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2018.03.21
Tips：
病原检测基本原理
各个技术应用实例
病原学检测技术来自VETMOOC00:0010:31
仔细想想，疫病诊断的过程就像警察办案抓坏人的过程，病原学的检测就是使用各种生物学技术找到“坏人”留下的蛛丝马迹，找到病原体本身，或是其构成份（核酸、蛋白等），然后把证据坐实（确诊）。在进入到实验室诊断之前，其实已经有“警察”的现场办案或实地走访的过程了——大致会有一个怀疑对象或是怀疑方向。农场背景越清楚，疫病发生情况越了解，剖检症状越典型，最后实验室阶段检测的项目越少；反之，前面这个流程中获得信息越少，发病越不典型，后期排查的内容越多。
【PCR/RT-PCR技术】
PCR中文名是酶聚合链式反应（PolymeraseChainReaction），使用DNA聚合酶在特异性引物存在的情况下，以母链DNA为模板，通过碱基互补配对的方式，在体外合成子链DNA，是一个DNA体外合成，指数倍扩增放大DNA数量的过程。其以特定引物为延伸起点，通过变性——退火——延伸三个步骤多次循环（一般25-40个）完成。
由于PCR只能扩增DNA分子，如果病原是RNA病毒，想要进行PCR就需要先进行反转录，即将以RNA为模板使用反转录酶和下游引物（或随机引物和oligodT）将而RNA反转录（RT）为互补cDNA，然后再以cDNA为模板进行PCR，这就是RT/PCR。
PCR能够用于诊断检测，其核心原理利用的就是已知的引物与待检DNA模板之间的特异性匹配，例如一对检测伪狂犬病病毒（PRV）的引物只和PRV的DNA产生火花（能够特异性扩增），对圆环病毒（PCV2）的DNA是看不上眼，不会搭理的。
疫病检测其优点具体表现为客观、快速、特异和敏感，若方法得当还可用于区分一些病毒中的不同毒株。因此，目前它一直排在诊断实验室病原诊断的第一位。但它的缺点一样明显，首先PCR检测的是核酸，不管病原是死是活，PCR检测到不一定代表还具有感染性，其次由于PCR非常敏感，而PCR产物中有含有海量的拷贝数，因此很容易由于污染造成假阳性，再者，由于是分子生物学反应，加完样品，设置好反应程序基本就听天由命，非常容易出现假阴性。
所以PCR在设计和操作过程中有一些需要非常注意的坑。
首先设计过程中，引物锚定的区域应选择毒株较为保守的区域，选拷转录过程中考贝数多的基因（比如PRRSV的ORF7N蛋白基因），对于有毒株间差异的个别位点可以使用简并引物，提升引物的兼容性，同时要注意引物的特异性和区分性，不能和其他病原体，机体基因组有非特异性扩增。
PCR检测过程中要注意试剂的冰上操作，减少上机前的非特异扩增，做好阴阳性对照，阳性对照要从核酸提取就加入，不能仅在PCR阶段设置对照，这样不能说明核酸提取和反转录（RT-PCR中）是否出现问题。引物应避免反复冻融造成降解。在有非特异性条带或抹带时，可以尝试降落（退火温度递减）PCR或两步法PCR。
【RealtimePCR】
RealtimePCR技术是通过动态监测PCR过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，又叫作定量PCR。
--普通PCR由于有产物堆积无法精确定量--
通常会用Taqman探针或者SBYR染料，因为反应过程中机器是收集插入双链DNA中SBYR染料或者是Taqman探针跟模板结合后放出的荧光信号，DNA越多，荧光信号越强，根据循环数和荧光强度建立线性关系去计算初始模板的量。所以又叫荧光定量PCR。
RealtimePCR中最重要的概念就是Ct值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)。复杂公式不讲，在最疫病检测的时候Ct值和病原核酸拷贝数是反着的，Ct值越低说明初始模板浓度越高。就好比都是达到一个亿的小目标，你本金越多，需要翻倍的次数越少，像作者这样翻30-40个倍还不见起色的，就认为是阴性了。
敏感性更强，可根据Ct值初步判断数量级，建标准曲线可精确定量，不用开盖跑胶，省事，减少污染风险。炫富炫技体现检测者有钱高大上。缺点：贵，一般目标片段较小，不方便直接测序，太敏感更容易污染。没有电泳图，Ct值跟核酸模板量成反比，比较不直观。
【序列测定】
PCR条带可能是非特异的扩增，需要测序验证；基因测序可确诊，可排除污染；测序确定毒株种类和亲缘关系。
病毒常规测序基因:PRRSV：nsp2和ORF5;CSFV：E2;PCV2：ORF2；豪友可以测全基因组（如果真要做重组分析只能这样）。
【免疫荧光（IFA）】
IFA主要是利用抗原抗体反应的特异性，在病原体和又它刺激产生的抗体之间知道其一测定另一个。
病毒接种易感细胞—>增殖培养—>固定接种后的细胞—>加特异性单（多）抗或临床血清-->加荧光标记抗体。
比如可以用于PRRSV分毒后的确诊，也可以用已知PEDV接细胞后用来测血清是否有抗体。
【深度测序】
对于一些很难预判的病例或是可能的新病原体感染或是变异株感染，可以将用二代测序技术一股脑全测了，然后通过生物信息学技术比对看里面有什么算什么，一般根据read数来判断谁可能是主要病原，再做常规PCR验证。深度测序主要是在复杂和未知情况下寻找线索。最近华山报道的伪狂犬感染病例，还有蝙蝠当中很多新病毒的发现都是用的这个技术。
【病毒分离】
将病料血清等感染材料接种病原体的易感细胞，分离病原体。这个多为科研目的，或是打的集团想分离自家病毒做驯化，其周期较长，不适合做快速诊断。
【Bioassay（易感动物感染）】
将病料血清接种易感动物，产生一些特异性的表现，比如如果有伪狂犬病毒，接种家兔后其表现出奇痒，也可以将阴性的哨兵动物放入猪群监测哨兵动物的血清转阳情况来评估猪群中是否在排毒。---这是科赫法则在临床诊断中的一个实操，净化过程常用。