当前，食品领域掺假尤其是动物肉类掺假十分严重，不仅损害了消费者的利益，也给食品安全带来了潜在风险。传统依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段已远不能满足对肉制品掺假监控的需要。猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅等肉类基本囊括了目前市场80%的禽畜食用肉类，由于价格差异较大，一些不法分子为牟取暴利大肆掺杂使假，损害禽畜产品质量；除此以外，其他掺假的肉类也种类繁多，如马肉①、驴肉②、狐狸肉③、骆驼肉，甚至有在老鼠肉中加入明胶、胭脂红、硝盐等以此冒充羊肉售予顾客④。随着科技含量的日益提高，造假手段也不断翻新，监管部门虽然掌握着一定的鉴定技术，但这些技术主要是对单一物种的检测鉴定，或对常见少数物种的定性鉴定，不能做到定量检测，更无法得知掺假肉品中各成分所占的比例。因此，开发出一种多物种基因快速同步定量检测方法是当前国家市场监督、肉类食品产供销企业和广大消费者对食品安全保证及质量控制的迫切需要。
本室以细胞核基因组DNA为分子靶标进行定量检测。由于基因组DNA在动物体细胞核内拷贝数确定(通常为两份拷贝)，所以通过对基因拷贝数的测定可以直接推算出细胞数目，实现肉类成分的绝对定量，真实地反映不同成分肉类所占的比例。而且，基因组DNA序列相对保守，物种品系覆盖度广，使检测方法有更好的灵活性、适应性和稳定性。本研究选取了猪、牛、鸡、鸭、鹅的保守基因actb及羊的prolactinreceptor基因，通过全局比对针对基因序列的差异位点分别设计了猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅的引物与探针，并分别以Cy5、HEX、FAM、Cyan500、ROX和Red640荧光素进行标记，第一次成功建立了能在同一管中同时检测出猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的六重实时荧光PCR方法，灵敏度高、特异性强、重复性好、高效快速，适用于肉品、奶品、生皮和动物饲料油脂等动物产品中猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的鉴定。
血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。2×HLingenePCRMasterMix购自惠凌生物技术(上海)有限公司，AceQTMqPCRProbeMasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。DNA分子质量MarkerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR生化反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)股份有限公司及德国TibMolbiol公司合成。DNA测序由上海睿迪生物科技有限公司完成。
Mx3000P荧光定量PCR仪为Agilent公司产品，LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪为Roche公司产品，Veriti96-WellThermalCyclerPCR仪为AppliedBiosystems公司产品，GENESPEED416型低速离心机为Gene公司产品，5424型高速离心机为Eppendorf公司产品，FR-200A全自动紫外与可见分析装置为上海复日科技有限公司产品，PowerPacTMUniversal电泳仪为Bio-Rad公司产品。
引物与探针分组配对，分别对猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅6种不同动物DNA进行检测，验证引物与探针的扩增有效性和特异性，建立分别检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的单一荧光PCR方法。用2%琼脂糖凝胶电泳检测目的产物条带，并将DNA模板分别为猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅的荧光定量PCR阳性产物送上海睿迪生物科技有限公司测序，分析比对序列，确定阳性扩增产物是否为目的片段。
分别以猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅为研究对象,反应体系设定为50μl,筛选引物、探针最佳浓度以及最高扩增效率时的最适模板量。单一模板的Real-timeqPCR反应体系：总体积50μl，2×AceQTMqPCRProbeMasterMix25μl(终浓度1×)，50×ROXReferenceDye21μl(终浓度1×)，上、下游引物终浓度在0.1~1.0μmol/L内调整，Taqman探针终浓度在50~250nmol/L内调整，模板上样量不超过5μl(每50μl体系以1μg为上限)，用灭菌MilliQ水补足。依据控制变量法每次试验只设一个变量，以Ct值、荧光增量、扩增效率、重复性和平台期等因素为考察依据，每个成分的浓度筛选重复实验3次，若结果稳定，可确定为最佳浓度值。根据引物与探针的退火温度，以优化好的反应体系摸索PCR最佳反应条件，在“95℃5~10min;95℃10~15s，55~62℃15~45s，35~45个循环”范围内反复进行实验，每次实验只改变一个条件，每个反应条件重复试验3次，以Ct值、荧光增量、扩增效率、平台期和耗时等因素为考察依据，确定最佳反应条件。
6对引物和6条荧光探针组合起来，模板采用相同浓度梯度混合的猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅DNA原液，参照1.3.4部分的方法对六重实时荧光PCR反应体系和反应条件进行优化并完成溶解曲线检测。
利用1.3.6部分建立好的六重实时荧光PCR方法分别对狗、兔、鼠、驴、马、骆驼、猫、鱼、鸽子、火鸡、鸵鸟和梅花鹿等其他12种动物DNA进行六重实时荧光PCR检测，并通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，以评价检测方法的特异性。
依照1.3.5部分的方法，利用六重实时荧光PCR(6-plexqPCR)方法对猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅六种动物的5个(100、10-1、10-2、10-3、10-4)混合梯度模板液进行检测，以确定六重实时荧光PCR方法能检测到的各物种最低模板量(灵敏度)。
经筛选优化，确定了单一荧光PCR的反应体系(50μl)：总体积50μl，2×AceQTMqPCRProbeMasterMix25μl(终浓度1×)，50×ROXReferenceDye21μl(终浓度1×)，上、下游引物各1μl(终浓度0.2μmol/L)，Taqman探针0.5μl(终浓度0.1μmol/L)，模板上样量以每50μl体系不超过1μg为宜，无菌水补足。单一荧光PCR反应条件(两步法)：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火延伸30s，反应循环数40，信号采集设在延伸步骤。
经筛选优化，确定50μl反应体系中各成分分别为：2×AceQTMqPCRProbeMasterMix25μl(终浓度1×)，上、下游引物各0.4μl(终浓度0.08μmol/L)，Taqman探针0.2μl(终浓度0.04μmol/L)，各物种模板上样量每50μl体系不超过160ng为宜，无菌水补足。六重实时荧光PCR反应条件(两步法)：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火延伸30s，反应循环数40，信号采集设在延伸步骤。
与普通PCR相比，多重荧光定量PCR除了要求不同引物对能在同一反应体系中对多个不同模板序列进行特异性扩增以外，还要求添加的不同荧光报告基团标记的多个探针能特异地结合靶序列，准确地对各靶序列进行定量。本研究共设计了6条荧光探针，按照荧光基团Reporter波长大小依次是Cyan500、FAM、HEX、ROX、Red640和Cy5，并双标BBQ、BHQ1、BHQ1、BHQ2、BHQ2和BHQ3作为Quencher。由于相邻通道的荧光可能部分存在overlap，所以本实验还做了颜色补偿(colorcompensation)实验以对数据进行校正。本研究中用到的荧光定量PCR仪LightCycler480/LightCycler480Ⅱ为Roche公司产品，是现今仅少数同时支持六荧光通道检测的仪器；而六通道中第一通道对荧光波长要求太高，Excitation/Emision为440nm/488nm，很少染料能满足要求，本室从德国合成LC480第一通道专用Cyan500荧光探针，真正实现了一次PCR反应同时检测6种动物源性成分的目标，且通过实验验证该方法特异性好、灵敏度高，检测核酸含量可达pg级。本研究采用AceQTMqPCRProbeMasterMix代替传统的PCR反应体系(dNTP、Taq酶、10×PCRbuffer组合体系)，减少了加样的烦琐步骤以及可能产生的污染，同时提高了反应的灵敏度。
上述检测结果表明，目前国内肉制品市场上依然存在着严重的掺假使杂现象，主要为低价肉品冒充高价肉类，如猪肉冒充牛肉、羊肉，鸡肉、鸭肉冒充鹅肉，鸭绒冒充鹅绒等，而火锅用羊肉卷更是羊肉掺假的重灾区。利用本研究建立的六重实时荧光定量PCR方法对肉制品等进行检测，不仅可快速灵敏有效地鉴别猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分，杜绝不法行为，还能提高执法的科学性和效率，加快检疫检验通关速率，切实维护消费者的利益与安全。