65例犬大颗粒细胞淋巴瘤（2005-2023年）
翻译：徐晋
摘要
1简介
犬淋巴瘤是一种异质性疾病，可呈现不同的临床表现、形态和行为。根据组织病理学和免疫组织化学(IHC)，采用世界卫生组织(WHO)或更新的Kiel系统进行淋巴瘤亚型分类，有助于治疗选择和预后判断。免疫表型在很大程度上取决于解剖形态，B细胞淋巴瘤多见于多中心型，T细胞亚型多见于胃肠道、纵隔和趋上皮皮肤型。由于组织病理学和IHC需要有创操作，如淋巴结切除或活检，因此细胞病理学被认为是诊断淋巴瘤的一种合法且耗时较少的诊断技术，但其局限性包括无法评估淋巴结结构或准确的有丝分裂指数(MI)。
2材料和方法
2.1病例选择
根据细胞学或组织病理学确诊为LGLL的犬，我们对皇家兽医学院皇太后医院(QueenMotherHospitalforAnimals，英国)2005年至2023年的医疗记录进行了审查。如前所述，大颗粒淋巴细胞被定义为中间型(细胞核1.5-2.0个红细胞[RBC]直径)到大型(细胞核＞2个红细胞直径)淋巴细胞，其中含有嗜天青的细胞质颗粒。如果肿瘤群体包含小淋巴细胞或如果只有外周血(PB)或骨髓(BM)受累，则排除犬。本研究获得了研究所伦理审查委员会的批准(URNSR2023-0070)。
2.2临床数据
临床资料包括年龄、性别、是否绝育、品种、体重、症状和体格检查结果。我们收集了诊断时的临床病理和诊断性影像学数据，以及随访数据（如有条件）。
根据主治医师的意见进行了全面分期，但这并非纳入试验的必要条件。由于回顾性数据分析的局限性、不完整的分期以及常见的多灶性器官或组织受累，我们没有根据世界卫生组织(WHO)分期系统为每个病例确定临床分期。如果有足够的信息，根据影像学和细胞学/组织病理学数据中肿瘤负荷的主要位置，回顾性分配每个病例的淋巴瘤原发解剖部位。如果有多灶性器官或组织受累，而肿瘤负荷的主要位置不明显，则淋巴瘤被归类为“弥散性”。在可能的情况下，记录有无外周血和/或骨髓浸润。根据WHO系统，所有病例均归为a或b级。
组织病理学报告(由委员会认证的病理学家撰写)经过审核，以获得包括形态特征、分级和IHC染色结果在内的信息。如前所述，低、中、高级别淋巴瘤的定义基于每40个目标的MIs为0-5、6-10和10。此外，还获得了抗原受体重排聚合酶链反应(PARR)和流式细胞术(FC)检测结果。
2.3细胞学检查
在有条件的情况下，由委员会认证的临床病理学家(E.J.H)审核每个病例的改良瑞氏染色切片。记录了以下特征：(a)肿瘤淋巴细胞大小(中间型[细胞核1.5-2.0个红细胞直径]vs.大型[细胞核＞2个红细胞直径])，(b)细胞核形状(圆形，圆形凹陷，凹陷，凹陷-复合体，复合体)，(c)核仁(有vs.无)，(d)细胞质空泡(无，低，中，明显)，(e)颗粒大小(细，小，中或大，根据每个样本中记录的最大颗粒大小)，(f)每个细胞的颗粒数量(0-5,6-10,11-15，或根据每个样本中的最高计数16-20)，以及(g)有胞浆颗粒的肿瘤淋巴细胞百分比。
2.4统计分析
由于本回顾性研究中未使用细胞系，因此未进行细胞系验证。
3结果
3.1病患特征
在医学数据库中初步鉴定出67只犬。2只犬因仅有PB受累而被排除，其中1只还表现出小-中等淋巴细胞大小。因此，最终纳入了65只犬。中位年龄8.9岁(1.3-14.8岁)，平均体重23.3kg(SD,11.0kg)。雄性未去势10例(15.4%)，雄性去势23例(35.4%)，雌性未绝育3例(4.6%)，雌性绝育29例(44.6%)。共有28个品种，最常见的是拉布拉多猎犬(n=19[29.2%])，混血犬(n=5[7.7%])，边境牧羊犬(n=4[6.2%])，金毛猎犬(n=4[6.2%])和斯塔福德郡牛头(n=4[6.2%])。
3.2临床病理表现
3.3诊断、分期和细胞学评估
65只犬初诊时均行诊断性影像学检查，其中40只(61.5%)行双腔影像学检查。58只犬(89.2%)可确定原发解剖部位。其中肝脾型19例(32.8%)，胃肠道型12例(20.7%)，弥散型12例(20.7%)，纵隔型5例(8.6%)，外周型2例(3.4%)，肺型2例(3.4%)，肝、肾、鼻、外周神经系统(双侧三叉神经)、中枢神经系统(CNS)以及心包部位各1例(1.7%)。17只犬(26.2%)发现肿瘤性积液并经细胞学证实；10只犬(15.4%)出现腹腔积液，5只犬(7.7%)出现胸腔积液，1只犬(1.5%)同时出现腹腔和胸腔积液，1只犬(1.5%)出现心包积液。20只(30.8%)犬出现骨髓受累(4只)或外周血受累(15只)，其中1只同时出现骨髓和外周血受累。
我们对64只犬进行了细胞学检查，对63只犬进行了LGLL诊断(图1)。2只犬的诊断是基于组织病理学。9只犬同时进行了细胞学和组织病理学检查。组织病理仅1例(9.1%)可见嗜天青颗粒。51例进行了细胞学检查，结果总结于表2。
8只犬可进行组织学分级；LGLL分级：低级别7例(87.5%)，中级别1例(12.5%)。5例行CD3、CD18、CD79a和磷钨酸-苏木精(PTAH)免疫组织化学染色。4例行聚合酶链反应(pcr)检测抗原受体重排，8例行FC检测。在通过IHC、PARR或FC确定免疫表型(n=16[24.6%])的情况下，13只犬(81.3%)确认了T细胞免疫表型/克隆性T细胞受体γ链基因重排，3只犬(18.7%)确认了无细胞免疫表型。表3总结了免疫表型数据。
3.4治疗和结果
在32只接受MTDC治疗的犬中，22只(68.8%)接受了基于洛莫司汀的治疗方案。其中洛莫司汀、长春新碱、丙卡巴嗪、泼尼松龙(LOPP)4例；左旋门冬酰胺酶LOPP4例；洛莫司汀、长春新碱、泼尼松龙(LOP)2例；左旋门冬酰胺酶LOP3例；洛莫司汀、泼尼松龙(LP)2例；含左旋门冬酰胺酶的LP2例；阿糖胞苷、长春新碱、洛莫司汀、泼尼松龙2例；左旋门冬酰胺酶、阿糖胞苷、洛莫司汀、泼尼松龙1例；阿糖胞苷、洛莫司汀、泼尼松龙1例；左旋门冬酰胺酶、洛莫司汀、多柔比星、泼尼松龙(1例)。不基于洛莫司汀的化疗方案包括：长春新碱、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松龙(CHOP)3例；阿糖胞苷、长春新碱2例；左旋门冬酰胺酶、长春新碱、环磷酰胺、泼尼松龙1例；左旋门冬酰胺酶、长春新碱、阿糖胞苷1例；左旋门冬酰胺酶、长春新碱1例；长春新碱1例；阿糖胞苷1例。
可在27只犬中评估治疗反应。20只(74.1%)对诱导化疗有反应，其中CR1只(3.7%)，PR5只(18.5%)，临床反应14只(51.9%)。1只犬(3.7%)病情稳定，6只犬(22.2%)病情发展。没有关于仅用泼尼松龙治疗的犬的治疗反应数据。
9只犬在疾病发展时接受了抢救方案。治疗方案：多柔比星、泼尼松龙2例；长春新碱、环磷酰胺、泼尼松龙1例；甲氨蝶呤、放线菌素d、阿糖胞苷、地塞米松1例；左旋门冬酰胺酶、阿糖胞苷、环磷酰胺、泼尼松龙1例；左旋门冬酰胺酶、洛莫司汀、阿糖胞苷、泼尼松龙1例；左旋门冬酰胺酶、阿霉素、环磷酰胺、泼尼松龙1例；马西替尼、多柔比星、洛莫司汀1例；苯丁酸氮芥、泼尼松龙1例。
6只犬对挽救化疗有反应。5只犬(83.3%)被证实有反应，其中2只(33.3%)为PR，3只(50.0%)为临床反应。1只(16.7%)犬出现疾病发展。
3.5预后因素
仅接受皮质类固醇治疗的犬(n=11)和接受MTDC治疗的犬(n=32)的PFI和OST中位数在数值上没有显著差异(PFI分别为10天[范围，0-481]和26天[范围，0-408][p=.353]；OST分别为7天[范围，4-532]和28天[范围，3-421][p=.585])。MTDC治疗犬6个月和1年生存率分别为9.4%和3.1%。
4讨论
本研究首次描述了大样本LGLL犬的临床表现、细胞学特征、治疗结果和预后因素。与以往的病例报告或系列研究相似，本研究证实了犬LGLL的预后较差，接受MTDC治疗的犬的中位OST为28天，这与患有其他侵袭性淋巴瘤(如肾淋巴瘤)的犬相似，并且比患有中枢神经系统或消化系统淋巴瘤的犬短。在接受皮质类固醇和化疗的犬之间，以及对MTDC有反应和没有反应的犬之间，中位OST存在数值上的差异，但在统计学上不显著，但这些差异在更大的队列中可能达到显著性。
在我们的研究中，大多数(93.8%)犬在诊断时处于b期，反映了LGLL的侵袭性生物学行为，以结外形式和T细胞免疫表型为主。众所周知，与多中心B细胞淋巴瘤相比，患有多中心T细胞淋巴瘤或结外淋巴瘤的犬更容易出现临床不适。高钙血症常导致T细胞淋巴瘤患犬出现临床症状，但考虑到本研究中离子性高钙血症的发生率较低(2.3%)，这不大可能导致犬出现临床症状的比例较高。亚分期不具有预后意义，原因可能是临床表现良好的病例数量较少(6.2%)，因此统计学功效较低。
8例LGLL中，7例(87.5%)具有中等-大细胞大小和侵袭性生物学行为，但根据WHO标准，LGLL的组织学分级为低级别。这与之前报道的LGLL病例相似。12例行组织病理学检查，其中10例(83.3%)为低级别，2例(16.7%)为高级别。尽管在组织学上表现为低级别肿瘤，犬LGLL遵循生物学上的高级别临床过程，预后较差。11例进行组织病理学检查的病例中只有1例可见嗜天青的细胞质颗粒，这突出了细胞学检查在诊断和认识LGLL临床意义中的重要性。
在免疫表型方面，T-LGL最常表达CD3、CD8和TCRα/β，偶尔也可表达CD4+/CD8-或CD4-/CD8-伴有TCRγδ限制。自然杀伤LGLL的表面CD3、CD4和CD8通常为阴性，T-LGLL和NK-LGLL的颗粒酶B和M均为阳性。在进行免疫表型分型的16只犬中，81.3%的LGLL被证实为T细胞LGLL。行FC检查的5例病患中，4例CD4-/CD8-，1例CD4+/CD8+。1只犬行CD11d检测，结果为阴性，未检测TCRγδ。根据CD3及其他淋巴细胞标志物的表达情况，3例为裸细胞。这些病例可能是NK-LGL起源，但由于PARR并不是用来排除T细胞抗原受体复合物表达完全缺失的T-LGL，因此这一点不能得到证实。在既往的兽医文献中，多数LGLL病例为CD4-/CD8-、CD11d+和γδ+，符合脾红髓起源，以肝脾LGLL居多；但CD4、CD8、CD11d等标志物的表达在病例间存在差异。因此，目前尚不清楚是否所有LGLL病例均起源于脾红髓，免疫表型可能取决于解剖形式。
本研究的主要局限性与其回顾性性质有关。在一些病例中，从医疗记录中获得的数据不完整，治疗和监测方法没有标准化。并非所有病例均有完整的分期；大多数病例没有完整的免疫表型分型。由于样本量相对较小，统计分析的功效可能有限。鉴别淋巴瘤浸润到外周血和/或骨髓的犬与淋巴样白血病的犬可能具有挑战性，特别是缺乏一致的定义。然而，为了尽量减少在我们的研究中无意中纳入白血病病例(特别是LGLCLL)的风险，如果肿瘤淋巴细胞体积小或者如果仅累及外周血或骨髓，则排除了这些病例。
图1大颗粒细胞淋巴瘤病例的细胞形态学，改良瑞氏染色，100×物镜(A)中间型淋巴细胞，细胞核圆形，直径约1.5个红细胞，染色质呈团块状，核仁不明显，胞质中量淡蓝色，常含有中量品红细颗粒。(B)中间型淋巴细胞，细胞核圆形，直径约1.5个红细胞，染色质细点状，核仁不明显，胞质少量深蓝色，细胞数量少，含有中等数量的品红小颗粒。(C)大淋巴细胞，细胞核圆形或凹陷，直径约2-2.5个红细胞，染色质粗点状，核仁1-2个，胞质中蓝色，细胞数量少，含有少量的品红小颗粒。(D)大淋巴细胞，核圆形至凹陷，直径约2个红细胞，染色质细点状，核仁不明显，胞质少量深蓝色，偶有细胞含有中等数量的品红小颗粒。常可见核分裂象。RBC，红细胞。
异常
犬只数
占比（％）
血液学(n=62)
贫血
24
38.7
中性粒细胞增多症
单核细胞增多症
23
37.1
淋巴细胞减少症
21
33.9
血小板减少症
17
27.4
循环肿瘤淋巴细胞
16
25.8
中性粒细胞减少症
8
12.9
生物化学(n=63)
低白蛋白血症
40
63.5
ALT升高
37
58.7
高胆红素血症
36
57.1
ALP升高
35
55.6
总钙降低
26
41.3
低球蛋白血症
33.3
低胆固醇血症
27.0
高磷酸血症
13
20.6
淀粉酶升高
肌酸激酶升高
高乳酸血症
尿素氮升高
低血糖
12
19.1
C反应蛋白升高
11
17.5
高氯血症
7
11.1
高胆固醇血症
凝血(n=22)
PT和APTT延长
4
18.2
仅PT延长
3
13.6
仅APTT延长
表1大颗粒细胞淋巴瘤患犬诊断时常见的血液学、生化和凝血异常。
缩略词：ALP，碱性磷酸酶；ALT，谷丙转氨酶。
分类参数
淋巴细胞大小
中间
19
37.3
大
32
62.7
核形态
圆形-锯齿状
34
66.7
圆形
21.6
锯齿状
7.8
锯齿状-复合形状
2
3.9
核仁
存在
31.4
无
68.6
胞质空泡
5.9
少
15.7
中度
明显
粒度大小
正常
1
2.0
小
70.6
中等
25.4
每细胞颗粒数
0-5
6-10
47.0
11-15
16-20
连续参数
中位数
范围
颗粒状肿瘤淋巴细胞/例(%)
20
1-95
表251例犬大颗粒细胞淋巴瘤细胞学特征。
缩略词：HPF，高倍镜视野。
病例
解剖形态
免疫表型
PARR
免疫组织化学
流式细胞术
肝脾
T细胞
克隆TCR基因重排
–
弥散性
5
无法确定
6
CD3+
胃肠道
CD3+,CD79a-
9
纵膈
CD3+,CD45+,CD4-,CD5-,CD8-,CD21-,CD79a-,CD34-,MHC-II-
10
CD3+,CD4+,CD5+,CD8+,CD45+,MHC-II+,CD21-,CD79a-
CD3+,CD45+,CD4-,CD5-,CD8-,CD21-,CD79a-,CD34-,CD11d-
CD3+,CD45+,MHC-II+,CD4-,CD5-,CD8-,CD21-,CD79a-,CD34-
14
肾
裸细胞
CD3-,CD79a-,CD18-
CD3-,CD21-
15
CD45+,CD3-,CD4-,CD5-,CD8-,CD21-,CD79a-,CD34-,CD11d-
CD45+,CD34+(弱),CD3-,CD4-,CD5-,CD8-,CD21-,CD79a-,MHC-II-,CD14-,MPO-,MAC387-
表316只犬大颗粒细胞淋巴瘤免疫表型数据。
缩略词：IHC,免疫组织化学；MPO，髓过氧化物酶；PARR，抗原受体重排聚合酶链反应；TCR,T细胞受体；-，未进行。
进展
指标（犬只数）
PFI(天)
p值
HR(95%CI)
否(n=23)
47
0.028
2.74(1.11-6.73)
是(n=7)
否(n=18)
48
0.033
2.41(1.07-5.41)
是(n=12)
外周血受累
否(n=24)
0.022
3.35(1.29-9.45)
是(n=6)
对治疗反应
否(n=7)
0.09
0.43(0.18-1.13)
是(n=20)
49
存活
OST(天)
61
0.035
2.60(1.07-6.31)
0.071
2.10(0.94-4.71)
38
0.014
3.63(1.30-10.10)
中间(n=7)
101
0.088
2.23(0.89-5.62)
大(n=16)
0.099
0.46(0.19-1.16)
70
表4单变量Cox回归分析结果(p≤.10)纳入多变量分析的大颗粒细胞淋巴瘤患犬接受最大耐受剂量化疗的进展和生存预后因素。
皮肤科之星
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