本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一种猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术：
猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的高死亡率的急性传染病。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(herpesviridae)、猪疱疹病毒属。伪狂犬病毒能感染多种宿主，但猪是该病毒的主要天然宿主、贮存者和传播者。猪伪狂犬病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。
我国猪场自20世纪末开始使用伪狂犬基因缺失疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用ge基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬的临床症状并产生严重的经济损失。有关研究学者对多个省份免疫猪场的临床样品进行了prv野毒的分离鉴定、ge基因序列分析及血清中和试验，结果初步表明新分离prv流行毒株较以往毒株发生明显变异，对小鼠、猪的致病性明显增强；发病仔猪出现瘙痒症状，嗜内脏组织性增强。因此，研制针对此次再发流行毒株的疫苗，十分必要。
目前，免疫接种是pr防控的主要措施。目前，我国应用较多的是barthak61弱毒疫苗株，同时可应用ge抗体elisa方法和基于prvge基因建立的荧光定量pcr等pcr方法来区分感染动物和免疫动的区分。根据检测和监测结果，逐渐实现从猪群中清除prv野毒感染动物并逐步实现prv的净化。因此，一方面研制针对prv变异毒株的候选疫苗株；另一方面，候选疫苗株的应用要与相应的diva(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，所以以prv变异毒株为亲本构建基因缺失病毒是必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能够配合prv净化的diva战略的用于防治国内流行prv变异毒株的prv疫苗株及其用途。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人用st细胞从河北、东北、北京等地的猪场送检的疑似猪伪狂犬病发病猪病料中分离获得6株伪狂犬病毒，对6株prv病毒进行pcr鉴定和gb、ge基因序列测定分析，结果发现6株病毒均与近几年分离的变异株病毒亲缘关系较近，为变异株猪伪狂犬病毒。动物回归试验显示，6株病毒均可引起小鼠、家兔发病或死亡。经仔猪接种试验，分离的bj株毒力最强。通过后期的试验结果表明其免疫原性良好，可作为疫苗研究的候选毒株。
为了配合prv净化的diva战略，进一步的，本发明发明人以亲本毒株prvbj株构建ge/gi双基因缺失毒株(bj-δge/gi株)。为顺利敲除ge/gi基因，首先构建包含egfp表达盒的prv打靶载体(pmd-δge/gi-l-egfp-r)，利用同源重组技术构建了prvbj-δge/gi-egfp株。获得纯化prvbj-δge/gi-egfp株病毒后，利用构建的敲除egfp表达盒的打靶载体(pmd-δge/gi-lr)通过同源重组删除egfp表达盒获得ge/gi双基因缺失毒株(bj-δge/gi株)。通过基因敲除手段去除了bj株的致病基因获得bjc株，为了考察bjc株对仔猪的致病力，进行了攻毒试验。结果显示，仔猪均没有出现伪狂犬临床症状，剖检，亦未见明显病理变化。用2～3周龄prvpcr抗原检测为阴性、中和抗体效价不高于1∶4的健康仔猪，对猪伪狂犬病毒bjc株的最小免疫剂量进行了测定。结果表明：以0.5ml疫苗免疫仔猪，免疫后21日加强免疫一次，攻毒保护率为80％；以1ml以上剂量的疫苗免疫仔猪，免疫后21日加强免疫一次，攻毒保护率为100％；对照组100％发病。说明猪伪狂犬病毒bjc株最小免疫剂量为1ml(107.5/ml)。
在上述研究的基础上，本发明提出了一种猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株，所述的猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株是在猪伪狂犬病病毒bj株的基础上，通过敲除ge和gi双基因构建得到的；
其中，所述的猪伪狂犬病病毒bj株，命名为bj，分类命名为猪伪狂犬病病毒，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：cgmccno.15911，保藏日期为2018年7月11日。
进一步的，本发明还提出了一种构建所述的猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株的方法，包括以下步骤：
(1)pegfp-c1质粒改造
利用bspei和bamhi限制性内切酶酶切pegfp-c1质粒，回收大片段，将该大片段转化dh5α感受态细胞，得到的改造后的质粒命名为pmegfp-c1；
(2)左右同源臂的扩增
利用两对引物，以prvbj株dna为模板进行pcr扩增，得到左右同源臂；
用于左侧同源臂扩增的引物为：
上游引物：atgaattctggcgctgatctccgacc
下游引物：gcattaatgcagcgtcccgtctatcgt
用于右侧同源臂扩增的引物为：
上游引物：cgacgcgttgcccacgcacgaggacta
下游引物：ccctcgagggtggaggcggtggagaaga
(3)含有egfp表达盒的转移载体构建
将改造的pmegfp-c1质粒用asei和mlui两个限制性内切酶进行酶切，回收1584bp大小片段，将左同源臂用ecori和asei进行双酶切；将右同源臂用mlui和xhoi进行双酶切，分别回收酶切后的左右同源臂；将pmd18-t载体用ecori和xhoi进行双酶切后回收大片段；将回收的4个片段用t4dna连接酶进行连接，转化大肠杆菌，挑菌，鉴定，构建成功的质粒命名为pmd-δge/gi-l-egfp-r；
(4)敲除egfp表达盒的转移载体的构建
下游引物：gcacgcgtgcagcgtcccgtctatcgt
分别用ecori、mlui和mlui、xhoi对得到的左右同源臂进行双酶切，将pmd18-t用ecori和xhoi进行双酶切，酶切后回收大片段；将回收的3个dna片段用t4dna连接酶进行连接，转化大肠杆菌，挑菌，鉴定，构建成功的质粒命名为pmd-δge/gi-l-r；
(5)含有egfp表达盒的ge/gi双基因缺失株疫苗株的拯救
将构建的转移载体pmd-δge/gi-l-egfp-r用ecori限制性内切酶进行线性化，线性化的质粒和prvbj株的dna共转染st细胞，转染后的st细胞，置细胞培养箱中培养，待出现细胞病变后，收获病毒，得到的病毒命名为prvbj-δge/gi-egfp；收获病毒进行蚀斑纯化；
(6)不含egfp表达盒的ge/gi双基因缺失株疫苗株的拯救
将pmd-δge/gi-l-r用限制性内切酶ecori进行线性化后，同提取的prvbj-δge/gi-egfp毒株的dna共转染st细胞；转染后，待st细胞细胞病变达到70％～80％时，收获病毒；收获病毒进行蚀斑纯化，挑取不表达绿色荧光的蚀斑，获得不含egfp表达盒的病毒，命名为prvbj-δge/gi，即为所述的猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株。
再进一步，本发明还提出了所述的猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株在制备猪伪狂犬病灭活疫苗中的用途。
更进一步的，本发明还提出了一种猪伪狂犬病灭活疫苗，其含有灭活后本发明所述的猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株。
其中，优选的，取灭菌isa206vg佐剂1体积份，加入灭活后的猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株病毒液1体积份，混合，低速搅拌30～60分钟，制成疫苗。
其中，优选的，灭活前，每毫升病毒含量应≥107.5tcid50。
其中，优选的，所述的灭活是将检验合格的病毒液，缓慢加入终浓度为0.05v/v％的二乙烯亚胺(bei)溶液，边加边搅拌，混合均匀，置30℃灭活48小时，加入终浓度2v/v％硫代硫酸钠溶液终止灭活。
实验证明，使用本发明制备得到的猪伪狂犬病灭活疫苗免疫初产健康猪用于预防猪伪狂犬病，具有安全、产生抗体快、免疫期持久等优点。并且能够与相应的diva(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为prv-batha-k61以及prv-bj的pcr鉴定结果；
m：dl2000marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3：prv-batha-k61；4：prv-bj；
图2为pegfp-c1改造策略；
图3为pmegfp-c1改造质粒双酶切鉴定；
m：dnamarker；1，2：pegfp-c1质粒；3：pmegfp-c1
图4为作用同源臂pcr扩增；
m：dnamarker；r：右同源臂；l：左同源臂；
图5为重组质粒pmd-δge/gi-l-egfp-r双酶切鉴定；
1：pmd-δge/gi-l-egfp-r；m：dnamarker
图6为pmd-δge/gi-l-egfp-r转移载体活性鉴定；
a：转染pegfp-c1质粒293t细胞；b：空白对照293t细胞；c：转染重组质粒pmd-δge/gi-l-egfp-r的293t细胞
图7为重组质粒pmd-δge/gi-l-r双酶切鉴定；
1：pmd-δge/gi-l-r；m：dnamarker
图8为prvbj-δge/gi-egfp鉴定结果；
a：阴性对照；b：prvbj-δge/gi-egfp病毒感染细胞；
图9为重组质粒pmd-δge/gi-l-r双酶切鉴定；
图10为prvbj-δge/gi株荧光鉴定结果；
图11为prvbj-δge/gipcr鉴定结果；
m：dnamarker；1：prv-gef/prv-ger；2：prv-gbf/prv-gb；3：prvide/iup/prvide/idown
图12为接种后14日的仔猪。
a：对照组；b：实验组
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明创造的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明创造的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明创造的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改的替换均落入本发明创造的保护范围内。
实施例1猪伪狂犬病毒bj株的分离鉴定
1材料与方法
1.1病料
试验所用病料来自河北、东北、北京等不同地区、6个发病猪场的仔猪或木乃伊胎儿，发病仔猪表现如下临床症状：体温升高、精神委顿、重度消瘦、运动不协调、发抖、痉挛等。剖检，取每头猪的脑组织、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体作为病料；脑组织作为一份样本，无脑组织者取各内脏器官混合作为病料；将病料剪碎后用研钵研磨彻底，加入一定量pbs后反复冻融3次，4000r/min离心15min，取上清，经0.22μm的滤膜过滤除菌后置-20℃以下保存或立即接种细胞进行分毒，并取病料作pcr测定。
1.2细胞和主要试剂
pk15细胞、st细胞和vero细胞，均由本实验室保存，用于伪狂犬病毒的分离；dmem购自gibco公司；dl2000dnamarker购自宝生物工程(大连)有限公司；pcr试剂盒购自山东大正医疗器械股份有限公司；dna提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；胶回收试剂盒为axygen公司产品；细胞培养液为含8％的灭活胎牛血清、青链霉素各100u(μg)/ml的dmem；琼脂糖为spanish公司产品；其他实验中用到的试剂均为进口或国产分析纯级试剂。
1.3实验动物
4～6周龄小鼠，购自浙江中医药大学；1.5～3.0kg家兔，购自浙江中医药大学；2～3周龄仔猪，购自周边养殖户。
1.4病毒分离
将已长成良好单层的pk15细胞、st细胞和vero细胞，弃去培养液，然后将研磨病料并过滤除菌好的滤液接种到细胞单层，37℃吸附1小时，弃去，然后加入细胞维持液，置37℃、含5％co2培养箱培养，观察至96小时。如有cpe，则置-20℃冰箱、37℃水浴冻融3次收获。如无cpe，则继续盲传3代。
1.5pcr测定
表1扩增prv各基因的引物序列
f：正向引物；r：反向引物。
1.6病毒纯化
将病毒用dmem维持液10倍系列稀释至10-10，取10-3～10-108个稀释度的悬液接种已长成单层的st细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％co2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第一次纯化病毒。
取第一次纯化病毒接种已长成单层的st细胞进行增殖，病变达到80％左右时，冻融3次，取上清用dmem维持液10倍系列稀释，接种已长成单层的st细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％co2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第二次纯化病毒。
按照上述方法将病毒再纯化1次，所得到的纯化病毒即为三次纯化的病毒。测定tcid50后，置-70℃保存备用。
1.7病毒含量测定
将毒液用含2％新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-88个稀释度，分别接种长成良好单层st细胞96孔微量培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。同时设不接毒对照8孔，置37℃、含5％co2培养箱中培养、观察96～120小时，记录细胞病变(cpe)的孔数。按reed-muench法计算tcid50。
1.8动物回归试验
1.8.1家兔接种试验
取1.5～3.0kg的家兔3只，每只分别肌肉接种病毒分离培养物0.5ml，设对照2只，接种后观察家兔精神、饮食及临床表现。
1.8.2小鼠接种试验
取10只4～6周龄左右小鼠，5只每只腹腔接种病毒分离培养物0.2ml，另5只背部脊柱附近皮下注射0.2ml，接种后观察小鼠精神、饮食和临床表现。
1.8.3仔猪接种试验
取2～3周龄仔猪3头，每头滴鼻和肌肉注射各3ml。同时设不攻毒对照猪2头。接种后观察仔猪精神、饮食和临床表现。对死亡的猪及时剖检，发病猪接种后第7天剖检，采集扁桃体分离病毒。
2结果
2.1病毒分离
处理后的滤液接种st细胞，hb株、bj株、hb2株、tj1株、tj2株、jl株于接种后或者盲传1～3代，均出现典型细胞病变，表现为细胞圆缩、脱落，而对照细胞仍能保持完整单层。
2.2病毒纯化
分离的6株病毒分别经有限稀释法克隆纯化3代，病毒含量达到106.0～8.5tcid50/ml。具体结果见表2。
表2纯化病毒毒价测定结果
2.3pcr测定结果
对prv-bj和prv-batha-k61疫苗株进行pcr鉴定，结果prv-batha-k61株扩增出了431bp(gb)和202bp(gg)两条特异性条带，而prv-bj株扩增出了431bp(gb)、316bp(ge)和202bp(gg)的3条特异性电泳条带(图1)。证明了prv-bj含有ge基因，与batha-k61疫苗株不同(ge缺失)，为当前流行的野毒株。经pcr检测hb株、hb2株、tj1株、tj2株、jl株同样为野毒株。
2.4动物回归试验
2.4.1家兔接种试验
6株分离毒接种家兔后，均引起家兔死亡，死亡兔出现奇痒、啃咬接种部位等症状，说明6株分离均为强毒，结果见表3。
表3家兔接种试验结果
2.4.2小鼠接种试验
6株分离毒接种小鼠后，均引起小鼠死亡，说明6株分离毒均为强毒，结果见表4。
表4小鼠接种试验结果
2.4.3仔猪接种试验
6株分离毒接种仔猪后，仔猪发病和死亡程度不一，说明6株分离均为强毒。其中bj株死亡3/3，毒力最强，结果见表5。
表5仔猪接种试验结果
3结论
分离的几株prv，通过病理解剖、病毒分离、细胞培养、毒价测定、病毒形态学观察、pcr鉴定、序列分析、动物回归试验等方法，证实均为强毒。其中，bj株毒价较高，动物回归试验表明是一株强毒株，通过后期的试验结果表明其免疫原性良好，作为疫苗研究的候选毒株。该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：cgmccno.15911，保藏日期为2018年7月11日。
实施例2猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株(bjc株)的构建
1.1病毒与细胞
prvbj株病毒由实施例1分离得到；st细胞和vero细胞由本实验室保存。dh5α感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。
1.2质粒
pegfp-c1由本实验室保存。pmd18-t载体购于takara。
1.3引物设计
引物如下表6所示。
表6prvge/gi敲除中应用的引物
1.4构建策略
利用扩增prv左右同源臂的引物进行pcr扩增以获得构建转移载体的左右同源臂。同时将pegfp-c1利用bspei和bamhi进行双酶切以去除不用的酶切位点，利用asei和m1ui酶切出egfp完整表达盒。按左同源臂-egfp表达盒-右同源臂的顺序插入pmd18-t载体中，从而得到重组转移载体pmd-δge/gi-l-egfp-r。
1.5pegfp-c1质粒改造
为了删除pegfp-c1质粒中多余的克隆位点，利用bspei和bamhi限制性内切酶酶切pegfp-c1质粒，回收大片段。将该大片段转化dh5α感受态细胞，利用大肠杆菌酶系统将质粒补全。提取质粒，用ecori和asei进行验证，改造成功的质粒命名为pmegfp-c1(图2)。
1.6左右同源臂的扩增
利用prvdele/i-lup/prvdele/i-ldown和prvdele/i-rup/prvdele/i-rdown两对引物，以prvbj株dna为模板进行pcr扩增，反应体系如表7。反应条件为95℃10min；95℃60s、65℃45s、72℃90s，35循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳检测，回收相应大小的片段。
表7左右同源臂pcr扩增体系
1.7pmd-δge/gi-l-egfp-r转移载体构建
将改造的pmegfp-c1质粒用asei和mlui两个限制性内切酶进行酶切，回收1584bp大小片段。将左同源臂用ecori和asei进行双酶切；将右同源臂用mlui和xhoi进行双酶切，分别回收酶切后的左右同源臂。将pmd18-t载体用ecori和xhoi进行双酶切后回收大片段。将回收的4个片段用t4dna连接酶进行连接，转化大肠杆菌，挑菌，提取质粒用ecori和xhoi进行双酶切鉴定，构建成功的质粒双酶切后应获得约2.6kb和约3.6kb的两个片段。双酶切体系如表8，37℃酶切过夜。
表8双酶切体系
1.8pmd-δge/gi-l-egfp-r转移载体活性鉴定
将pmd-δge/gi-l-egfp-r转移载体用ecori限制性内切酶进行线性化。将线性化的质粒按照promega磷酸钙转染试剂盒说明书转染vero，培养24至48小时，在显微镜下观察。
1.9敲除egfp表达盒的转移载体
pmd-δge/gi-l-r的构建采用表9中prvdelegfp-lup/prvdelegfp-ldown和prvidegfp-rup/prvidegfp-rdown两对引物，以prvdna为模板进行pcr扩增。pcr反应条件和反应体系如1.6中所述。采用1％琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带。回收的l、r片段，分别用ecori、mlui和mlui、xhoi进行双酶切。将pmd18-t用ecori和xhoi进行双酶切，酶切后回收大片段。将回收的3个dna片段用t4dna连接酶进行连接，转化大肠杆菌，挑菌，提取质粒用ecori和xhoi进行双酶切鉴定，连接成功的质粒应酶切出约2.6kb和约2kb的两条dna片段。
表9构建pmd-δge/gi-l-r转移载体引物
1.10prvdna的提取
将prvbj株接种长成单层的st细胞，待细胞病变达到70％～80％时，弃部分培养基。用细胞刮刀刮下细胞，转入离心管2000rmp离心10min，弃上清。细胞沉淀用tne重悬，然后用酚/氯仿抽提法提取总dna，用te溶解，保存于-80℃备用。
1.11prvbj-δge/gi-egfp的拯救
将构建的转移载体pmd-δge/gi-l-egfp-r用ecori限制性内切酶进行线性化。线性化的质粒和prvbj株的dna共转染融合度约70％的st细胞，共转染操作参照promega磷酸钙转染试剂盒操作说明进行。转染后的st细胞，置细胞培养箱中培养。待出现细胞病变后，收获病毒，得到的病毒命名为bj-δge/gi-egfp。
1.12prvbj-δge/gi-egfp纯化
将收获的bj-δge/gi-egfp病毒液进行10倍梯度稀释，稀释6个梯度。将稀释后的病毒液接种生长于6孔细胞培养板的单层st细胞，吸附1h后，在各孔铺加含1％低熔点琼脂糖和2％fbs的mem，置室温，待琼脂糖凝固后置细胞培养箱中倒置培养。接毒48小时后，在显微镜下观察，标记表达绿色荧光的蚀斑。挑取标记的蚀斑置于无血清dmem中，-80℃反复冻融3次。将挑取的蚀斑液接种st细胞，若仍有绿色荧光，则进行下一轮蚀斑纯化。
1.13prvbj-δge/gi-egfp的pcr鉴定
参照病毒dna快速提取试剂盒说明书，提取prvbj-δge/gi-egfpdna，用prvide/iup/prvide/idown、prv-gbf/prv-gbr、prv-gef/prv-ger、jegfpf/jegfpr4分别进行pcr鉴定。pcr反应体系均为25μl：2×gcbufferii12.5μl；dntpmix(2.5mm/μl)4μl；上游引物(10μm/μl)1μl；下游引物(10μm/μl)1μl；lataq酶0.25μl；prvbj-δge/gi-egfpdna2μl；ddh2o4.25μl。prvide/iup/prvide/idown、prv-gbf/prv-gbr、prv-gef/prv-ger引物pcr反应条件为：95℃10min；95℃50s、60℃45s、72℃90s，35循环；72℃10min。jegfpf/jegfpr4引物的反应条件为：95℃10min；95℃50s、57℃30s、72℃100s，35循环；72℃10min。pcr产物用1％琼脂糖进行电泳检测。
1.14prvbj-δge/gi的构建
为了删除egfp表达盒，将pmd-δge/gi-l-r用限制性内切酶ecori进行线性化后，同按照1.10中方法提取的prvbj-δge/gi-egfpdna共转染st细胞。转染后，待st细胞细胞病变达到70％～80％时，收获病毒。收获病毒进行蚀斑纯化，挑取不表达绿色荧光的蚀斑。蚀斑纯化进行3轮，获得不含egfp表达盒的病毒，命名为prvbj-δge/gi。
1.15prvbj-δge/gi的鉴定
提取prvbj-δge/gidna，应用prvide/iup/prvide/idown、prv-gbf/prv-gbr、prv-gef/prv-ger3进行pcr鉴定。pcr反应体系和反应条件同1.13所述。
2.1pegfp-c1质粒改造
将质粒pegfp-c1用bspei和bamhi进行双酶切删除多余的酶切位点，改造好的质粒用ecori和asei进行双酶切鉴定。由于ecori被删除，改造后的质粒pmegfp-c1仅被asei酶切出一条约4.7kb的一条带，未改造的pegfp-c1质粒被酶切为约1.3kb和约3.4kb的两条条带(图3)。
2.2左右同源臂的扩增
分别用prvdele/i-lup/prvdele/i-ldown和prvdele/i-rup/prvdele/i-rdown两对引物，以prvbj株dna为模板进行pcr，扩增出约1200bp的左同源臂和约874bp的右同源臂(图4)。
2.3pmd-δge/gi-l-egfp-r转移载体构建
构建的转移载体pmd-δge/gi-l-egfp-r，利用ecori和hindiii进行双酶切鉴定，酶切出两条片段均符合预期，分别约2.6kb和约3.6kb的两个片段(图5)，说明prvge/gi双基因缺失转移载体构建成功。
2.4pmd-δge/gi-l-egfp-r转移载体活性鉴定
将构建的转移载体pmd-δge/gi-l-egfp-r转染于293t细胞。转染后24小时至48小时，显微镜下观察到细胞表达绿色荧光蛋白(图6)。
2.5敲除egfp表达盒的转移载体pmd-δge/gi-l-r的构建
构建的pmd-δge/gi-l-r转移载体质粒用ecori和hindiii进行双酶切鉴定，切出约2.6kb和约2kb的两条dna片段，均符合预期(图7)。
2.6prvbj-δge/gi-egfp的构建
将线性化pmd-δge/gi-l-egfp-r转移载体和prvbj株dna共转染st细胞后，36～48小时出现细胞病变，收获的病毒液经5轮蚀斑纯化后，获得了表达绿色荧光蛋白的prvbj-δge/gi-egfp病毒(图8)。
2.7prvbj-δge/gi的构建
egfp表达盒删除用转移载体，经ecori和xhoi进行双酶切切出约5.9kb和约2kb的两个片段(图9)，符合预期结果，说明egfp表达盒删除用转移载体prvbj-δge/gi构建成功。
2.8prvbj-δge/gi的获得
将prvbj-δge/gi-egfpdna和线性化转移载体prvbj-δge/gi共转染至st细胞中，通过蚀斑纯化筛选出不表达绿色荧光蛋白的的基因缺失病毒prvbj-δge/gi(图10)。荧光显微镜下观察结果显示prvbj-δge/gi-egfp基因组中egfp表达盒删除成功。
2.9prvbj-δge/gi的获得
应用prvide/iup/prvide/idown、prv-gbf/prv-gbr、prv-gef/prv-ger3对引物对prvbj-δge/gi进行pcr鉴定。引物prvide/iup/prvide/idown扩增出约1200bp目的条带；引物prv-gbf/prv-gb扩增出366bp目的条带；引物prv-gef/prv-ger未扩增出目的条带，pcr结果均符合预期，说明prvbj-δge/gi构建成功(图11)。
以伪狂犬变异株bj株为亲本，成功构建了ge和gi双基因缺失的伪狂犬病毒bj-δge/gi株，将其命名为prvbjc株。
实施例3猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株(bjc株)对仔猪的致病力研究
prvbjc株(实施例2制备)；st细胞由本实验室保存。
1.2实验动物
2～3周龄健康易感仔猪，pcr法检测prv抗原应为阴性，中和抗体效价均≤1∶4，购入后在动物舍适应至少3天。
1.3ge抗体检测试剂盒idexx公司产品。
1.4实验方法
1.4.1接种及观察
取2～3周龄健康易感仔猪(pcr抗原检测为阴性；猪伪狂犬病血清中和抗体效价不高于1∶4)10头，随机分为2组，每组5头，其中第1组每头滴鼻3ml、肌肉注射3ml(107.0tcid50/m1)；第2组不接种为对照组。隔离饲养。接种后观察14日，记录体温、采食、精神、发病或死亡情况。
1.4.2ge抗体测定按照试剂盒说明书进行操作。
2.1接种后观察14日，接种猪采食、精神正常，见图12；体温正常，与对照猪无差异，体温观察结果见表10。
表10接种后14日内体温观察表
2.2ge抗体检测结果
接种组和对照组仔猪的ge抗体检测结果均为阴性，说明构建的毒株缺失了ge基因，结果见表11。
表11接种后14日接种组与对照组ge抗体检测结果
注：“-”代表抗体阴性。
本发明分离获得的prvbj株可使2～3周龄仔猪发病或死亡，对prvbj株通过基因敲除获得prvbjc株(ge-gi-缺失株)接种2～3周龄仔猪，14日内体温、饮食、精神均正常，ge抗体检测为阴性，说明本发明获得的毒株去除了亲本的致病基因，为一株对仔猪的低毒力病毒株。
实施例4猪伪狂犬病病毒bjc株灭活疫苗的制备
1毒种
制造疫苗用毒种为猪伪狂犬病病毒bjc株，检验用毒种为猪伪狂犬病病毒bj株。无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
2疫苗制造及半成品检验
2.1生产用毒种制备
2.1.1毒种繁殖
将已成长单层的st细胞弃去生长液，按2％的量接种毒种bjc株，加入含2％新生牛血清的dmem细胞培养液，置37℃培养2～3日，当75％以上细胞出现病变时收获，置-15℃以下冻融1次，定量分装，注明收获日期、毒种代数(应不超过5代)等，-35℃以下保存，保存期为6个月。
2.2细胞制备
将st细胞自液氮罐取出，37℃水浴快速融化，1000r/mim离心5分钟，用含10％新生牛血清的细胞培养液悬浮细胞，置37℃、含5％co2培养箱中培养，当长成良好单层时，用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，传代增殖培养。
2.3制苗用毒液的繁殖
2.3.1接种
取已长成单层的细胞转瓶，弃去生长液，按2％的量接种生产用毒种，加入含2％新生牛血清的dmem细胞培养液，置37℃旋转培养，转速为8～10转/小时。
2.3.2收获
接种后每日观察cpe，当cpe达到80％以上时收获，冻融1次，离心或用1μm滤芯除去细胞碎片，收获抗原液。置-15℃以下保存不超过1个月。
2.3.3病毒含量测定
对收获后的抗原液取样，进行测定，每毫升病毒含量应≥107.5tcid50。
2.4灭活
将检验合格的病毒液，缓慢加入终浓度为0.05％的二乙烯亚胺(bei)溶液，边加边搅拌，混合均匀，置30℃灭活48小时，加入终浓度2％硫代硫酸钠溶液终止灭活。灭活后抗原放置2～8℃保存，应不超过1个月。
2.5半成品检验
2.5.1灭活检验
取灭活后的病毒液，按5％的比例接种已长成单层的st细胞，吸附1小时后，换成含2％新生牛血清的细胞维持液，置37℃培养观察5日。收获细胞培养物，冻融，在st细胞上再盲传1次，应无cpe。
2.5.2无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
2.6疫苗制备
取灭菌isa206vg佐剂1份，加检验合格的灭活抗原1份，混合，低速搅拌30～60分钟，制成疫苗。
2.7分装
将疫苗无菌定量分装于灭菌疫苗瓶中，加盖密封，粘贴标签。置2～8℃保存。
4成品检验
4.1性状外观均匀乳剂。
剂型：呈水包油包水剂型(w/o/w)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不破乳，并且水相析出应不超过0.5ml。
黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
实施例5猪伪狂犬病病毒ge/gi双基因缺失株疫苗株(bjc株)的免疫原性研究
1.1疫苗与强毒
prvbjc株(ge-gi-缺失株)灭活疫苗(实施例4制备，107.5tcid50/m1)，攻毒用强毒prvbj株。
2～3周龄健康易感仔猪，采血，pcr法检测prv抗原应为阴性，中和抗体效价均≤1∶4，购入后在动物舍适应至少3天。
1.3ge抗体检测试剂盒、gb抗体检测试剂盒均购自idexx。
1.4免疫攻毒试验
取2～3周龄健康易感仔猪25头，随机分为5组，每组5头，其中第5组为不免疫对照组，第1～4组，分别颈部肌肉免疫prvbjc株疫苗0.5ml、1ml、2ml和3ml，免疫后21日以同样剂量加强免疫一次。加强免疫后21日，连同对照组，每头滴鼻3ml、肌肉注射3ml(107.0tcid50/m1)bj株强毒。攻毒后观察14日，记录体温、采食、精神、发病或死亡情况。
1.5ge抗体和gb抗体测定
在攻毒前对每头免疫猪采血，用ge抗体检测试剂盒和gb抗体检测试剂盒检测血清抗体。
免疫后所有仔猪精神良好，采食饮水正常，接种部位无炎症反应，免疫后24小时偶有个别体温升高，但未超过40.5℃，与对照组相比无明显差异。攻毒后，0.5ml剂量组有1头出现发病症状，体温升高，精神沉郁；其余4头出现一过性体温升高，无其他临床症状。1ml剂量组、2ml剂量组和3ml剂量组猪只攻毒后出现一过性体温升高外，未见其他临床症状。对照组攻毒后5/5发病，在攻毒后第1～2天，所有对照猪体温均升高至41℃以上，出现精神沉郁、减食进而厌食，有的出现转圈、犬坐、共济失调等神经症状，最终死亡3头。攻毒前对免疫组所有猪只均未检测到ge抗体，说明构建的bjc株对仔猪不产生ge抗体。所有免疫猪均检测到gb抗体，说明疫苗诱导猪只产生了免疫应答。具体结果见表12，免疫后攻毒结果见表13。
表12不同免疫剂量的疫苗对仔猪的免疫保护结果
本研究结果表明，猪伪狂犬病毒bjc株的最小免疫剂量(免疫原性)为107.5tcid50/ml免疫1ml，为确保疫苗的免疫效果，推荐剂量为2ml。