本发明涉及恶性肿瘤血液学诊断技术领域，具体的说，涉及氨基酸联合因子在构建结直肠癌血液学诊断模型中的应用，更具体涉及基于色氨酸(trp)、肌氨酸(sar)、谷氨酸(glu)建立的联合因子在构建结直肠癌血液学诊断模型中的应用。
背景技术
结直肠癌(colorectalcancer，crc)，又称大肠癌，为消化系统常见的恶性肿瘤。2008年，全球结直肠癌新发病例超过120万人，死亡病例超过60.87万人[jemala,brayf,centermm,etal.globalcancerstatistics.ca:acancerjournalforclinicians,2011,61(2):69-90.]；新发病例排名常见肿瘤的第三位，死亡病例排名肿瘤死亡的第四位[qiuyp,caigx,summ,etal.serummetaboliteprofilingofhumancolorectalcancerusinggc-tofmsanduplc-qtofms.journalofproteomeresearch,2009,8(10):4844-4850.]。
基于代谢组学发现结直肠癌的肿瘤生物标志物，具有无创或微创、取样量少、易于实施、简便快捷等诸多优点，且患者依从性好，适用于进行大规模的人群筛查。氨基酸(aminoacid)在机体新陈代谢中起着重要的作用，对于维持正常的细胞功能和生物生存至关重要。血液、尿液和体液样本中的氨基酸失衡对于临床生化常规检查具有重要意义。随着肿瘤细胞代谢的改变而发生变化的氨基酸，可能涉及原发肿瘤的形成、生长和浸润转移等情况。已有文献报道结直肠癌患者和健康志愿者的血液、尿液和粪便中氨基酸的组成不同，在癌组织与正常组织之间的氨基酸组成也存在一定的差异性。液相-串联质谱联用检测方法同时使用液相色谱分离和质谱离子对检测，具有灵敏度高、特异性强的特点。因此，基于液相-串联质谱联用检测方法(liquidchromatography-tandemmassspectrometry，lc-ms/ms)的靶向代谢组学研究结直肠癌患者血液中的内源性氨基酸代谢谱变化，寻找其变化规律，发展成为肿瘤生物标志物，对于结直肠癌的诊断有着重要的临床价值和现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于，依托上述研究背景，提供一种能够作为结直肠癌生物标记物的氨基酸联合因子，并基于该氨基酸联合因子构建结直肠癌血液学氨基酸联合因子诊断模型，同时利用该模型进行结直肠癌血液学检测，进而基于检测结果，实现结直肠癌的辅助诊断。
本发明的技术方案为：首先，建立同时检测人血浆32种氨基酸含量的液相-串联质谱联用检测方法，并通过方法学验证项目验证该检测方法的有效性；其次，将受试人员中的结直肠癌患者、健康志愿者及结直肠癌前病变患者按照约1:1比例分成训练集和测试集，进行该检测方法在人血浆氨基酸含量测定中的应用，即对受试人员进行血浆32种氨基酸的含量测定；而后，通过训练集样本的多维统计分析进行靶向氨基酸代谢组学研究，确定差异性代谢物trp、sar、glu可以作为潜在的诊断结直肠癌患者的生物标志物；最后，通过logistics回归，基于trp、sar、glu三个氨基酸因子建立结直肠癌血液学联合因子诊断模型，该诊断模型的联合因子回归方程为：联合因子＝0.001×ctrp+0.029×csar－0.002×cglu－9.427(ctrp、csar、cglu的单位为ng/ml)，经测试集样本以及全体受试人员样本验证后证实该诊断模型对结直肠癌的各项诊断评价指标。
所述的同时检测的人血浆32种氨基酸包括：甘氨酸(glycine，gly)、丙氨酸(alanine，ala)、缬氨酸(valine，val)、赖氨酸(lysine，lys)、亮氨酸(leucine，leu)、异亮氨酸(isoleucine，ile)、谷氨酰胺(glutamine，gln)、谷氨酸(glutamicacid，glu)、甲硫氨酸(methionine，met)、组氨酸(histidine，his)、苯丙氨酸(phenylalanine，phe)、精氨酸(arginine，arg)、酪氨酸(tyrosine，tyr)、色氨酸(tryptophan，trp)、丝氨酸(serine，ser)、脯氨酸(proline，pro)、苏氨酸(threonine，thr)、5-氧代-脯氨酸(5-oxo-proline，opr)、门冬酰胺(asparagine，asn)、鸟氨酸(ornithine，orn)、瓜氨酸(citruline，cit)、胱氨酸(cystine，cyss)、半胱氨酸(cysteine，cys)、羟脯氨酸(hydroxy-proline，hpr)、门冬氨酸(asparticacid，asp)、非对称二甲基精氨酸(asymmetricdimethylarginine，adma)、对称二甲基精氨酸(symmetricdimethylarginine，sdma)、犬尿氨酸(kynurenine，kyn)、3-氨基丙酸(3-aminopropanoicacid，apa)、肌氨酸(sarcosine，sar)、3-氨基-2-甲基丙酸(3-amino-2-methylpropanoicacid，amp)、马尿酸(hippuricacid，hia)。
所述的液相-串联质谱联用检测方法包括以下步骤：首先利用液相系统将32种氨基酸色谱分离，其次利于串联质谱系统以内标定量法建立32种氨基酸的标准曲线，再确定32种氨基酸的线性范围及线性关系，最后考察32种氨基酸的选择性、提取回收率与基质效应、定量下限、日内日间精密度准确度、稳定性、稀释效应及残留效应等方法学验证项目。
所述的血浆靶向氨基酸代谢组学研究包括：采用主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)模型、正交偏最小二乘-判别分析(orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，opls-da)模型对结直肠癌患者、健康志愿者血浆进行多维统计分析。通过opls-da模型中的变量投影重要性分析(variableimportancefortheprojection，vip)找到14个vip值大于1的差异性代谢物，分别为trp、sar、glu、ser、met、ala、cys、cyss、tyr、opr、apa、gln、hia、arg，其中vip值大于1.5的差异性代谢物trp、sar、glu可以作为潜在的诊断结直肠癌的生物标志物。
本发明的第一方面，提供了氨基酸联合因子在构建结直肠癌血液学诊断模型中的应用。
通过实验筛选，氨基酸联合因子优选为包括色氨酸(trp)、肌氨酸(sar)、谷氨酸(glu)三个氨基酸因子。
本发明的第二方面，提供了trp、sar、glu三个氨基酸因子在构建结直肠癌血液学诊断模型中的应用。
优选的，该诊断模型建立过程是基于trp、sar、glu进行logistics回归后得到的联合因子回归方程，该回归方程为，联合因子＝0.001×ctrp+0.029×csar－0.002×cglu－9.427，ctrp、csar、cglu的单位均为ng/ml。优选的，回归方程中联合因子的截断值为2.433，
由此，本发明的第三方面，提供了一种结直肠癌血液学氨基酸联合因子诊断模型，该诊断模型基于上述回归方程建立。
本发明的第四方面，提供了结直肠癌血液学氨基酸联合因子诊断模型在结直肠癌诊断中的应用，当检测结果小于截断值时，诊断为高度疑似结直肠癌患者，可结合其它常规检查手段进行结直肠癌的最终确诊。
本发明的第五方面，提供了一种采用结直肠癌血液学诊断模型进行结直肠癌诊断的血液学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、空腹抽取检测者外周静脉血3～4ml，离心分离后获取血浆；
b、采用液相-串联质谱联用检测方法检测血浆中的trp、sar、glu的含量；
c、根据联合因子回归方程(联合因子＝0.001×ctrp+0.029×csar－0.002×cglu－9.427，ctrp、csar、cglu的单位为ng/ml)计算联合因子，并与截断值进行比较。
流动相洗脱程序如下：
优选的，步骤b中，trp的内标氨基酸为phe-d5，sar、glu的内标氨基酸均为met-d3。
本发明的第六方面，提供了trp、sar、glu三个氨基酸因子联用在制备结直肠癌血液学检测试剂盒中的应用，所述的试剂盒包含采用液相-串联质谱联用检测方法检测人血浆氨基酸含量的试剂。
本发明的有益保障及效果：
本发明提供了一种氨基酸联合因子在构建结直肠癌血液学诊断模型中的应用，具有如下技术效果：
本发明构建的结直肠癌血液学诊断模型为结直肠癌的临床诊断提供了一种有效可靠便捷的方法，具有良好的结直肠癌辅助诊断价值。
附图说明
图1为32种氨基酸及3种内标氨基酸的ms/ms离子图；
图2为代表性总离子流图和多反应监测色谱图[图中，a.空白“模拟血浆”，b.标准添加“模拟血浆”(qc2)，c.血浆实测样本(crc-a)]；
图3为32种氨基酸的标准曲线图(n＝9)；
图4为训练集血浆样本氨基酸总离子流图(图中，a.结直肠癌患者血浆样本，b.健康志愿者血浆样本)；
图5为训练集血浆样本氨基酸含量(图中，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001)；
图6为测试集血浆样本氨基酸总离子流图(图中，a.结直肠癌患者血浆样本，b.癌前病变患者血浆样本，c.健康志愿者血浆样本)；
图7为测试集血浆样本氨基酸含量；
图8为结直肠癌患者、健康志愿者血浆样本代谢谱pca-x模型下每个主成分的r2、q2积累图；
图9为结直肠癌患者、健康志愿者血浆样本代谢谱pca-x模型的得分散点图；
图10为结直肠癌患者、健康志愿者血浆样本代谢谱opls-da模型下每个主成分的r2、q2积累图；
图11为结直肠癌患者、健康志愿者血浆样本代谢谱opls-da模型的得分散点图；
图12为响应置换检验图；
图13为结直肠癌早期、晚期患者，健康志愿者血浆样本代谢谱opls-da模型的得分散点图；
图14为结直肠癌i、ii、iii、iv期患者血浆样本代谢谱pca模型的得分散点图；
图15为血浆样本氨基酸代谢谱的载荷图；
图16为血浆样本氨基酸代谢谱的s形曲线图；
图17为代表预测失量的回归系数图；
图18为预测vip值图；
图19为各氨基酸及cea、afp的roc曲线；
图20为联合因子、各氨基酸及cea、afp的roc曲线。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。
实施例1：同时检测人血浆32种氨基酸含量的液相-串联质谱联用检测方法的建立
1目的
以gly、ala、val、lys、leu、ile、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp、ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss、cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn、apa、sar、amp、hia作为待测物质，建立人血浆32种氨基酸的液相-串联质谱联用检测方法。
2实验仪器与材料
2.1仪器
agilent6460三重四极杆串联质谱仪系统；agilent1290超高效液相色谱仪系统，包括g4220a型双元泵、g1969-80230型真空脱气机、g4226a型自动进样器、g1316c型柱温箱；agilentmasshunter数据处理工作站，agilentqualitativeanalysisb.07.00tools软件，均为美国安捷伦(agilent)公司产品。微量电子天平，mse3.6p-0ce-dm型(最大载荷3.1g，分度值0.001mg)，德国赛多利斯(sartorius)公司产品。移液器，researchplus型，单道可调量程20μl、100μl、200μl、1000μl，德国艾本德(eppendorf)公司产品。涡旋混匀仪，vortexql-901型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品。高速离心机，centrifuge5810r型，德国艾本德公司产品。冷冻离心机，universal320r型，德国海蒂诗(hettich)公司产品。医用超低温保存箱，dw-88l728j型，青岛海尔(haier)特种电器有限公司产品。
2.2试剂与耗材
甲醇、乙腈，质谱纯，德国默克(merck)公司生产。磷酸盐缓冲盐溶液(phosphatebufferedsolution，pbs)，细胞培养级(10×)，大连美仑生物科技有限公司生产，批号ma0016-may-19b。七氟丁酸(heptafluorobutyricacid，hfba)，美国阿达玛斯(adamas)试剂有限公司生产，批号p11933。甲酸(formicacid，fa)，上海麦克林(macklin)生化有限公司生产，批号c10009619。盐酸(hydrochloricacid，hcl)为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产，批号20130726。0.9％氯化钠注射液(sodiumchlorideinjection)，1000ml/袋，上海长征医院药材科制剂室生产，批号160613。超纯净水，经美国密理博(millipore)公司milli-qacademic超纯水器处理得到。
一次性使用vacuette真空采血管，edta(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)k3型，5ml，奥地利葛莱纳第一生化(greinerbio-one)有限公司生产。一次性使用cryomax冻存管，内旋盖型，2ml，上海万格(avantech)科学器材有限公司生产。一次性使用离心管，1.5ml、5ml、10ml，爱思进(axygen)生物技术有限公司生产。一次性使用移液器枪头，10μl、200μl、1000μl，爱思进生物技术有限公司生产。
2.3氨基酸对照品
32种氨基酸及3种内标(internalstandard，is)氨基酸对照品信息见表1。
表132种氨基酸及3种内标氨基酸对照品
2.4血浆样本
选取海军军医大学附属长征医院普外科住院的6例结直肠癌患者行腹腔镜结直肠癌切除术术前血液样本(编号crc-a～crc-f)、第九七医院体检中心体检的6例健康志愿者(healthyvolunteer，hv)血液样本(编号hv-a～hv-f)，作为血浆实测样本进行实验。
3液相-串联质谱联用检测方法
3.1.1氨基酸对照品储备溶液的配制
取对照品gly、ala、ser、val、thr、leu、ile、phe、arg、pro、met、his、cit、sar、apa、amp、opr、hpr、hia、kyn约2.5mg，lys·hcl、orn·hcl约3.0mg，精密称定质量，分别置于1.5ml离心管中，定量加入5％甲醇水溶液溶解，配制成gly、gly、ala、ser、val、thr、leu、ile、lys、phe、arg、pro、met、his、cit、sar、apa、amp、opr、hpr、orn、hia、kyn浓度分别为2.5mg/ml的储备溶液。
取对照品gln、glu、trp约2.5mg，精密称定质量，分别置于1.5ml离心管中，定量加入0.2％fa水溶液溶解，配制成gln、glu、trp浓度分别为2.5mg/ml的储备溶液。
取对照品asp、tyr、asn、cys、cyss、sdma约2.5mg，adma·2hcl约3.0mg，精密称定质量，分别置于1.5ml离心管中，定量加入4％hcl水溶液溶解，配制成asp、tyr、asn、cys、adma、cyss、sdma浓度分别为2.5mg/ml的储备溶液。
上述氨基酸对照品储备溶液分装后置于-80℃冰箱内保存。
3.1.2内标氨基酸对照品储备溶液的配制
取is氨基酸对照品ala-d4、met-d3、phe-d5约1mg，分别置于1.5ml离心管中，定量加入5％甲醇水溶液溶解，配制成ala-d4、met-d3、phe-d5浓度分别为1.0mg/ml的is氨基酸对照品储备溶液。上述is氨基酸对照品储备溶液置于-80℃冰箱内保存。
3.1.3工作溶液的配制
精密量取pbs溶液(10×)2.5ml，置于25ml容量瓶中，加入纯水稀释至刻度，定容，配制成pbs溶液(1×)，作为“模拟血浆”使用。
精密吸取上述gly、ala、leu、ile储备溶液各100μl，置于1.5ml离心管中混合，加入5％甲醇水溶液稀释至1ml，涡旋混匀，配制成gly、ala、leu、ile浓度分别为250μg/ml的工作溶液。
精密吸取上述val、lys、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp储备溶液各100μl，置于1.5ml离心管中混合，涡旋混匀，配制成val、lys、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp浓度分别为250μg/ml的工作溶液。
精密吸取上述ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss储备溶液各100μl，置于1.5ml离心管中混合，加入5％甲醇水溶液稀释至1ml，涡旋混匀，配制成ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss浓度分别为250μg/ml的工作溶液。
精密吸取上述cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn储备溶液各100μl，apa、sar、amp、hia储备溶液各50μl，置于1.5ml离心管中混合，加入5％甲醇水溶液稀释至1ml，涡旋混匀，配制成cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn浓度分别为250μg/ml，apa、sar、amp、hia浓度分别为125μg/ml的工作溶液。
精密吸取上述ala-d4、met-d3、phe-d5储备溶液各100μl，混合置于250ml容量瓶中，加入乙腈(含0.2％fa)，稀释至刻度，定容，配制成含3种is氨基酸各400ng/ml的乙腈蛋白沉淀剂工作溶液。
上述工作溶液置于4℃冰箱内短暂保存，现配现用。
3.1.4标准曲线工作溶液的配制
精密吸取上述工作溶液适量，分别置于1.5ml离心管中混合，加入“模拟血浆”稀释至1ml，涡旋混匀，再加入“模拟血浆”逐级稀释，配制成gly、ala、val、lys、leu、ile、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp浓度分别为80000、60000、40000、20000、8000、3200、1600、800、400ng/ml，ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss浓度分别为16000、12000、8000、4000、1600、640、320、160、80ng/ml，cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn浓度分别为8000、6000、4000、2000、800、320、160、80、40ng/ml，apa、sar、amp、hia浓度分别为4000、3000、2000、1000、400、160、80、40、20ng/ml的标准曲线工作溶液。
3.1.5标准曲线工作溶液前处理
精密吸取上述标准曲线工作溶液50μl，置于1.5ml离心管中，加入乙腈蛋白沉淀剂工作溶液150μl，静置3min，涡旋2min混匀，置于离心机中4℃、19060×g下离心15min，取上清液，转移至进样小瓶进行分析。
3.1.6质量控制样本的配制
将“模拟血浆”按照“3.1.4标准曲线工作溶液的配制”项下方法制备3个浓度的质量控制(qualitycontrol，qc)样本，用于各批次实测样本的质控。
qc1样本中gly、ala、val、lys、leu、ile、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp浓度为800ng/ml，ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss浓度为160ng/ml，cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn浓度为80ng/ml，apa、sar、amp、hia浓度为40ng/ml。qc2样本中gly、ala、val、lys、leu、ile、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp浓度为8000ng/ml，ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss浓度为1600ng/ml，cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn浓度为800ng/ml，apa、sar、amp、hia浓度为400ng/ml。qc3样本中gly、ala、val、lys、leu、ile、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp浓度为60000ng/ml，ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss浓度为12000ng/ml，cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn浓度为6000ng/ml，apa、sar、amp、hia浓度为3000ng/ml。
3.1.7质量控制样本的前处理同“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”。
3.2色谱条件
表2流动相洗脱程序
3.3质谱条件
表332种氨基酸及3种内标氨基酸的多反应监测优化参数(正离子电喷雾电离模式)
3.4血浆样本的前处理
采用蛋白沉淀法(proteinprecipitation，ppt)进行样本前处理，精密吸取血浆50μl，置于1.5ml离心管中，加入乙腈蛋白沉淀剂工作溶液150μl，静置3min，涡旋2min混匀，置于离心机中4℃、19060×g下离心15min，取上清液，转移至进样小瓶进行分析。
3.5方法学验证
3.5.1选择性
选择性(selectivity)是指该分析方法应该能够区分待测氨基酸和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。分别称取牛磺酸、s-腺苷甲硫氨酸、肌酸、肌醇、肌酐等内源性物质对照品适量，加入5％甲醇水溶液溶解后混合，稀释，加入“模拟血浆”，配制成6批次各内源性物质浓度分别为1.0μg/ml的混合溶液，作为空白“模拟血浆”，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作；按照“3.1.6质量控制样本的配制”项下方法配制6批次qc2样本，作为标准添加32种氨基酸和3种is氨基酸的“模拟血浆”，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作；吸取6份结直肠癌患者或健康志愿者血浆实测样本，按照“3.4血浆样本的前处理”项下方法操作。进行分析，比较以上三组样本的色谱图差异，确定是否存在内源性物质干扰。
3.5.2定量下限与检测限
定量限(limitofquantification，loq)是指样本中待测氨基酸能被定量检测出的最低量，一般以信噪比s/n＝10:1时相应浓度确定loq；定量下限(lowlimitofquantification，lloq)是能够被可靠定量的样品中待测氨基酸的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。lloq值应在-20％～20％范围内、相对标准偏差(relativestandarddeviation，rsd)值应≤20％，以符合方法学对准确度和精密度的要求。同法配制5批次标准曲线工作溶液最低浓度点溶液，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后，于1日内连续进行测定，计算日内(intra-day)准确度和精密度。连续3天重复上述操作，每日测定1次，计算日间(inter-day)准确度和精密度。检测限(limitofdetection，lod)是指样本中待测氨基酸能被检测出的最低量，一般以信噪比s/n＝3:1时相应浓度确定lod。
3.5.3线性与浓度范围
线性(linearity)是指在浓度范围内检测响应值与样本中待测氨基酸浓度呈比例关系的程度。加入已知浓度的待测氨基酸和内标于空白基质中，制备各浓度的标准曲线；纵坐标y采用待测氨基酸峰面积saa与is氨基酸峰面积sis的比值表示，横坐标x采用待测氨基酸浓度caa与is氨基酸浓度cis的比值表示，回归计算采用“1/x2加权”的最小二乘法进行。以该分析方法能够使待测氨基酸达到一定相对误差(relativeerror，简称re)、rsd和线性要求时的高低限浓度区间确定该待测氨基酸的线性浓度范围，线性浓度范围应该尽量覆盖预期浓度范围。
3.5.4提取回收率与基质效应
基质效应(matrixeffects，me)是指被测样品中除被分析物以外的组分，对分析物的分析有显著干扰，并影响分析结果的准确性，这些干扰和影响被称为基质效应[taylorpj.matrixeffects:theachillesheelofquantitativehigh-performanceliquidchromatography-electrospray-tandemmassspectrometry.clinicalbiochemistry,2005,38(4):328-334.]。配制6批次低、高浓度(浓度分别等同于qc1、qc3样本)的标准添加氨基酸的“模拟血浆”样本，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后，测定仪器的氨基酸响应值rv预处理前(模拟血浆样本预处理前的氨基酸响应值)。将“模拟血浆”按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后，标准添加氨基酸至6批次低、高浓度(浓度分别等同于qc1、qc3样本)，测定仪器的氨基酸响应值rv预处理后(模拟血浆样本预处理后的氨基酸响应值)。配制6批次低、高浓度(浓度分别等同于qc1、qc3样本)的标准添加氨基酸的空白5％甲醇水溶液样本，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后，测定仪器的氨基酸响应值rv纯溶剂(纯溶剂中的氨基酸响应值)。提取回收率(extractionrecovery，er)、基质效应计算公式如下：
3.5.5准确度与精密度
准确度(accuracy)是指采用该方法测定氨基酸的测定值与标示浓度的接近程度，采用re表示，re值应在-15％～15％范围内；精密度(precision)是指待测氨基酸重复测定的接近程度，采用rsd表示，rsd值应≤15％。同法配制5批次qc1、qc2、qc3样本，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后，于1日内连续进行测定，计算日内(intra-day)准确度和精密度，每日测定1次，连续测定3日，计算日间(inter-day)准确度和精密度。
3.5.6稳定性
稳定性(stability)包括待测样本室温下放置的稳定性、反复冻融的稳定性、自动进样器放置下的短期稳定性、冰冻下保存的长期稳定性。同法配制3批次qc1、qc2、qc3样本，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后，分别于20℃下放置6h、-20℃下反复冻融3次、4℃下自动进样器放置24h、-80℃下保存90d后，按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后进行测定。采用re表示测定结果与氨基酸真实值的差异，采用rsd表示同一份均匀样本经多次取样检测氨基酸的结果之间的接近程度。
3.5.7稀释效应
当样本中的待测物浓度高于线性范围的最高浓度时，可通过适当的稀释使得待测物浓度处于线性范围内。稀释效应(dilutioneffect)是指将己知高浓度样本稀释一定倍数后的实测浓度与其稀释后理论浓度进行比较的结果，采用re表示，re值应≤15％。精密吸取上述氨基酸工作溶液适量，加入“模拟血浆”稀释，配制成gly、ala、val、lys、leu、ile、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp浓度为80000ng/ml，ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss浓度为16000ng/ml，cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn浓度为8000ng/ml，apa、sar、amp、hia浓度为4000ng/ml的溶液。加入“模拟血浆”稀释5倍，同法稀释2批次，再按照“3.1.5标准曲线工作溶液前处理”项下方法操作后进行测定，考察此稀释条件对待测氨基酸浓度测定的影响。
3.5.8残留效应
考察该分析方法的残留效应，在最高浓度的标准曲线样品进样之后注射空白样品，以评估残留。空白样品中的残留应不超过定量下限的20％。
3.6数据处理
采用agilentmasshunter数据处理工作站和agilentqualitativeanalysisb.07.00tools软件进行质谱数据处理。
4结果
4.1方法学验证结果
4.1.1选择性结果
4.1.2定量下限与检测限结果
32种氨基酸lloq和lod结果见表4。日内lloq的re值为-18.97％～14.62％，rsd值为1.00％～7.89％，日间lloq的re值为-17.95％～13.09％，rsd值为1.38％～10.79％，结果见表6；相应lod的s/n>3。表明lloq和lod结果符合血浆样本分析方法学要求。
4.1.3线性与浓度范围结果
4.1.4提取回收率与基质效应结果
32种氨基酸及3种is氨基酸在低、高qc样本浓度下提取回收率平均值为50.37％～182.44％，rsd值为0.62％～14.16％；基质效应平均值为41.02％～136.37％，rsd值为0.56％～10.31％。上述结果见表5，表明提取回收率和基质效应结果能够满足血浆样本分析要求。
表532种氨基酸及3种内标氨基酸的提取回收率和基质效应(n＝6)
4.1.5准确度与精密度结果
32种氨基酸在低、中、高qc样本浓度下日内re值为-14.29％～13.72％，日内rsd值为0.38％～8.77％；日间re值为-14.35％～13.40％，日间rsd值为0.52％～12.22％。上述结果见表6，表明准确度和精密度符合血浆分析方法学要求。
表632种氨基酸的日内、日间准确度和精密度(n＝5)
4.1.6稳定性结果
32种氨基酸在低、中、高qc样本浓度下室温下放置的稳定性re值为-12.82％～11.94％，rsd值为0.73％～11.98％；反复冻融的稳定性re值为-14.59％～13.05％，rsd值为0.17％～11.31％；自动进样器放置下的短期稳定性re值为-13.38％～13.04％，rsd值为0.43％～13.92％；冰冻下保存的长期稳定性re值为-12.57％～12.02％，rsd值为1.15％～12.59％。上述结果见表7，表明稳定性符合血浆分析方法学要求。
表732种氨基酸的稳定性结果(n＝3)
4.1.7稀释效应结果
32种氨基酸的稀释效应re值为-13.97％～13.52％，rsd值为0.34％～8.31％。上述结果见表8，表明在5倍稀释条件下，对血浆的氨基酸含量测定无影响。
表832种氨基酸的稀释效应结果(n＝3)
4.1.8残留效应结果
经考察，32种氨基酸的残留效应符合血浆样本分析方法学要求。
4.2血浆样本测定结果
结直肠癌患者血浆样本、健康志愿者血浆样本测定结果见表9。
表9结直肠癌患者血浆样本、健康志愿者血浆样本中32种氨基酸的含量测定结果
续上表
注：“-”表示低于检测限。
5血浆氨基酸液相-串联质谱联用检测方法的建立
5.1血浆待测氨基酸种类的确定
预实验表明，人血浆中主要含有gly、ala、val、lys、leu、ile、gln、glu、met、his、phe、arg、tyr、trp、ser、pro、thr、opr、asn、orn、cit、cyss、cys、hpr、asp、adma、sdma、kyn、apa、sar、amp、hia等32种氨基酸，故建立血浆32种氨基酸含量检测方法。
5.2分析条件的优化
5.3“模拟血浆”的选择
应用lc-ms/ms对生物样本中的内源性化合物进行定量分析，选择合适方法制备标准曲线样本和qc样本是方法学开发中的重要部分。其解决策略主要有以下两种：一是在真实基质中使用替代分析物，二是在替代基质中使用真实分析物[vandemerbelnc.quantitativedeterminationofendogenouscompoundsinbiologicalsamplesusingchromatographictechniques.trendsinanalyticalchemistry,2008,27(10):924-933.]。理想的替代基质是完全无分析物的，并在分析物的溶解度和可萃取性方面与真实基质完全相同。对于内源性化合物的检测，真实基质通常含有未知浓度的分析物，故其不适用制备标准曲线样本和qc样本；在实际研究中，也很难找到含有足够低浓度内源性化合物的、合适的真实生物基质样本作为空白基质使用。
5.4内标氨基酸的选定
6小结
本实施例建立了同时检测人血浆32种氨基酸含量的液相-串联质谱联用检测方法，并进行了方法学的验证。该方法32种待测氨基酸及is氨基酸拥有较好的色谱分离与质谱响应，各待测氨基酸的标准曲线在各自的线性范围内呈现良好的线性关系，生物样本分析所要求的提取回收率与基质效应值、定量下限值、日内日间精密度准确度值、稳定性值均可达到，适用于下一步进行人血浆32种氨基酸的含量测定。
实施例2：人血浆32种氨基酸的含量测定
采用液相-串联质谱联用方法对结直肠癌患者、健康志愿者，以及结直肠癌前病变(precancerosis，pc)患者进行血浆32种氨基酸的含量测定。
实验通过海军军医大学附属长征医院生物医学伦理委员会审批。
同“实施例12.1仪器”。
同“实施例12.2试剂与耗材”。
同“实施例12.3氨基酸对照品”。
2.4受试人员血浆样本收集
2.4.1结直肠癌患者血浆样本收集
2.4.2健康志愿者血浆样本收集
健康志愿者来自于本课题合作单位——第九七医院体检中心2017年1月至2017年5月的体检人员。入选标准：患者知情同意，自愿加入本试验，签署知情同意书；男女各半、年龄大于18岁；无癌症史；无消化道异常、代谢异常疾病、神经系统疾病等病史，无过敏史；近两周内未服用过其它药物，近一周内未喝过任何含酒精的饮料。收集体检人员早晨空腹外周静脉血液标本，采血前体检人员隔夜禁食不禁水12h，使用vacuetteedtak3真空采血管收集体检人员前臂静脉血3～4ml，2h内离心(4℃，2000×g下15min)，将血浆、血细胞分别置于cryomax冻存管中，浸入液氮罐中暂存，然后转运至-80℃冰箱内统一冻存。记录健康志愿者体检号、性别、年龄、身高、体质量等资料；血常规，生化指标、乙肝两对半指标、尿常规、粪常规等信息，以及cea、afp等肿瘤诊断指标。共收集到健康志愿者血浆样本411例。
2.4.3结直肠癌前病变患者血浆样本收集
结直肠癌前病变患者来自于本课题合作单位——江苏省泰兴市人民医院消化内科2017年11月至2018年1月的住院患者。入选标准：患者知情同意，自愿加入本试验，签署知情同意书；主要包括结直肠息肉及腺瘤患者、炎性结肠病患者；年龄大于18岁；无癌症史；无代谢异常疾病、神经系统疾病等病史，无过敏史；近两周内未服用过其它药物，近一周内未喝过任何含酒精的饮料。收集患者行结肠镜术前早晨空腹外周静脉血液标本，采血前患者隔夜禁食不禁水12h，使用vacuetteedtak3真空采血管收集患者前臂静脉血3～4ml，2h内离心(4℃，2000×g下15min)，将血浆、血细胞分别置于cryomax冻存管中，浸入液氮罐中暂存，然后转运至-80℃冰箱内统一冻存。记录患者门诊号、性别、年龄、身高、体质量等资料；疾病诊断、血常规，生化指标、乙肝两对半指标、尿常规、粪常规等信息，以及cea、afp等肿瘤诊断指标。共收集到结直肠癌前病变患者33例。
2.5受试人员分组
将受试人员中的结直肠癌患者、健康志愿者按照约1:1的比例分成训练集和测试集，训练集用于模型的建立，测试集用于测试所建立模型的性能。结直肠癌癌前病变患者因数量较少，仅归入测试集。
2.5.1训练集
训练集包括结直肠癌患者130例，健康志愿者216例。
2.5.2测试集
其余的受试人员为测试集，包括结直肠癌患者116例，结直肠癌前病变患者33例，健康志愿者195例。
同“实施例13.2色谱条件”。
同“实施例13.3质谱条件”。
3.4血浆样本前处理
同“实施例13.4血浆样本前处理”。
3.5数据处理及统计方法
采用agilentmasshunter数据处理工作站和agilentqualitativeanalysisb.07.00tools软件进行质谱数据处理。采用graphpadprism6.01软件绘制血浆氨基酸含量图。采用t检验比较各组血浆氨基酸含量差异，以p<0.05为具有统计学意义。
4.1训练集人员基本信息
代谢组学研究中，要求能够尽量减少癌症以外的因素对于代谢组学研究的影响，以利于分析得到差异性较为显著的因素，从而获得较佳的分析结果。对于训练集样本，选择年龄、性别分布等与结直肠患者尽量匹配的健康志愿者作为对照，结直肠癌癌前病变患者未归入测试集。训练集人员基本信息见表10。对训练集中结直肠癌患者、健康志愿者的年龄进行统计分析，经t检验，t＝1.320<t0.05/2,344＝1.967，p＝0.188>0.05；对性别分布进行统计分析，经χ2检验，χ2＝0.135<χ20.05,1＝3.84，p＝0.713>0.05。训练集两组人员的年龄、性别分布具有一致性。
表10训练集人员基本信息
4.2训练集血浆样本氨基酸总离子流图
训练集130例结直肠癌患者、216例健康志愿者血浆样本氨基酸总离子流图见图4。
4.3训练集血浆样本氨基酸含量测定结果
训练集130例结直肠癌患者、216例健康志愿者血浆样本氨基酸含量见图5。
4.4测试集人员基本信息
测试集人员基本信息见表11。
表11测试集人员基本信息
4.5测试集血浆样本氨基酸总离子流图
测试集116例结直肠癌患者、33例癌前病变患者、195例健康志愿者血浆样本氨基酸总离子流图见图6。
4.6测试集血浆样本氨基酸含量测定结果
测试集116例结直肠癌患者、33例癌前病变患者、195例健康志愿者血浆样本氨基酸含量见图7。
5小结
采用实施例1中建立的液相-串联质谱联用检测方法测定了246例结直肠癌患者血浆、411例健康志愿者血浆、33例结直肠癌前病变患者血浆样本32种氨基酸含量，以便下一步进行血浆靶向氨基酸代谢组学研究。
实施例3：结直肠癌患者血浆靶向氨基酸代谢组学研究
进行结直肠癌患者血浆靶向氨基酸代谢组学研究。
2数据处理及统计方法
采用umetricssimca14.1软件进行多维统计处理，进行主成分分析、正交偏最小二乘-判别分析。采用t检验比较各组血浆氨基酸含量差异，以p<0.05为具有统计学意义。
3血浆氨基酸多维统计分析
3.1主成分分析(pca)
为了寻找结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆相互区别的氨基酸代谢信息，首先，建立非监督的pca-x模型对130例结直肠癌患者血浆、216例健康志愿者血浆样本进行分析。建立的pca-x模型的解释率r2x(cum)＝0.499、预测率q2(cum)＝0.292，4个主成份的r2、q2积累图见图8，得分散点图见图9。图9中，结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆的氨基酸代谢谱存在一定的差异性，具有区分趋势；健康志愿者血浆氨基酸分布比较紧凑，而结直肠癌患者分布比较分散。结果表明：此pca-x模型预测率较低，对结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆区分程度较低。
3.2正交偏最小二乘-判别分析(opls-da)
由于采用pca-x建模不能完全将结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆区分开，采用有监督的opls-da模型重新进行分析。建立的opls-da模型的解释率r2x(cum)＝0.414、区分程度r2y(cum)＝0.853、预测率q2(cum)＝0.834，1个主成分及2个正交成分的r2、q2积累图见图10，得分散点图见图11。图11中，结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆的氨基酸代谢谱能够完全分开。进行响应置换检验，模型没有出现“过拟合”，说明模型可靠，200次置换的置换检验图见图12。结果表明：此opls-da模型具有较高的稳定性，特别是区分程度、预测率均较高，可以用来鉴别结直肠癌患者血浆，可能用于结直肠癌的诊断。
将结直肠癌患者分为65例早期患者(i期、ii期)、56例晚期患者(iii期、iv期)两组，联合216例健康志愿者，建立opls-da模型评估结直肠癌患者的癌症分期情况。建立的opls-da模型的解释率r2x(cum)＝0.353、区分程度r2y(cum)＝0.495、预测率q2(cum)＝0.486，1个主成分及1个正交成分的得分散点图见图13。健康志愿者主要分布在图中右侧区域，结直肠癌患者主要分布在图中左侧区域，但早期患者、晚期患者的区分程度较差，基本无分离趋势。
去除健康志愿者样本，单独建立模型对各期结直肠癌患者进行分期。2个主成分的pca模型得分散点图见图14。尝试进行opls-da建模时失败，实验证实了单纯的靶向氨基酸代谢组学无法进行结直肠癌患者临床分期。
4血浆样本差异性变量分析
4.1氨基酸含量差异的t检验结果
采用t检验分析结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆中32种氨基酸含量差异，检验结果见图5。结直肠癌患者血浆gln、ser、glu、asn、opr、orn、lys、cys、amp、sdma含量均极显著高于健康志愿者血浆中的含量(p<0.0001)，gly、ala、val、phe、trp、pro、arg、met、tyr、cyss、his、hia、hpr、sar、apa均极显著低于健康志愿者血浆中的含量(p<0.0001)，结直肠癌患者血浆asp含量显著高于健康志愿者血浆中的含量(p<0.05)，结直肠癌患者血浆leu、kyn含量显著低于健康志愿者血浆中的含量(p<0.05)，两组血浆ile、thr、cit、adma含量差异无统计学意义。以上分析表明：结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆中的氨基酸代谢谱具有较大差异。
4.2变量投影重要性分析(vip)
针对基于130例结直肠癌患者血浆、216例健康志愿者血浆样本建立的opls-da模型进行分析，32种氨基酸的载荷图见图15。s形曲线图见图16，图中，偏离中心点越远的氨基酸表明其对此模型的贡献率越大，图中右侧区域上部的氨基酸在结直肠癌患者血浆中显著升高，图中左侧区域下部的氨基酸在结直肠癌患者血浆中显著降低。
代表预测失量的回归系数图见图17，预测vip值图见图18。其中，找到了14个vip值大于1的差异性代谢物，分别为trp、sar、glu、ser、met、ala、cys、cyss、tyr、opr、apa、gln、hia、arg，各差异性代谢物的vip值及t检验结果见表12；vip值大于1.5的差异性代谢物有trp、sar、glu，可以作为潜在的诊断结直肠癌患者的生物标志物。
表12变量的vip值及t检验结果
对实施例2中测定的血浆样本进行血浆靶向氨基酸代谢组学研究，表明结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆中的氨基酸代谢谱具有较大差异，差异性代谢物为trp、sar、glu，可作为潜在的诊断结直肠癌患者的生物标志物，以便下一步进行结直肠癌血液学诊断模型的建立。
实施例4：结直肠癌血液学氨基酸联合因子诊断模型的建立
基于血浆氨基酸联合因子建立结直肠癌诊断模型，并进行模型验证。
采用ibmspssstatistics21.0软件进行统计分析，绘制受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc曲线)。
3结直肠癌诊断模型的建立
3.1结直肠癌诊断单因子模型
roc曲线是以假阳性率[以1-特异性(1-specificity)表示]为横坐标、真阳性率[以灵敏度(sensitivity)表示]为纵坐标绘制的曲线，主要用于评价临床指标对疾病的诊断效能，以确认最佳的诊断截断值，并可以比较多种不同的临床诊断指标对疾病的诊断效能。对vip值大于1.5的差异性代谢物trp、sar、glu，进行单因子roc曲线的绘制，并与临床常用的cea、afp指标进行比较，结果见图19。各诊断因子的roc曲线下的面积见表13，表明：trp、sar、glu三种氨基酸单因子的auc值分别为0.861、0.888、0.896，均高于cea的auc值0.809、afp的auc值0.402。
表13各诊断因子的roc曲线下面积
3.2结直肠癌诊断联合因子模型
3.2.1联合因子回归方程的建立
由于氨基酸为内源性代谢物，其代谢容易受到疾病因素之外的机体状态、饮食和生活方式等多种因素的影响。故采用联合因子进行结直肠癌诊断，可在一定程度上综合以上因素的影响，从而提高疾病的诊断准确率。基于trp、sar、glu三个氨基酸因子进行logistics回归，建立联合因子回归方程，回归模型参数见表14。该联合因子回归方程为：联合因子＝0.001×ctrp+0.029×csar－0.002×cglu－9.427，其中，ctrp、csar、cglu的单位为ng/ml。
表14logistics回归模型参数
注：“-”表示无数据。
3.2.2联合因子模型效能评估
进行联合因子的roc曲线的绘制，并与氨基酸单因子、cea、afp指标进行比较，结果见图20。联合因子的roc曲线下的面积见表15。表明，联合因子的auc较佳，auc值为0.980，高于trp、sar、glu的auc值。血浆氨基酸含量联合因子对结直肠癌的诊断效能高于血浆氨基酸含量单因子，也高于cea、afp。
表15联合因子的roc曲线下面积
选取约登指数(youden'sindex)为最大时所对应的各变量值作为其截断值(cutoff值)，此时该变量的敏感度和特异性均较高。各诊断因子的效能评估见表16。表中，联合因子的截断值为2.433。将受试人员血浆的trp、sar、glu测定值(单位ng/ml)代入联合因子回归方程进行计算，如计算结果小于2.433，即可诊断为结直肠癌患者。
表16各诊断因子的效能评估
3.2.3联合因子模型诊断训练集的价值使用联合因子诊断模型(以2.433为诊断截断值)对训练集的130例结直肠癌患者、216例健康志愿者进行诊断，诊断训练集的价值结果见表17。
表17结直肠癌诊断模型诊断训练集的价值
4结直肠癌诊断模型的验证
4.1联合因子模型诊断测试集的价值
使用联合因子诊断模型(以2.433为诊断截断值)对测试集的116例结直肠癌患者、33例结直肠癌前病变患者、195例健康志愿者进行诊断，诊断测试集的价值结果见表18。
表18结直肠癌诊断模型诊断测试集的价值
4.2结直肠癌诊断模型的诊断价值
使用联合因子诊断模型(以2.433为诊断截断值)对全体受试人员(包括训练集、测试集)进行诊断，其诊断价值结果见表19。结直肠癌诊断模型的准确率为91.9％、灵敏度为83.3％、特异性为96.6％、漏诊率为16.7％、误诊率为3.4％、阳性预测值93.2％、阴性预测值91.3％、阳性似然比24.667、阴性似然比0.172。
同时，使用cea(以5ng/ml为诊断截断值)对全体受试人员进行诊断，诊断价值结果见表20。cea诊断的准确率为71.6％、灵敏度为33.3％、特异性为92.8％、漏诊率为66.7％、误诊率为7.2％、阳性预测值71.9％、阴性预测值71.5％、阳性似然比4.625、阴性似然比0.718。
表明，该联合因子诊断模型对结直肠癌的各项诊断评价指标均优于cea诊断。
表19结直肠癌诊断模型的诊断价值
表20癌胚抗原的诊断价值
在实施例3中血浆靶向氨基酸代谢组学研究基础上，通过logistics回归，基于trp、sar、glu三个氨基酸建立了联合因子诊断模型，诊断模型方程为：联合因子＝0.001×trp+0.029×sar－0.002×glu－9.427(trp、sar、glu单位ng/ml)，联合因子截断值为2.433(小于截断值，诊断为结直肠癌患者)；对结直肠癌的诊断效能高于血浆氨基酸含量单因子、高于临床常用的血清诊断指标cea、afp。该结直肠癌诊断模型对上述血浆样本的诊断准确率为91.9％、灵敏度为83.3％、特异性为96.6％、阳性预测值93.2％、阴性预测值91.3％，各项诊断评价指标均优于cea诊断，具有良好的结直肠癌辅助诊断价值，可用于结直肠癌的诊断。