本发明涉及生物，具体涉及一种狂犬病毒中和抗体的elisa检测方法。
背景技术：
1、狂犬病是一种由狂犬病毒引起、温血动物易感的急性人畜共患传染病，宿主一旦发病，致死率几乎为100%。全球每年超过5万人死于该病，主要集中在亚洲和非洲等发展中国家，其中印度每年因该病死亡数达3万人之多。我国主要传染源是病犬及带毒犬，其次是猫、猪、牛等温血动物，在狂犬病控制较好的欧美国家其主要传染源则是野生动物如狼、狐狸、臭鼬、浣熊等。狂犬病毒主要是通过伤口或黏膜而感染，被狂犬病动物咬伤是狂犬病病毒传播的最重要的途径。
2、狂犬病毒是单股负链rna病毒，其rna全长11kb左右，属于弹状病毒科的狂犬病毒属，病毒的形态符合弹状病毒科病毒的典型特征：前端呈半圆形，后端平齐。弹状病毒科的病毒几乎都为子弹状或杆状，主要结构成份是蛋白质和rna。其rna中包含了5段不同的基因，自3’端到5’端依次为n、p、m、g、l。每段基因各自编码一种对应的蛋白，即np(核蛋白)、pp(磷蛋白)、mp(基质蛋白)、gp(糖蛋白)、lp(rna聚合酶大蛋白)。
3、现阶段，人用狂犬病疫苗有效抗原主要是核蛋白和糖蛋白（g蛋白）。其中g蛋白由524个氨基酸组成，是狂犬病毒中唯一的糖基化蛋白，可以形成三聚体的棘状突起，从而组成狂犬病病毒囊膜表面的重要成份。它是影响病毒毒力的主要蛋白和诱导产生中和抗体的最主要抗原。占狂犬病病毒总蛋白量的42%之多，且是唯一的病毒囊膜外的蛋白结构。抗原能否让机体产生中和抗体，关键在于是否保持狂犬病毒糖蛋白三聚体的三维空间构象，其完整的天然结构对狂犬病疫苗的效力和免疫效果起决定性作用。据报道，糖蛋白g还与诱导并结合病毒中和抗体、刺激特异性ｔ淋巴细胞的增值、决定毒力等分子定位有关。
4、目前我国每年通过犬、猫等动物媒介感染的人数超过千例，死亡人数位居各类报告传染病第三位。因此，狂犬病的有效防控已成为当务之急。而免疫接种仍然是控制狂犬病传播的重要手段。据who和oie报道，疫苗的免疫覆盖率达到70%以上时，才可以有效控制狂犬病的流行。对免疫后狂犬病病毒血清抗体检测方法的研究，积极进行动物尤其是犬的狂犬病免疫监测，为狂犬病的有效防控提供了必要的技术支持。
5、为了确保机体对狂犬病病毒侵袭的抵抗能力，定量地检测抗狂犬病病毒抗体或狂犬病病毒的中和抗体是很好的监测手段。其中，最常用的抗狂犬病病毒中和抗体的定量检测方法包括了：小鼠病毒中和试验（mnt），荧光抗体病毒中和试验（favn），快速灶抑制试验（rffit），酶联免疫吸附试验（elisa）等。
8、在我国，已经有商品化的狂犬病病毒血清抗体elisa检测试剂盒，可以用于人和其它动物（主要是犬）血清抗体水平的快速检测。但这些试剂盒大多采用灭活的rv全病毒作为诊断抗原，使用全病毒作为诊断抗原在检测的准确性及可靠性等方面具有无可争议的优势，但是rv作为严重危害人畜健康的传染病病原，其制备和使用过程相对繁琐，同时存在潜在的生物安全问题。
9、本发明使用携带狂犬病毒g蛋白的vsv骨架假病毒（vsv-cvsg）作为诊断抗原建立elisa检测方法，具有许多使用全病毒作为包被抗原无法比拟的优点，首先，在检测时无需操作病毒和培养细胞，降低了生物安全的风险与生产条件的要求；其次，携带狂犬病毒g蛋白的vsv骨架假病毒表达量大、易于纯化，便于大规模的产业化生产；第三，使用最主要诱导产生中和抗体的抗原vsv-cvsg作为包被抗原，其检测结果能更好的反应体内的中和抗体水平。最后，假病毒比全病毒的稳定性好，使该方法易于保存和推广。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种狂犬病毒中和抗体的elisa检测方法，旨在克服现有技术中操作繁琐、存在较高的生物安全风险、生产条件高、不便于大规模产业化生产等不足。
2、本发明解决上述问题的技术方案具体如下：
3、一种狂犬病毒中和抗体的elisa检测方法，其特征在于，所述方法包括抗原制备、抗原纯化、酶标板制备、样本检测、观察结果等步骤。
4、优选的，所述抗原制备方法为：从ncbi下载狂犬病毒g蛋白序列（af085333.1）并进行密码子优化，进行重组质粒载体构建，构建好的重组质粒载体转化至感受态细胞，使用qiagenendofreeplasmidmaxikit提取质粒，转染至细胞培养24h后，使用商品化vsv-g感染细胞使其g蛋白被狂犬病毒g蛋白替代，最终可得到携带狂犬病毒g蛋白的vsv假病毒，即vsv-cvsg。
5、优选的，对所述的假病毒抗原进行纯化，包含以下纯化步骤：
6、（1）将收集的假病毒上清进行7500r/min，15分钟离心，以去除上清中的死细胞及细胞碎片。
7、（2）将离心过后的上清用0.45μm的滤膜过滤，进一步去除上清中的杂质。
8、（3）每30ml假病毒初始液，加入40%peg8000母液7.5ml，20%nacl母液7.5ml，混匀；4℃放置过夜；12000rpm，离心1h；吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；加入1ml完全培养基溶解假病毒沉淀；
9、（4）将重悬液收集到1.5ml的ep管中，准备新的eppendorf的15ml的ep管，加入预冷的过滤除菌的20%的蔗糖溶液11ml，再向蔗糖溶液顶端轻轻加入1ml的病毒重悬液，将加好的15ml的ep管放入适配的转头中离心，4°c，5591g，离心18小时。
10、（5）离心结束后，弃掉上清，用dmem重悬沉淀，并分装到pcr管中，5μl每管，分装后标记，并-80°c冻存，同时对浓缩后的病毒进行毒价测定。
11、优选的，所述酶标板制备方法为：以105tcid50/ml的纯化vsv-cvsg包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜，1%bsa37℃封闭90min，洗涤液洗板3次，晾干。
12、优选的，所述密码子优化后的g蛋白序列如seqno.1所示。
13、优选的，所述样本检测步骤包含以下步骤：
14、（1）加待检血清：用稀释液将被检血清作倍比稀释，在每个稀释梯度取100μl样品加入包被好抗原的酶标板孔中，同时作空白对照和阴性对照，37℃放置0.5-2h，洗涤液重复洗板3次（每次每孔250μl），洗涤同上。
15、（2）加酶标二抗：加对应的辣根过氧化物酶标记的抗体，每孔100ul，37℃放置0.5-2h，洗涤液（pbst）重复洗板3次（每次每孔250μl）。
16、（3）加底物液显色：显色液100μl，室温暗处10－15分钟。
17、（4）加终止液：每孔50μl。
18、本发明的有益效果在于：该方法使用携带狂犬病毒g蛋白的vsv骨架假病毒（vsv-cvsg）作为诊断抗原建立elisa检测方法，具有许多使用全病毒作为包被抗原无法比拟的优点，首先，在检测时无需操作病毒和培养细胞，降低了生物安全的风险与生产条件的要求；其次，携带狂犬病毒g蛋白的vsv骨架假病毒表达量大、易于纯化，便于大规模的产业化生产；第三，使用最主要诱导产生中和抗体的抗原vsv-cvsg作为包被抗原，其检测结果能更好的反应体内的中和抗体水平。最后，假病毒比全病毒的稳定性好，使该方法易于推广。