1、各种微生物生化试验方法原理通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反应，常用于细菌的鉴别。1、糖类分解产物（1）糖发酵试验（carbohydratefermentationtest）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。（2）VP试验（Voges-Proskauertest）产气杆菌将分解葡萄
2、糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。（3）甲基红试验（methylredtest）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大肠杆菌培养液PH在4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.
3、4以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。（4）枸橼酸盐利用试验(citrateutilizationtest）产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。2、蛋白质及氨基酸的分解产物（1）硫化氢试验（hydrogensulfidetest）有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验
4、阳性。本试验常用于区别肠道杆菌的种类。沙门氏菌属通常为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。（2）明胶液化试验（gelatinliguefactiontest）有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌则不能。（3）吲哚试验（indoletest）有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，为吲哚试验阳性。大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性。吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚细菌的生化反应是鉴别细菌
6、，不仅在微生物鉴定中广为使用，而且在微生物学的其它方面也被采用，推动了微生物学的迅速发展。一、微量多项试验鉴定系统该系统的根本原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定。这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。它是针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量（约0.1ml）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养248小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索表(根据数码分类鉴定的原理编制成)，得到鉴定结果，或将编码输入计算
7、机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。微量多项试验鉴定系统已广泛用于动、植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是临床检验中深受欢迎，迅猛发展。国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；深圳华士达生物科技有限公司的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Ente
12、物敏感性试验一、实验目的抗微生物药物敏感性试验（药敏试验）的主要目的检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供依据。对所有临床分离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。纸片扩散法二、实验原理此法是临床和实验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）所推荐的临床微生物理学室常规开展的药敏试验方法。将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其纸片周围一定区域琼脂内的药
16、唑西林和万古霉素的耐药性。五、结果判断抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。根据CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生素是敏感、中介还是耐药。敏感（S）：表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。中介（I）：不是敏感性的度量，而是一个“缓冲区”，用以防止因微小的技术因素失控导致的结果偏差，因而其临床意义是不确定的，故不应作临床报告。耐药（R）：表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。六、药敏试验结果判断注意事项（1）药敏试验的结果容易受培养基、抗菌药物、孵育条件等多种因素影响，实验室开展药敏试验时应定期用标准菌株对上述因
17、素进行质量控制。（2）变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长可以忽略。（3）对于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长，所以抑菌圈直径的检测不考虑细微生长的部分（生长菌苔的20%或以下）而测量比较明显的边缘。（4）对于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺甲唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告，第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。（5）沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性。（6）肠球菌
20、作用和互相依赖的基础.例如,一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物,或者一种微生物的产物可抑制或杀死另一种微生物.所以微生物的生理生化反应也被作为细菌鉴定和分类的内容。一、大分子物质的水解试验(一)目的要求1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同,从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。(二)基本原理微生物对大分子的淀粉,蛋白质和脂肪不能直接利用,必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油
21、和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等.这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实:淀粉遇碘液会产生蓝色,但细菌水解淀粉的区域,用碘测定不再产生蓝色,表明细菌产生淀粉酶.脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH,使pH降低,加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色,说明胞外存在着脂肪酶。微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外,当缺乏糖类物质时,亦可用它们作为碳源和能源.明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质,在25以下可维持凝胶状态,以固体形式存在.而在25以上明胶就会液化.有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶,水解这种蛋白质,而使明胶液化,甚至在4仍能保持液化状态。还有些微生
22、物能水解牛奶中的蛋白质酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶来检测.石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成,是昏浊的蓝色.酪素水解成氨基酸和肽后,培养基就会变得透明.石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵,因为在酸存在下,石蕊会转变为粉红色,而过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成).氨基酸的分解会引起碱性反应,使石蕊变为紫色.此外,某些细菌能还原石蕊,使试管底部变为白色。尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物.尿素酶能分解尿素释放出氨,这是一个分辨细菌很有用的诊断实验.尽管许多微生物都可以产生尿素酶,但它们利用尿素的速度比变形杆菌属(Proteus)的细菌要慢,因此尿素酶试验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生
29、0;图.糖发酵试验A.培养前的情况;B.培养后产酸不产气;C.培养后产酸产气(三)器材1.菌种大肠杆菌,普通变形杆菌斜面各一支。2.培养基葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支(内装有倒置的德汉氏小试管)。3.仪器或其他用具试管架,接种环等。(四)操作步骤1.用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。2.取葡萄糖发酵培养基试管3支,分别接入大肠杆菌,普通变形杆菌,第三支不接种,作为照.另取乳糖发酵培养基试管3支,同样分别接入大肠杆菌,普通变形杆菌,第三支不接种,作为对照。在接种后,轻缓摇动试管,使其均匀,防止倒置的小管进入气泡。3.将接种过和作为对照
31、st),伏一普(Voges-Prokauertest)和柠檬酸盐(citratetest)四个试验的缩写,I是在英文中为了发音方便而加上的.这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes),多用于水的细菌学检查.大肠杆菌虽非致病菌,但在饮用水中若超过一定数量,则表示受粪便污染.产气肠杆菌也广泛存在于自然界中,因此检查水时要将两者分开，硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验吲哚试验是用来检测吲哚的产生.有些细菌能产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸.吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚.但并非所有微生物都具有分解色氨酸产
32、生吲哚的能力,因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性,产气肠杆菌为阴性。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸,乙酸,乳酸等.当细菌代谢糖产生酸时,培养基就会变酸,使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2),即甲基红反应.尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸,但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的.这两个细菌在培养的早期均产生有机酸,但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4,而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物,如乙醇,丙酮酸等,使pH升至大约6.因此大肠杆菌为阳性反应,产气肠杆菌为阴性反应。伏-普试验是用
33、来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力,如丙酮酸.丙酮酸进行缩合,脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰.二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成红色化合物,即伏-普反应阳性;不产生红色化合物者为阴性反应.有时为了使反应更为明显,可加入少量含胍基的化合物,如肌酸等。柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用.有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源,如产气肠杆菌;而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐,如大肠杆菌.细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后,产生碱性化合物,使培养基的pH升高,当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时,培养基就会由绿色变为深蓝色.溴麝香草酚蓝的指示范围为:pH小于6.0时呈黄色,pH在6.07.0时为绿色,pH大于7.6时呈蓝色.硫化氢试验是检测硫化氢的产生,也是用于肠道细菌检查的常用生化试验.有些细菌能分解含硫的有机物,如胱氨酸,半胱氨酸,甲硫氨酸等产生硫化氢,硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等,就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。以半胱氨酸为例,其化学反应过程如下:CH2SHCHNH2COOH+H2OCH3COCOOH+H2S+NH3H2S+Pb(CH3