本发明涉及动物模型构建领域，具体涉及一种腹主动脉瘤动物模型及其构建方法。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm,aaa)是一类发病率高、死亡率高、检出率低、控制率低的严重大血管疾病。aaa定义为腹主动脉局部扩张，其直径超过30mm，虽然有些作者将aaa定义为腹主动脉直径大于正常直径的50％，但由于不同个体的腹主动脉正常值变异较大，临床实践中常采用第一种定义。本病主要发生在老年男性，根据西方国家的流行病学调查结果，65岁以上男性aaa的发病率约为4％-7％，女性则为1％-2％。根据国家统计局2015年发布的人口数据，我国65岁以上的人口已占全国总人口的10.1％，为13755万人，如以男女各占50％、aaa男女平均发病率各为5.5％和1.5％计算，我国aaa发病人数高达480万人。鉴于吸烟是aaa最重要的危险因素，而我国是世界第一吸烟大国，实际的发病人数可能更多。
技术实现要素：
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种aaa动物模型，其以epo作为诱导剂。所述动物模型尤其指小鼠模型。
本发明的所述的aaa动物模型中，成瘤位置均位于腹主动脉段，且腹主动脉段组织中显示动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管壁内可伴有血栓形成。
在本发明中，epo诱导aaa时，不影响血压、血脂、肝功和肾功的变化。
在本发明的实施方式中，发明人以低、中、高剂量的epo作为诱导剂构建aaa动物模型时，检测模型动物的收缩压、舒张压和平均动脉压，发现与对照组相比，epo低剂量组、epo中剂量组和epo高剂量组血压并没有明显变化；同样，检测模型动物总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇，发现epo干预后并未影响模型动物的血脂变化。因此，本发明采用epo作为诱导剂构建aaa动物模型时，对模型动物的血压、血脂无显著影响。
在本发明的实施方式中，发明人以低、中、高剂量的epo作为诱导剂构建aaa动物模型时，检测模型动物的丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮，发现与对照组相比，epo低剂量组、epo中剂量组和epo高剂量组的指标并没有明显变化；取对照组和epo高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行h&e染色，组织形态亦没有明显差别。因此，本发明采用epo作为诱导剂构建aaa动物模型时，不会引起肝脏和肾脏的功能障碍。
在本发明中，epo是通过(epor)2同型二聚体发挥作用促进aaa的形成。
在本发明的实施方式中，发明人发现采用epo异源二聚体受体的选择性激活剂phbsp，分别以高低剂量phbsp干预发现其并不能诱导模型动物发生aaa，因而，本发明发现epo导致的aaa模型的形成可能是epo通过其同源二聚体受体(epor)2发挥作用。
在本发明中，epo诱导aaa不依赖于高脂饮食和高胆固醇血脂。
在本发明的实施方式中，以epo作为诱导剂构建aaa动物模型时，发明人分别以普通饲料和高脂或高胆固醇饲料饲喂模型动物，结果发现，高脂或高胆固醇饲料组与普通饲料组在aaa的发生率上并无明显区别。高脂饮食和高胆固醇血脂不影响epo作为诱导剂形成aaa的剂量效应。因此，本发明采用epo诱导aaa不依赖于高脂饮食和高胆固醇血脂的影响。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种构建上述第一方面中所述的aaa动物模型的方法，其包括向动物注射施与epo。
在本发明的实施方式中，所述注射方式为腹腔注射。采用腹腔注射，不需要外科手术，对动物创伤小，对实验人员技术要求低，可操作性更强。
在本发明的实施方式中，epo的单次注射剂量为不低于2,500iu/kg/day，优选地，epo的单次注射剂量为5,000-10,000iu/kg/day。
在本发明的实施方式中，所述动物为鼠；所述鼠为apoe-/-小鼠或野生型小鼠。本发明发现epo剂量依赖性地促进了aaa的形成，并在apoe-/-小鼠和野生型小鼠中均有较高的发生率。
在本发明的一些实施方式中，本发明探讨了epo对apoe-/-小鼠和野生型小鼠aaa形成的影响，结果发现，以epo作为诱导剂时，可以采用特定基因敲除的小鼠，但是不必然需要特定基因敲除的小鼠，野生型小鼠即可实现模型的构建。且epo导致野生型小鼠aaa发生率更高。
此外，在本发明的实施方式中发现epo导致apoe-/-小鼠aaa发生率与angii相当，但epo导致野生型小鼠aaa发生率明显高于angii。
此外，本发明在研究中发现epo诱导aaa雄性小鼠发病率高于雌性。
基于以上，在本发明的第三方面，本发明提供了epo在构建aaa动物模型中的应用。
以及，在本发明的第四方面，本发明提供了epo在制备用于构建aaa动物模型的产品中的应用。所述产品可以为药品或试剂。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种检测血清epo水平的试剂或试剂盒在制备诊断aaa的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，aaa患者血清epo水平高于正常人组群，epo可作为诊断诊断aaa的标志物。
相较于现有技术，本发明具有以下优势：
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了epo剂量依赖性地诱导apoe-/-小鼠aaa的发生；a.对照组或高中低剂量epo组小鼠主动脉代表图片；b.对照组或高中低剂量epo组小鼠aaa发生率比较；c.对照组或高中低剂量epo组小鼠腹主动脉直径比较；d.对照组或高中低剂量epo组小鼠死亡率比较(四条折线自上而下依次对应vehicle、low、medium、high)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2示出了epo导致apoe-/-小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂；a.angii诱导aaa和epo高剂量组诱导aaa发生率的统计分析；b.对照组或高中低剂量epo组小鼠腹主动脉组织h&e染色和verhoff染色代表图片。***p<0.001。
图3示出了epo对apoe-/-小鼠血压和血脂的影响；a.对照组或高中低剂量epo组小鼠血压的比较(sbp、mbp、dbp每一项对应的四条柱状图从左至右依次为vehicle、low、medium、high)；b.对照组或高中低剂量epo组小鼠血脂的比较。sbp：收缩压；dbp：舒张压；mbp：平均动脉压；tg：甘油三酯；tc：总胆固醇；ldl-c：低密度脂蛋白胆固醇；hdl-c：高密度脂蛋白胆固醇。
图4示出了epo对apoe-/-小鼠肝脏和肾脏的影响；a.对照组或高中低剂量epo组小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮水平的比较；b.对照组或高剂量epo组小鼠肝脏和肾脏组织h&e染色代表图片。alt：谷丙转氨酶；ast：谷草转氨酶；cr：肌酐；bun：尿素氮。
图5示出了高脂饮食对epo剂量依赖性地诱导apoe-/-小鼠aaa发生的影响；a.给予正常饮食和高脂饮食喂养后，对照组或高中低剂量epo组小鼠aaa发生率比较；b.高脂饮食高剂量epo组和普通饮食高剂量epo组小鼠死亡率的比较。nd：正常饮食；hfd：高脂饮食。
图6示出了epo剂量依赖性地诱导野生型小鼠aaa的发生；a.对照组或高中低剂量epo组小鼠主动脉代表图片；b.对照组或高中低剂量epo组小鼠aaa发生率比较；c.对照组或高中低剂量epo组小鼠腹主动脉直径比较；d.对照组或高中低剂量epo组小鼠死亡率比较(四条折线自上而下依次对应vehicle、low、medium、high)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；wt：野生型。
图7示出了epo导致野生型小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂；a.angii诱导野生型小鼠aaa和epo高剂量组诱导aaa发生率的统计分析；b.对照组或高中低剂量epo组小鼠腹主动脉组织h&e染色和verhoff染色代表图片。**p<0.01，***p<0.001；wt：野生型。
图8示出了epo对野生型小鼠血压和血脂的影响；a.对照组或高中低剂量epo组小鼠血压的比较(sbp、mbp、dbp每一项对应的四条柱状图从左至右依次为vehicle、low、medium、high)；b.对照组或高中低剂量epo组小鼠血脂的比较。wt：野生型；sbp：收缩压；dbp：舒张压；mbp：平均动脉压；tg：甘油三酯；tc：总胆固醇；ldl-c：低密度脂蛋白胆固醇；hdl-c：高密度脂蛋白胆固醇。
图9示出了epo对野生型小鼠肝脏和肾脏的影响；a.对照组或高中低剂量epo组小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮水平的比较；b.对照组或高剂量epo组小鼠肝脏和肾脏组织h&e染色代表图片。wt：野生型；alt：谷丙转氨酶；ast：谷草转氨酶；cr：肌酐；bun：尿素氮。
图10示出了epo可诱导雌性apoe-/-小鼠和野生型小鼠aaa的发生；中剂量epo诱导两种基因型雌性小鼠aaa的发生。
图11示出了phbsp不能剂量依赖性地诱导小鼠aaa的发生；a.对照组或高低剂量phbsp组apoe-/-小鼠主动脉代表图片；b.对照组或高低剂量phbsp组野生型小鼠主动脉代表图片。
图12示出了aaa患者血清epo水平和腹主动脉直径的分析；a.对照组和aaa患者血清epo水平的比较；b.aaa患者中≤65岁和＞65岁患者动脉瘤直径的比较；c.aaa患者中男性和女性患者动脉瘤直径的比较；d.aaa患者中吸烟与不吸烟患者动脉瘤直径的比较。***p<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
1、材料与方法
1.1研究对象
(1)7-8周龄雄性apoe-/-小鼠170只，基因背景c57/bl6j，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，引自美国jacksonlaboratory；
(2)7-8周龄雄性野生型小鼠110只，基因背景c57/bl6j，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司；
(3)7-8周龄雌性apoe-/-小鼠30只，基因背景c57/bl6j，购买自北京华阜康生物科技有限公司，引自美国jacksonlaboratory；
(4)7-8周龄雌性野生型小鼠30只，基因背景c57/bl6j，购买自北京华阜康生物科技有限公司。
以上所有动物实验程序均经山东大学齐鲁医院动物实验伦理委员会批准，并按照中国卫生部动物管理规定执行。所有实验小鼠饲养在山东大学齐鲁医院心血管重构与功能研究实验室动物房内。饲养环境为12小时光照/黑暗循环交替，温度湿度恒定，不限制饮食和饮水。
1.2实验仪器设备
(1)显微手术器械：购自杭州六六视觉医疗器械有限公司；
(2)鼠尾血压计：日本软隆株式会社，型号bp-2010a；
(3)宠物电推剪：深圳科德士电器有限公司，型号cp-8000；
(4)全自动生化分析仪：深圳雷杜生命科技，型号chemray240；
(5)兽用全自动血液细胞分析仪：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号bc-2800vet；
(6)4℃冰箱：中国合肥美菱股份有限公司，型号bcd-201kck；
(7)-20℃冰箱：中国合肥美的电冰箱有限公司，型号bcd-545wkm(q)；
(8)-80℃冰箱：英国newbrunswickscientific公司，型号innovau725；
(9)微型台式真空泵：美国kylin-belllabinstruments公司，型号gl-802b；
(10)脱色摇床：美国kylin-belllabinstruments公司，型号ts-2；
(11)液氮罐：查特低温设备(成都)有限公司，型号yds-120-216；
(12)制冰机：意大利scotsman公司，型号af-156；
(13)全自动组织脱水机：德国leica公司，型号tp1020；
(14)石蜡包埋机：德国leica公司，型号histocorearcadiah；
(15)石蜡包埋机冷台：德国leica公司，型号histocorearcadiac；
(16)轮转式切片机：德国leica公司，型号rm2245；
(17)摊片机：德国leica公司，型号hi1210；
(18)烘片机：德国leica公司，型号hi1220；
(19)多功能染色机：德国leica公司，型号st5020；
(20)全自动封片机：德国leica公司，型号cv5030；
(21)微波炉：美的微波电器，型号em720ff2-na1；
(22)双目显微镜：日本奥林巴斯株式会社，型号bx41-12p05；
(23)大体显微镜：日本奥林巴斯株式会社，型号sz51；
(24)高压蒸汽灭菌器：三洋电机株式会社，型号mls-3780；
(25)超纯水系统：美国默克密理博公司，型号milli-q；
(26)电热恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限公司，型号dk-8d；
(27)干燥箱：上海福玛实验设备有限公司，规格45*45；
(28)游标卡尺：日本三丰株式会社，型号1204-70；
(29)恒温恒湿箱：上海精宏实验设备有限公司，型号hws-080；
(30)烘箱：德国binder公司，型号ed400；
(31)电子天平：德国sartorius公司，型号：cp323s；
(32)干湿恒温器：杭州朗基科学仪器有限公司，型号bg32
(33)全波长光吸收酶标仪：美国moleculardevices公司，型号spectramaxplus384。
1.3主要材料和试剂
(1)促红细胞生成素：购自沈阳三生制药股份有限公司，商品名益比奥；
(2)phbsp：购自上海吉尔生化有限公司；
(3)高脂高胆固醇饲料：购自南通特洛菲饲料科技有限公司，货号为tp28521；
(4)普通饲料：购自江苏协同医药生物工程有限公司；
(5)异氟烷：购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；
(6)5-0缝合线：购自上海浦东金环医疗用品股份有限公司；
(7)植入式胶囊渗透压泵：购自四川成都医疗器械有限公司，型号为alzetmodel2004；
(8)戊巴比妥钠：购自国药集团化学试剂有限公司，货号为69020181；
(9)促凝管：购自美国bd公司，货号为367955；
(10)4％固定液：购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号为kgihc016cs；
(11)组织包埋盒：购自江苏世泰实验器材有限公司，货号为31050102w；
(12)粘附载玻片：购自江苏世泰实验器材有限公司，货号为188105；
(13)显微镜盖玻片：购自江苏世泰实验器材有限公司，货号为10212450c
(14)环保透明剂：购自无锡市江原实业技贸总公司；
(15)乙醇：购自国药集团化学试剂有限公司；
(16)苏木素染液：购自武汉赛维尔生物科技有限公司，货号为g1005-1；
(17)伊红染液：购自武汉赛维尔生物科技有限公司，货号为g1005-2；
(18)弹力纤维染色试剂盒：购自英国abcam公司，货号为ab150667；
(19)人epoelisa试剂盒：购自美国r&d公司，货号为depru0。
1.4主要试剂的配制
1％盐酸酒精
1.5实验方法
1.5.1动物模型的建立和分组
(1)第一部分：为了探讨epo对雄性apoe-/-小鼠中aaa形成的剂量效应，epo设计为大、中、小三个剂量。雄性apoe-/-小鼠60只，在给予4周高脂高胆固醇饲料喂养后，随机分为4组，每组15只，并且继续高脂高胆固醇喂养至实验结束；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，低剂量组给予epo2,500iu/kg/day腹腔注射，中剂量组给予5,000iu/kg/day腹腔注射，高剂量组给予epo10,000iu/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。
(2)第二部分：为了探讨高脂高胆固醇饮食是否影响epo对雄性apoe-/-小鼠aaa形成的剂量效应，epo设计为大、中、小三个剂量。雄性apoe-/-小鼠60只，全程给予普通饲料喂养，随机分为4组，每组15只；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，低剂量组给予epo2,500iu/kg/day腹腔注射，中剂量组给予5,000iu/kg/day腹腔注射，高剂量组给予epo10,000iu/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。
(3)第三部分：为了探讨epo对雄性野生型小鼠中aaa形成的剂量效应，epo设计为大、中、小三个剂量。雄性野生型小鼠60只，全程给予普通饲料喂养，随机分为4组，每组15只；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，低剂量组给予epo2,500iu/kg/day腹腔注射，中剂量组给予5,000iu/kg/day腹腔注射，高剂量组给予epo10,000iu/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。
(4)第四部分：为了探讨epo对雌性apoe-/-小鼠和野生型小鼠aaa形成的影响，选取epo中剂量进行实验。雌性apoe-/-小鼠30只，在给予4周高脂高胆固醇饲料喂养后，随机分为2组，每组15只，并且继续高脂高胆固醇喂养至实验结束；雌性野生型小鼠30只，全程给予普通饲料喂养，随机分为2组，每组15只；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，epo组给予5,000iu/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。
(5)第五部分：为了探讨epo的异源二聚体受体对aaa形成的影响，本实验采用epo异源二聚体受体的选择性激活剂phbsp，并设计为高、低两个剂量。雄性apoe-/-小鼠45只，在给予4周高脂高胆固醇饲料喂养后，随机分为3组，每组15只，并且继续高脂高胆固醇喂养至实验结束；雄性野生型小鼠45只，全程给予普通饲料喂养，随机分为3组，每组15只；本实验采用的给药方式为植入式胶囊渗透压泵，配制好适当浓度的药品溶液，每个渗透压泵装入250μl液体，遂浸泡于生理盐水中，37℃孵育过夜，次日用异氟烷吸入麻醉小鼠，颈背部备皮消毒，沿肩胛骨连线处横向剪开背部皮肤，将渗透压泵埋于皮下，泵开口端朝向鼠尾，持续恒速泵入药物28天。其中对照组给予生理盐水持续泵入，低剂量组给予phbsp30mg/kg/day持续泵入，高剂量组给予phbsp300mg/kg/day持续泵入，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。
1.5.2鼠尾血压测量
在给予药物干预4周末，应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压，测量部位为小鼠尾动脉，每只小鼠检测3次，取其平均值作为最终数值。
1.5.3组织取材步骤
(1)小鼠取材前饥饿6-8小时；
(2)腹腔注射1％戊巴比妥钠，剂量为60mg/kg，以麻醉小鼠；
(3)待小鼠麻醉后，固定小鼠于工作台，提起腹部皮肤，沿腹部中央位置u型剪开腹腔，注意避开肝脏；沿肋骨测剪开膈肌，钝性分离心脏周围脂肪组织及心包膜，清晰暴露心脏；
(4)迅速用1ml无菌注射器从左心室侧壁进针，抽取1.5ml左右血液，少量滴入含edta抗凝管中，轻弹管壁，用于全血检测；剩余多量置于黄色促凝管中，促凝管中血液室温静置30分钟后3000rpm离心15分钟，收取血清，-80℃冰箱保存；
(5)剪开右心耳，使用输液器，心尖处进针灌入生理盐水，进行在体灌流，直至肝肾脂肪等组织灌流干净，右心耳处流出清亮液体；
(6)立刻分离心脏、肝脏、脾脏、肾脏、附睾脂肪组织、腹股沟皮下脂肪组织和主动脉；脾脏称重；主动脉包括升主动脉至髂动脉，仔细分离主动脉周围结缔组织，留出左右颈总动脉和左锁骨下动脉，血管大体拍照保存；并用游标卡尺测量腹主动脉段最大直径，当超过正常对照组平均直径的50％时，即认为aaa(king,v.l.,etal.,selectivecyclooxygenase-2inhibitionwithcelecoxibdecreasesangiotensinii-inducedabdominalaorticaneurysmformationinmice.arteriosclerthrombvascbiol,2006.26(5):p.1137-43.)。
(7)各组织视实验需要一部分放入液氮速冻，后转移至-80℃冰箱保存，一部分置于5倍体积的4％多聚甲醛中固定48小时，以备后续实验。
1.5.4血脂血常规、肝肾功检测
(1)使用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、肌酐(cr)和尿素氮(bun)的含量；
(2)使用兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠全血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积。
1.5.5石蜡切片制备
(1)切取腹主动脉段血管组织或者肝肾组织块，厚度约0.5厘米，至石蜡包埋盒，如果体积过小，用纱布包绕组织，以防丢失；包埋盒用铅笔写清组别；
(2)包埋盒浸于自来水中，用流水冲洗去除甲醛，3-4小时；
(3)将包埋盒放入全自动组织脱水机器中，选择相应的程序；
(4)选择与组织大小合适的石蜡模具，将组织切面朝下浸于充满石蜡的模具中，置于冰台，待石蜡凝固后，取出蜡块，室温保存；
(5)使用石蜡切片机修切蜡块，暴露组织后，将蜡块浸入冰水混合物中2小时；
(6)后将石蜡组织切成5μm的连续薄片，放入37℃温水台中展平；
(7)用载玻片轻轻捞起，每个载玻片2-3块组织，控水，置于65℃烤台2小时，后收放与切片盒中，室温保存。
1.5.6石蜡切片脱腊至水步骤
(1)石蜡切片置于65℃烤箱30分钟；
(2)环保透明剂i10分钟；
(3)环保透明剂ii10分钟；
(4)100％乙醇5分钟；
(5)95％乙醇4分钟；
(6)90％乙醇3分钟；
(7)80％乙醇3分钟；
(8)70％乙醇2分钟；
(9)自来水i5分钟；
(10)自来水ii5分钟；
(11)取出切片待染色。
1.5.7苏木素-伊红染色步骤
(1)石蜡切片脱腊至水后，置于苏木素染液中3分钟，镜下观察细胞核染为紫蓝色；
(2)将切片置于自来水中洗去苏木素浮色；
(3)将切片置于1％盐酸酒精分化数秒，镜下观察细胞质无色，细胞核仍为紫蓝色；
(4)流水中浸泡切片30秒-1分钟，直至细胞核变为蓝色；
(5)将切片置于伊红染液中3-5分钟，镜下观察细胞质染为粉红色；
(6)将切片置于自来水中洗去伊红浮色；
(7)80％乙醇5秒；
(8)95％乙醇1分钟；
(9)100％乙醇i5分钟；
(10)100％乙醇ii5分钟；
(11)环保透明剂i5分钟；
(12)环保透明剂ii5分钟；
(13)切片一侧滴加中性树胶，缓慢盖上盖玻片，避免气泡产生。
1.5.8verhoff弹力纤维染色
(1)石蜡切片脱蜡至水；
(2)放入弹力纤维染色液中，15分钟；
(3)自来水冲洗，洗去浮色；
(4)在verhoff分化液中分化，15-20次，自来水冲洗；
(5)显微镜下观察分化程度，如需要可重复步骤4，至弹力纤维清晰可见；
(6)将切片放入硫代硫酸钠溶液浸泡1分钟，脱碘；
(7)流水冲洗；
(8)用配制好的vangieson染色液浸泡切片2-5分钟；
(9)95％乙醇1分钟；
(10)100％乙醇i5分钟；
(11)100％乙醇ii5分钟；
(12)环保透明剂i5分钟；
(13)环保透明剂ii5分钟；
(14)切片一侧滴加中性树胶，缓慢盖上盖玻片，避免气泡产生。
1.5.9酶联免疫吸附实验(elisa)
(1)取出样品4℃解冻，瞬时离心；
(2)将elisa检测试剂盒从4℃或者-20℃中取出，复温至室温；
(3)配制标准品，等比稀释原液，设置浓度梯度；
(4)将不同浓度的标准品和待检测样品合理分配加入包被好的酶标板中；
(5)将酶标板用封板膜粘上，37℃孵育1小时；
(6)用预先配制的洗涤液清洗酶标板，共5次，每次1分钟，每次将酶标板反扣于吸水纸上，拍打，将水吸干；
(7)每孔分别加入适量体积的酶标试剂；
(8)粘上封板膜，37℃孵育30分钟；
(9)用预先配制的洗涤液清洗酶标板，共5次，每次1分钟，每次将酶标板反扣于吸水纸上，拍打，将水吸干；
(10)避光显色，37℃孵育20分钟；
(11)加入终止液，用酶标仪测定各孔的od值，激发波长为450nm；
(12)按照标准品吸光度和对应的蛋白浓度计算标准曲线，根据标准曲线公式，可计算得样品浓度。
1.5.10腹主动脉瘤病人血清收集
本实验纳入40例在2017年-2019年间经ct血管造影证实为腹主动脉瘤的住院患者，其中男性33例，女性7例，平均年龄为68.45±1.886，并在患者住院24小时内采集血样。患有贫血、心衰、慢性呼吸系统疾病和肾功能衰竭的病人排除入组。纳入45例健康志愿者的血清作为正常对照组，其中男性36例，女性9例，平均年龄为66.00±1.196。此测定方案经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，所有患者及志愿者均给予书面知情同意参与研究。
1.5.11数据统计分析
所有数据均以均数±标准误来表示，采用spss19.0进行统计分析；使用shapiro-wilk检验检测数据是否符合正态分布，符合正态分布的两组计量资料采用独立样本t检验，多组计量资料采用单因素方差分析lsd事后检验(方差齐)；不符合正态分布的数据采用秩和检验；计数资料采用卡方检验；生存分析采用log-rank检验；p＜0.05认为有统计学差异。
2、实验结果
2.1epo剂量依赖性地诱导apoe-/-小鼠aaa的发生
为了与经典aaa动物模型(angii诱导)进行对比，本实验首先选用雄性apoe-/-小鼠并给予高脂喂养(动物模型，第一部分)。腹腔注射高中低剂量epo4周后，发现epo剂量依赖的增加了小鼠aaa的发生率(图1a-1b)，其中epo低剂量组发生率为7％，epo中剂量组发生率为40％，epo高剂量组发生率为60％；腹主动脉直径明显增加，尤其是epo中剂量和epo高剂量组，明显高于对照组和epo小剂量组(图1c)；同时，随着aaa的发生率增加，小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加(图1d)，其中epo低剂量组死亡率为0，epo中剂量组死亡率为20％，epo高剂量组死亡率为40％。而与angii诱导的aaa发生率(80％)相比，epo高剂量组诱导的aaa发生率(60％)并无统计学差异(图2a)。由以上结果可知，epo剂量依赖性的诱导apoe-/-小鼠发生了aaa。
2.2epo导致apoe-/-小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂
为了观察epo诱导apoe-/-小鼠发生aaa后管壁的变化，本实验切取小鼠腹主动脉段组织，进行h&e染色和verhoff弹力纤维染色，结果显示给予epo低中高剂量注射后，动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管腔内可伴有血栓形成(图2b)。
2.3epo不影响apoe-/-小鼠血压和血脂的变化
epo干预4周后，检测小鼠收缩压、舒张压和平均动脉压，发现与对照组相比，epo低剂量组、epo中剂量组和epo高剂量组血压并无显著差异(图3a)；同样，检测小鼠总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇，发现epo干预后并没有影响小鼠血脂变化(图3b)。由此推断，epo注射4周，对小鼠的血压和血脂无显著影响。
2.4epo不影响apoe-/-小鼠肝功和肾功的变化
epo干预四周后，检测小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮，发现与对照组相比，epo低剂量组、epo中剂量组和epo高剂量组的指标并没有明显变化(图4a)；取对照组和epo高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行h&e染色，组织形态亦没有明显差别(图4b)。由此，从药物毒理学角度推测，epo注射4周，并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。
2.5高脂饮食不影响epo对apoe-/-小鼠aaa形成的剂量效应
为了明确高脂饮食在epo诱导apoe-/-小鼠形成aaa中的作用，本实验选用雄性apoe-/-小鼠并全程给予普通饲料喂养(动物模型，第二部分)，发现epo剂量依赖地增加了小鼠aaa的发生率，且与高脂喂养模型的发生率无显著差异(图5a)，其中普通饲料喂养的epo低中高剂量组的发生率分别为7％、38.9％和60％；同时，高脂喂养与否，epo高剂量组小鼠的死亡率无明显统计学意义(图5b)。由此得出，高脂饮食不影响epo对apoe-/-小鼠aaa形成的剂量效应。
2.6epo剂量依赖性地诱导野生型小鼠aaa的发生
本实验又选用了血脂水平正常的野生型小鼠给予epo注射(动物模型第三部分)，腹腔注射高中低剂量epo4周后，发现epo剂量依赖地增加了小鼠aaa的发生率(图6a-6b)，其中epo低剂量组发生率为27％，epo中剂量组发生率为53％，epo高剂量组发生率为60％；腹主动脉直径明显增加，尤其是epo中剂量和epo高剂量组，明显高于对照组和epo小剂量组(图6c)；同时，随着aaa的发生率增加，小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加(图6d)，其中epo低剂量组死亡率为7，epo中剂量组死亡率为27％，epo高剂量组死亡率为47％。关键的是，epo高剂量组诱导的aaa发生率(60％)明显高于angii诱导野生型小鼠的aaa发生率(13.3％)(图7a)。由以上结果可知，epo剂量依赖性地诱导野生型小鼠发生了aaa。
2.7epo导致野生型小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂
为了观察epo诱导野生型小鼠发生aaa后管壁的变化，本实验切取小鼠腹主动脉段组织，进行h&e染色和verhoff弹力纤维染色，结果显示给予epo低中高剂量注射后，动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管腔内可伴有血栓形成(图7b)。
2.8epo不影响野生型小鼠血压和血脂的变化
epo干预4周后，检测小鼠收缩压、舒张压和平均动脉压，发现与对照组相比，epo低剂量组、epo中剂量组和epo高剂量组血压并无显著差异(图8a)；同样，检测小鼠总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇，发现epo注射后并没有影响小鼠血脂水平(图8b)。由此推断，epo注射4周，对小鼠的血压和血脂无显著影响。
2.9epo不影响野生型小鼠肝功和肾功的变化
epo注射四周后，检测小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮，发现与对照组相比，epo低剂量组、epo中剂量组和epo高剂量组的指标并无明显变化(图9a)；取对照组和epo高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行h&e染色，组织形态亦没有明显差别(图9b)。由此，从药物毒理学角度推测，epo注射4周，并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。
2.10epo可诱导雌性apoe-/-小鼠和野生型小鼠aaa的发生
为进一步观察epo是否可以让雌性小鼠发生aaa，本实验选取雌性apoe-/-小鼠和雌性野生型小鼠(动物模型，第四部分)，结果显示，在中剂量epo影响下雌性apoe-/-小鼠发生率为21％，雌性野生型小鼠发生率为40％，均有aaa发生，但都略低于雄性小鼠发生率，这也符合人类aaa发病率中，男性高于女性的特征。
2.11phbsp不能剂量依赖性地诱导小鼠aaa的发生
为了探讨epo的异源二聚体受体对aaa形成的影响，本实验选用epo异源二聚体受体的选择性激活剂phbsp，分为高、低剂量干预小鼠4周后(动物模型，第五部分)，结果显示phbsp并不能诱导两种基因型的小鼠发生aaa，因此推断epo可能通过同源二聚体受体发挥作用，导致aaa。
2.12aaa患者血清epo水平明显增高
为了评估血清epo水平和aaa患者之间的关系，本实验收集了40例aaa患者和45例健康志愿者血清，检测其血清epo浓度。两组之间在年龄、性别、肾功能和药物治疗方面没有显著差异，但吸烟者在aaa组比正常对照组更常见(表1)。在40例aaa患者中，11例患者接受了腹主动脉超声扫描，38例患者(95％)接受了腹部ct血管造影，34例患者(85％)接受了手术干预。通过分析显示，年龄在＞65岁和≤65岁之间、男性和女性之间、吸烟者和非吸烟者之间的腹主动脉直径没有显著差异(图12b-12d)，这表明在这组患者中，aaa直径不受传统动脉粥样硬化危险因素的影响。相反，与健康对照组相比，aaa患者的血清epo水平显著升高(图12a)，这表明该组患分泌了更多的epo于循环血液中。
表1.健康对照组和aaa患者的临床特征
3、讨论
3.1aaa动物模型和人类aaa病变特征
3.2angii诱导的aaa动物模型
3.3epo诱导的aaa动物模型
3.4性别和aaa发病率
3.5epo受体类型与aaa
3.6aaa患者与血清epo水平
临床上epo主要用于治疗慢性肾衰竭继发贫血或恶性肿瘤伴发贫血的病人。对于需要长期epo治疗的严重贫血患者，建议定期行腹部超声或ct检查以监测aaa的发生。另外，由于epo的表达受hif的调控，而缺氧是hif的重要调控因素之一，因此慢性缺氧患者，如慢性高原病患者，应引起重视。与正常人群对比，慢性高原病患者的骨髓细胞hif-1α和epor表达变化不明显，但骨髓细胞中hif-2α和epo显著增高，并明显增加微血管密度，由此属于aaa高风险人群，如有必要应对生活在高海拔的无症状人群进行aaa筛查。阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(osa)是一种常见的疾病，反复的呼吸暂停使心血管系统暴露于重复性缺氧和二氧化碳潴留的环境中。有报道显示，有40％的小型aaa患者存在osa，osa患者可能更容易发生aaa并进展。在多元回归分析中，osa被确定为aaa扩张的一个强有力的独立预测因子。通过本实验收集的aaa患者与健康人血清对比发现，aaa患者体内血清epo水平明显升高，提示本实验血清epo水平对于预测aaa发病或许有着重要作用。
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