犬瘟热病毒CDV-3株由中国农业科学院特产研究所动物疫病研究室保存；293T和Vero细胞由中国农业科学院特产研究所动物疫病研究室保存。
培养液DMEM、青链霉素和小牛血清FBS，均购自Gibco公司；真核表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司；克隆载体pEASY-Blunt或pEASY-Simple-Blunt、高保真酶TransStartFastPfuDNA聚合酶和FITC标记的羊抗鼠二抗购自北京全式金生物技术有限公司；各种限制性内切酶和T4DNA连接酶均购自Thermo公司；转染试剂LipofectamineTM2000和反转录试剂盒SuperScriptⅢFirst-StrandSynthesisSuperMix购自Invitrogen公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，购自AXYGEN公司；RNeasyMiniKit和EndoFreePlasmidMaxiKit购自QIAGEN公司；抗体CDV-NP购自VeterinaryMedicalResearchandDevelopment公司。
转染前24h，于6孔板中接种2×105个293T细胞/孔，第2天细胞生长密度至80%以上，开始转染，每个质粒用量为：全长质粒pcDNA3.2-CDV-35μg，辅助质粒pcDNA3.1-N1μg，pcDNA3.1-P0.8μg和pcDNA3.1-L0.5μg，转染试剂22μL。按照LipofectamineTM2000说明书进行操作。共转染3h，更换为含10%FBS的DMEM细胞培养液，37℃、5%CO2条件下培养72h。刮取细胞悬液，取300μL至单层Vero细胞，观察细胞病变。出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液。
将收获的rCDV-3病毒液接种至Vero细胞，培养72h。用4%多聚甲醛固定细胞，0.5%TritonX-100通透细胞，一抗CDV-NP作用1h，加入FITC标记抗羊抗鼠IgG荧光二抗染色。最后，DAPI染核，在荧光显微镜下观察绿色荧光。分别提取wtCDV-3和rCDV-3的总RNA，反转录合成病毒基因组cDNA。根据P-M处设计引物(JD-F：5′-TGGTATTACTCTGGGCTCA-3′和JD-R：5′-CTTTGAACATGCTCAAATTA-3′)，以各自的cDNA为模板，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳后回收片段，用PmeⅠ酶切。rCDV-3由于基因组中被人为引入PmeⅠ位点，因此可以被切割开；而wtCDV-3序列中并无PmeⅠ位点，无法被切割。分别取病毒wtCDV-3和rCDV-3上清液100μL，磷钨酸负染，电子显微镜观察和比较两种病毒粒子的形态大小。
将rCDV-3在Vero细胞上传代10次，取每一代病毒液300μL，测定TCID50。在Vero细胞上分别按感染复数(MOI=0.1)接种wtCDV-3和rCDV-3，35℃、5%CO2培养5d。于感染后12、24、48、72、96、120h，分别取病毒液上清和细胞，测定上清和细胞中病毒的TCID50。以上试验至少重复3次。
本研究成功通过优化病毒拯救系统，成功建立犬瘟热病毒疫苗株CDV-3株反向遗传平台。研究结果表明，通过该平台拯救获得的重组病毒rCDV-3具有增殖快、滴度高的特点。