成都康华生物制品股份有限公司（简称：康华生物）全资子公司康华动保（成都）生物科技有限公司（简称:康华动保）和杭州佑本动物疫苗有限公司（简称:杭州佑本）技术合作，共同打造了一款用于预防宠物狂犬病的产品---希利斯。
狂犬病是一种致死性传染病，所有温血动物包括人类均可感染，感染后的结局为100%死亡。狂犬病的足迹遍布全球150多个国家和地区，据WHO数据显示，狂犬病每年可造成全球6万左右人类死亡，对人类及动物生命、社会资源及国家公共卫生体系构成严重威胁[1、2]。
狂犬病的最早文字记载见于公元前23世纪的埃什努纳（现伊拉克）法典，该法典规定了主人看管不当致使犬伤致死所应承担的责任。中国早在2500多年前就有狂犬病犬的存在，我国关于狂犬病的记载最早见于《左传》“（鲁）襄公十七年十一月甲午国人逐瘈狗。”其中的“瘈”即疯之意[5]。
在人类对狂犬病认识的过程中，最具有里程碑意义的工作当属19世纪80年代法国科学家路易斯·巴斯德等人的重大发现。巴斯德发现了脑组织（和脊髓）是患者体内病毒所在位置，并证明将病毒注射至脑内后，可以致使感染动物的麻痹和死亡，并认识到连续脑内接种可用于病毒传代。同时，巴斯德及其同事，通过在犬脑硬膜下接种和在家兔脑内连续传代的方法，使街毒变成了固定毒。1885年，巴斯德等人利用固定毒，成功制备了疫苗，从此开启了狂犬病预防的新时代[5、6]现今成熟应用于狂犬病预防的狂犬病疫苗毒株PM株、PV株，均源自于巴斯德株。
狂犬病疫苗生产用细胞培养技术，主要有转瓶培养、细胞工厂培养和生物反应器悬浮培养等。传统的细胞培养工艺如转瓶、细胞工厂等，存在细胞培养过程中外源蛋白污染及产品批次内与批次间不稳定等因素，目前，利用生物反应器实现细胞的大规模培养来生产狂犬病疫苗已成为最普遍的技术，较传统的狂犬病疫苗生产工艺有很大的提升，有效保证了产品批次的稳定性，其中利用生物反应器进行全悬浮细胞大规模培养制备抗原液，更是目前生产宠物狂犬病灭活疫苗最先进的工艺[3、7、8]。
2014年，成都康华生物制品股份有限公司（以下简称：康华生物）生产的“冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)”，商品名:HDCV上市，标志着中国狂犬病疫苗迎来了“人源”时代。康华生物HDCV产品安全性好，适合全人群，且免疫持久性长达10年[4]。
希利斯是康华生物全资子公司康华动保（成都）生物科技有限公司（以下简称:康华动保）和杭州佑本动物疫苗有限公司共同技术合作的一款用于预防宠物狂犬病的产品，创新引用人狂犬病灭活疫苗生产技术-层析纯化，有效去除大分子物质，以及过滤难以去除的蛋白成分和小分子物质，实现病毒蛋白高度纯化，是市面上首个采用层析纯化技术的宠物精制狂犬病疫苗。
那么，疫苗具备什么样的特点才能被判定为精制苗，要从以下指标来看：（1）抗原含量（2）稳定性（3）纯度（4）临床副反应（5）免疫效果。
一
抗原含量
根据《兽用生物制品生产与检验报告》[13]数据显示，随机抽取的4个连续批次希利斯产品成品效力均在6IU/dose以上（平均值为6.975IU），远高于WHO规定的质量标准（≥1IU），见表1。
二
稳定
希利斯采用全悬浮技术进行细胞培养（图1），为数字化可控系统，全程精准监控、调整细胞培养、病毒繁殖过程中的各项工艺参数，合理选择细胞接毒时机，完美控制病毒培养状态，这是单位体积培养液中抗原含量高、产品批次内/间差异小的决定性因素，进而有效的保证了产品质量稳定可控。
图1*希利斯培养罐体（杭州佑本生产车间）
另希利斯的保存期研究实验结果表明，实验疫苗在37℃存放15、30天，2-8℃保存3、6、9、12、18、24、27个月，其外观性状、无菌、安全、效力、异常毒性和内毒素等各项检验都符合《犬狂犬病灭活疫苗(PV/BHK-21株）质量标准规定要求，证明疫苗可在37℃保存30天，在2-8℃保存27个月，产品质量稳定可靠[14]。
三
纯度
由于采用了生物反应器全悬浮大规模培养技术，单位体积培养液中的抗原含量是常规的转瓶培养、细胞工厂培养、微载体悬浮培养方式制备的抗原含量5~10倍，高浓度的抗原是保证后期进行纯化的基础。选取疫苗生产过程中病毒灭活后的浓缩样本及层析纯化样本进行电镜观察，检测病毒粒子的浓缩与纯化效果。电镜观察显示，浓缩样本病毒粒子相对较多，聚集成堆，见图2-A。再经层析纯化后疫苗中的病毒粒子进一步富集，纯度较高，见图2-B。
为了解浓缩和层析纯化后样本中狂犬病病毒蛋白纯度，对浓缩样本及层析样本进行SDS-PAGE电泳检测，见图2-C。泳道1-3分别为希利斯20220201批，6倍稀释的浓缩样本、1#层析样本、2#层析样本。结果可见清晰的与理论上狂犬病病毒结构蛋白份分子量大小符合的条带（G蛋白，约67kDa；N蛋白，约55kDa；M1蛋白，约38kDa；M2蛋白，约26kDa；），经过纯化后的样本，与狂犬病病毒结构蛋白分子质量大小不符的条带几乎不可见；可见，疫苗中杂蛋白去除率高达99.9%。电镜和电泳结果充分地证明了希利斯产品中病毒抗原粒子完整，并且抗原液得到了良好的浓缩和纯化，这是疫苗有效性和安全性的有力保证。
图2*希利斯浓缩及纯化样本电镜观察及SDS-PAGE电泳结果
注：A.浓缩样本电镜观察结果（×20K）；B.层析纯化样本电镜观察结果（×70K）；C.浓缩及层析样本SDS-PAGE电泳图
四
临床副反应
《犬狂犬病灭活疫苗（PV-BHK-21株）安全性研究报告》[15]数据显示，通过用3批实验室制备的希利斯进行的各项安全性试验，试验内容包括：对最小使用日龄(3月龄）比格犬，一次单剂量接种的安全性试验、单剂量重复接种试验、一次超剂量接种试验、对妊娠犬的安全性和生产性能影响试验以及对不同品种犬（如京巴犬、沙皮犬等）的安全性试验，结果表明，所有试验动物未出现明显的局部和全身的反应，对妊娠犬安全且其生产性能不受影响，接种疫苗的豚鼠和小鼠未出现异常。
2022年5月22日康华动保启动的《希利斯临床数据研究试验》数据显示[16],对200多只试验所涉及的犬只品种（比格犬、泰迪、约克夏、法斗、吉娃娃、柯基、西高地、贵宾、中华田园犬、冠毛犬）进行疫苗免疫后临床不良反应观察，希利斯针对试验犬免疫，试验犬均无不良反应发生。
五
免疫效果
根据《希利斯临床数据研究试验》数据[16],试验犬所设计品种及其幼龄犬、老龄犬均能产生有效的狂犬病病毒中和抗体，免疫成功率为100%，结合《希利斯临床数据研究试验》及《狂犬病灭活疫苗（PV／BHK-21株）免疫产生期和免疫持续期的研究报告》[17]数据显示，试验犬在免疫后7天以后均能测到保护性抗体，抗体水平在21天左右到达高峰，之后逐渐下降，至12个月时，抗体水平仍远大于最低保护量0.5IU，在1.0IU以上，见图3-A、3-B。以上研发及临床试验结果表明，希利斯能诱导犬产生良好的免疫应答，免疫效果持久。
图3*希利斯一次免疫犬抗体产生消长规律
注：A.《狂犬病灭活疫苗(PV/BHK-21株)免疫产生期和免疫持续期的研究报告》；B.《希利斯临床数据研究试验》
综上所述，经过链接人用狂犬病灭活疫苗生产-层析纯化技术的希利斯，高效、安全、稳定、临床副反应低，免疫效果持久，这是更高标准的宠物疫苗。希利斯，开启宠物精制苗时代。
参考文献：
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[2]ZhengranLiu;MinLiu;XiaoyanTao;WuyangZhu.VitalSurveillances:EpidemicCharacteristicsofHumanRabies—China,2016–2020[J].ChinaCDCWeekly,2021,3(39):819-821.
[3]DOBARDZICA,IZURIETAH,WOOEJ,etal.2007.Safetyreviewofthepurifiedchickembryocellrabiesvaccine:DatafromtheVaccineAdverseEventReportingSystem(VAERS),1997-2005.Vaccine[J],25:4244-4251.
[4]HuJ,WangS,ZhouR,etal.Long-termimmunityandtheeffectofoneortwoboosterdoseswithalyophilizedhumanrabiesvaccine(humandiploidcells)at10yearspostprimaryvaccinationinChina[J].(DOI:10.1080/21645515.2021.1906601)
[5]扈荣良,等.狂犬病[M].北京:中国农业出版社,2015:1-140.
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[7]俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].2版.北京:中国科学技术出版社,2009:5-96
[8]赵铠,等.医学生物制品学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2007：910-935
[9]李蕾,陈明望,陈飞,郭锦钊,郑嘉莹,李天宇.狂犬病的流行特点及其动物疫苗研究进展[J].中国动物保健,2022,24(01):112-114+117.
[10]谢国怀,卢寒梅,钟群芳,张险朋.动物狂犬病疫苗的研究进展[J].畜牧兽医科技信息,2012(08):6-8.
[13]兽用生物制品生产与检验报告
[14]犬狂犬病灭活疫苗（PV-BHK-21株）保存期研究报告
[15]犬狂犬病灭活疫苗（PV-BHK-21株）安全性研究报告
[16]希利斯（狂犬病灭活疫苗）免疫犬试验报告（）
[17]狂犬病灭活疫苗（PV／BHK-21株）免疫产生期和免疫持续期的研究报告