对照组，差异具有统计学意义(p<0.05)。fpg、ins、α-hb均高于正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。
表8受试者生化指标
4.1.3胰岛素抵抗
采用稳态法检测胰岛素抵抗，由表9可见，t2dm组homa-ir显著高于对照组(p<0.001)，提示t2dm组存在胰岛素抵抗。nafld组homa-ir与对照组无显著性差异。
表9稳态法检测胰岛素抵抗结果
4.1.4血清α-hb水平用于评价胰岛素抵抗的价值分析
表14222例研究对象以homa-ir分组各指标分析
表15.222例研究对象以血清α-hb水平分组各指标分析
表16.分别以homa-ir、α-hb判断ir的一致性分析
诊断一致性：68.4％
4.1.5血清α-hb水平用于辅助诊断nafld价值分析
初步临床样本分析虽然没有发现血清α-hb指标辅助诊断nafld具有很高的敏感度和特异性，但从表19可看出动态监测血清α-hb水平等胰岛素抵抗指标变化，有助于判断nafld的发生、发展。