本发明属于分子生物学和兽医学领域，尤其涉及诊断猪繁殖与呼吸综合征变异株的的多重荧光定量引物和探针组合及其应用。
背景技术：
1、刚地弓形虫(toxoplasmagondii，tg)与汉塞巴尔通体(bartonellahenselae，bh)是两种严重威胁人类和多种动物生命健康的人畜共患病的病原体，可引起弓形虫病(toxoplasmosis)和猫抓病/猫抓热(csd)。猫在这两种病原的传播中扮演着重要的角色，它是这两种病原体的共同易感宿主。近年来，随着我国宠物猫饲养数量的增多，且其中多为女性，有关人感染弓形虫病和猫抓病的报道逐年增多。因此，针对tg与bh的早期确诊十分重要，对于这两种病原体所引起的人畜共患病的研究具有重要的公共卫生学意义。
3、病原学诊断是最早建立的弓形虫诊断方法，操作简单，结果可靠，但耗时较长，检出率低，易漏检，且无法满足快速，高效，批量检测的需求，因此在实验室诊断方面应用逐步减少。免疫学检测方法以elisa和iha方法为主，依靠检测血清样本中抗寄生虫特异性igm或者igg，但市售的大多数试剂使用的是本地分离株或rh株生产的抗原，这就导致结果可能存在准确性的偏差，并且灵敏度不高。分子生物学方法与传统的病原学检测方法相比，在检测速度，通量，特异性，敏感性各方面都有提升，同时也极大的提高了检测的灵敏度，是未来弓形虫病实验室诊断的主要发展趋势。
5、感染bh的猫多数不会有任何临床症状的表现，不易被主人察觉，从而成为潜在的安全隐患。并且由于人类对csd的认知不足，即使猫感染发病后，往往也容易造成误诊(魏育今.猫抓病误诊7例分析[j].中国误诊学杂志,2006(12):2336-2337.)。人体感染汉赛巴尔通体后是否出现相应的临床症状，取决于感染者自身的免疫力。但该病临床表现呈多样化，轻症病例占较大比例，依据临床症状进行诊断的难度大，因此早期诊断是十分必要的。血清学试验诊断：ifa是目前常用的方法之一，对csd的诊断有一定作用,但由于不同实验室对ifa的操作及技术存有差异,因此可能会导致一些误诊或漏诊。
6、聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。pcr方法己广泛用于病原微生物的快速检测，在bh的检测中也得到大量的应用。目前被认为是最直接、准确、有效的方法。pcr法具有敏感性高、特异性强的特点，通过对人体组织中bh基因序列的检测，可确定人体bh的感染。但这种特异性及敏感性高的方法实验条件要求较高，难以作为临床常规检查。
7、多重荧光定量pcr以taqman探针定量分析的原理为基础，具有准确、定量、灵敏度高、特异性强等优点，其灵敏度更是常规pcr的10～100倍，可以实现在一个反应管内，同时对多个病原特异性扩增，不仅保证了诊断结果的准确性与时效性，并且检测效率极大的提高，同时也降低了人力成本，性价比极高。虽然多重荧光定量pcr已广泛进入人们的视野，但是目前还存在两个难以解决的痛点：一是想要研发出一套稳定、高效且特异的引物探针组合异常困难，多个目标基因在同一体系中完成同时扩增，并不仅仅是单一pcr引物的简单混合，决定性因素是引物设计，除了每对引物扩增的特异性与效率要兼顾，此外，还要尽可能减少引物对间形成二聚体，形成拮抗。同时，还要充分优化各组引物的浓度配比、退火温度等其他反应条件；二是多重荧光定量pcr对于操作人员的素质有较高的要求，操作人员如果没有经过足够的训练，容易出现假阳性、假阴性等结果，并且还容易导致实验室环境污染。
技术实现思路
2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
3、第一方面，提供了用于鉴别诊断tg/bh中至少一种的引物对与探针组合，包括：
4、(1)针对tgb1基因的引物对和探针，其引物对如序列1和序列2所示，探针序列如序列3所示；
5、(2)针对bh16srrna基因的引物对和探针，其引物对如序列4和序列5所示，探针序列如序列6所示；
6、优选的是，用荧光标记对探针的两端进行修饰，其中，序列3的5’端用fam修饰，3’端用bhq1修饰；序列6的5’端用hex修饰，3’端用bhq1修饰。
7、上述任一方案优选的是，采用18srrna作为内标，设计了鉴别tg/bh的内标引物和探针。
8、上述任一方案优选的是，内标引物对序列分别如序列7和序列8所示，探针序列为序列9所示；并对内标探针两端进行荧光标记修饰，其中5’端用rox修饰，3’端用bhq2修饰。
9、第二方面，本发明进一步提供一种用于鉴别诊断tg/bh中至少一种的试剂盒，包括上述第(1)至第(2)项的靶标检测引物和探针的组合，还有内标的引物和探针组合。在具体实施方式中，将各引物对与相应的探针单独包装，或混和包装。
10、优选的是，所述试剂盒中引物对与探针以预混液包埋，其中mn2+2.5mm；引物和探针的浓度：序列1、序列2所示引物各0.3μm，及序列3所示探针0.2μm；序列4、序列5所示引物各0.3μm，及序列6所示探针0.2μm；序列7、序列8所示引物各0.3μm，及序列9所示探针0.2μm。
11、上述任一方案优选的是，还包括裂解提取液和样本洗涤液。具体地，所述裂解提取液的主要成分为：3mgu.hcl、30％异丙醇、1％triton-x100、0.8mnacl、3％tween20、3mmedta、和12mmtris.hcl。样本洗涤液可以装配本领域常规使用的洗涤液。
12、在具体实施方法中，本发明的检测可以针对tg/bh一种或多种，即可实现对其中一种，两种靶标的同时检测，从而可实现对tg/bh的鉴定。
13、本发明的引物对和探针在鉴别诊断tg/bh病原时，可以但不限于应用于本技术人此前申请的中国专利202010147432.0所述的检测卡盒，以实现all-in-one一体化检测。该专利申请所述的检测卡盒内，设置了多个分离腔体，柱塞阻断相邻分离腔体，裂解液、洗涤液和反应液分别灌装在各分离腔体内；检测时，通过推动各个柱塞，使柱塞孔对准并分离腔体，进而导通各个分离腔体，随后利用电磁控制的方式，控制试剂盒内的磁珠并带动待测样本的核酸，依次通过各个分离腔体，裂解并吸附核酸后依次进行清洗与反应，最后从外部进行对反应液中的基因的光学检测。
14、第三方面，本发明同时提供了一体化检测、鉴别或诊断tg/bh病原的检测卡盒，其特征为卡盒内自上而下设置的四个分离腔体的小室，其中样本的裂解与核酸的提取在第一个小室内；贮存样本洗涤液i在第二个小室，用于第一次核酸洗涤；样本洗涤液ii贮存在第三个小室，用于第二次的核酸洗涤；所述试剂盒中的试剂贮存在第四个小室内，用于多重荧光定量pcr反应。
15、在一个具体实施过程中，各室之间通过柱塞阻断，柱塞孔对准分离腔体，并通过电磁控制，使试剂卡盒内的磁珠带动待测样本得核酸依次通过各个分离腔体。
16、第四方面，本发明还提供鉴别诊断tg/bh中至少一种的引物对与探针组合在制备检测tg/bh试剂的应用。