猪伪狂犬病免疫评估试剂盒的选择与误区分析
1宁海强2韩玉林3赵军4王爱国
1BioChek.B.V
2河南省焦作市中站区府城办事处兽医站
3河南农业大学牧医工程学院
4河南猪拱门生物科技有限公司
猪伪狂犬病（AD）作为我国猪场普遍存在的重要疫病之一，对养猪生产造成的负面影响和经济损失不言而喻。在当前养猪场将非洲猪瘟和猪蓝耳病作为防控重点的背景下，养殖者对猪伪狂犬病的重视程度有所降低，但猪伪狂犬病的防控和净化依然是目前许多猪场面临的一个不可忽视和回避的话题，尤其是种猪场，猪伪狂犬病阴性场仍是一块金字招牌，不仅仅是猪群健康程度的体现，也是对公司实力的认同并对企业形象有所提升；从另一个角度来讲，目前猪场生物安全普遍提高，为局域乃至全国猪伪狂犬病净化提供了绝佳的机会。
在净化道路上，如何选择合适的能够用于免疫评估AD-gB-ELISA的抗体试剂盒对猪群实时监控免疫状态和感染压力显的尤为重要。下面结合AD-gB-ELISA抗体试剂盒的研发背景及临床应用情况进行分析：
1、AD-gB-ELISA抗体试剂盒研发背景和目的
AD-gB-ELISA抗体试剂盒有两种类型，一类是预警试剂盒，主要用于预警筛查；另一类是免疫评估试剂盒，主要用于疫苗免疫后的效果评估。
欧美研发生产上市ELISA抗体试剂盒的厂家开始于上世纪80年代、大多厂家成立于90年代，而在此期间甚至更早，欧美主要养猪国家（美国、加拿大、法国、德国、英国、荷兰、丹麦等）早已净化猪伪狂犬病，猪瘟、口蹄疫等传染病同样如此。在此地域和时代背景下，生产厂家研发了适用于本国动物疾病早期筛查预警的ELISA抗体试剂盒（如AD-gB-ELISA及CSF-E2-ELISA、FMD-SP-ELISA等），类似目前我国普遍应用的非瘟ELISA抗体试剂盒，不是用于疫苗免疫效果评估，而是用于筛查预警、早期“拔牙”，因此对试剂盒的敏感性要求较高即由感染到抗体转阳要早发现是毋庸置疑。
在上世纪90年代后期，这些用于筛查预警的ELISA抗体试剂盒开始陆续被引进到中国，而中国是一个采用猪伪狂犬病（包括猪瘟、口蹄疫等）疫苗进行免疫的国家，因此普遍存在使用筛查预警的ELISA抗体试剂盒进行免疫效果评估并推广应用的现象及误区。
从整个疫病净化角度而言，非免无疫是最终要实现的目的。欧美国家定期监测猪伪狂犬病野毒感染常采用AD-gB-ELISA试剂盒而非AD-gE-ELISA试剂盒，主要原因是在免疫无疫到非免无疫过渡阶段，部分或个别猪场出于谨慎考虑，不愿意停止疫苗免疫接种，因此采用AD-gB-ELISA试剂盒不仅可以监测猪伪狂犬病野毒感染情况同时可以调查是否进行猪伪狂犬病疫苗免疫接种。
鉴于以上原因，国外常采用AD-gB-ELISA试剂盒进行初筛和预警，监督猪场停止疫苗免疫同时预警是否有ADV野毒感染存在，这是历史原因造成的。正是由于这样的原因，决定了国外的试剂盒首先要考虑敏感性，尽量避免漏检，同时也要尽量避免假阴性存在。若监测出现部分gB抗体阳性，就要进行溯源，必要条件下进行AD-gE-ELISA试剂盒抗体验证，甚至通过PCR以及免疫病理等进一步确诊及验证。
因此用于筛查预警的试剂盒在我国现场推广应用过程中，必然会呈现抗体阳性率很高甚至极高情况出现。而阳性率和保护率是两个不同的概念，阳性率不代表保护力也不代表保护率，因此部分猪群存在抗体阳性率高但保护率、保护力低下的现象，这也是造成这么多年猪伪狂犬病频发、野毒gE抗体阳性率居高不下的一个原因和误区。
2、AD-gB-ELISA抗体试剂盒的差异化
那么目前市售的进口、国产AD-gB-ELISA抗体试剂盒检测数值与中和抗体是否呈线性关系（结果数值能否代表或反映中和抗体水平）、线性系数高低如何，我们通过购买强阳性已知中和抗体水平的高免标准血清（购自中监所）或猪场自制内控高免血清，对高免血清倍比稀释为8-10份，采用不同厂家AD-gB-ELISA试剂盒对稀释不同浓度的标准血清进行抗体检测，将结果导入EXCEL表中制作线性图表，进而清晰直观呈现出不同厂家试剂盒检测结果的线性关系。在进行对比实验过程中，可以对每份稀释好的标准血清平行检测5次，进行重复性分析即稳定性分析。
具体案例如下：（南方区某中国养猪集团总部中心实验室2020-12-20）
表1强阳性血清不同试剂盒检测结果
注：（1）集团总部实验室自制内控高免血清，稀释7份，加上原液共8份；
（2）四个厂家不同类型的gB-ELISA试剂盒，A型试剂盒为间接法（荷兰）、B型为阻断法（美国）、C型为阻断法（法国）、D型为阻断法（美国）；
（3）每个厂家试剂盒对每一份稀释血清平行检测2次、算出平均值和离散度即稳定性分析（仅作参考）。
图1抗体值与阳性血清浓度线性关系
注：（1）每种试剂盒单独一个线性分析图；
（2）横坐标代表高免血清的稀释倍数；
（3）纵坐标代表每种试剂盒检测值。
图2不同厂家试剂盒检测数据回归方程
从表1、图1、图2可以得出以下分析，供大家参考：
（1）A试剂盒（荷兰）所检测的S/P值与中和抗体线性关系高达R2=0.9431，几乎接近完美（R2=1代表完全线性关系），表明A型试剂盒所检测的S/P值能够真实差异化的评价疫苗免疫效果，因所检测的S/P值与中和抗体有一一对应的线性关系；其它三种试剂盒与中和抗体的线性关系相对较差，尤其是C试剂盒（法国），线性关系最差，试剂盒检测结果无法差异化评价血清抗体水平，即无法准确评价猪群疫苗免疫效果；
（2）从图2中可看出，B试剂盒（美国）和D试剂盒（美国）在线性关系方面，两者试剂盒无显著差别，当中和抗体水平处于中低水平时（即稀释倍数较高的阶段，即24-27范围），线性关系较好；当中和抗体水平处于中高水平时（稀释倍数较低的阶段，即20-23范围），线性关系较差，几乎成了一条平行线。即当猪群猪伪狂犬病疫苗免疫效果较差或一般时，用这两个试剂盒所检测的S/N值能够反映疫苗免疫的真实效果（所检测的S/N值与中和抗体呈现一一对应的线性关系），但当猪群猪伪狂犬病疫苗处于高效免疫的时候（即产生的中和抗体水平较高），则用这两个试剂盒所检测的S/N值很难反映疫苗的真实免疫效果。而C试剂盒更差，中和抗体处于低中高任何阶段均不能真实呈现/代表/反映疫苗的免疫效果；
（3）当中和抗体水平处于中、高水平时（即稀释倍数较低阶段），B、C、D三个试剂盒所检测的S/N值均较为聚集，尤其高中和抗体水平时，则聚集更为严重（所检测的S/N值均在0.0~0.1范围），显示离散度非常低即均匀度非常高的一种假象，这就是阻断型/竞争型ELISA抗体试剂盒掩盖真实结果的“地板”现象，即到达一定水平时，再高的中和抗体所检测的S/N值不再发生变化；而A试剂盒（荷兰）因与中和抗体呈线性关系，所以检测值相对均匀分散即离散度较高，可以反映真实结果；
（4）当一个国家、地区或猪场处于非免净化猪伪狂犬病情况下，B/C/D三家gB-ELISA抗体试剂盒用作筛查（即预警）则是比较好的选择，尤其C试剂盒更好（敏感性最强），而A型试剂盒用作筛查（即预警）用则稍逊色；
（5）在亚洲尤其中国，作为猪伪狂犬病疫苗免疫国家，基本不存在抗体阴性猪只，采用特定猪伪狂犬病gB抗体试剂盒所检测的结果呈现阴性，实际上是一种假阴性（非真正抗体阴性猪），仅为母源抗体降低到一定滴度而疫苗的免疫抗体尚未升高到所用特定试剂盒可以检测到的水平；
（6）每种ELISA抗体试剂盒均有Cut-off值（即阴阳分界线），但对猪伪狂犬病疫苗免疫国家而言，相对于分析Cut-off值，对于检测结果的解读方案则更加重要，即通过对所检测的血清结果进行科学解读，能够说明猪群/猪只免疫效果好坏。
总之，猪伪狂犬病gB-ELISA抗体试剂盒的选择较为复杂，虽然市售试剂盒厂家很多，目前只有间接、阻断和竞争性ELISA三种方法，试剂盒质量及稳定性均没有问题，关键是清楚检测目后进行针对性选择。通过上述大型集团中心实验室比对结果表明，间接法AD-gB-ELISA抗体试剂盒更能客观真实评价猪群猪伪狂犬病疫苗免疫效果。在进行试剂盒比对时，除比对试剂盒的稳定性、敏感性、特异性，更要考虑所选试剂盒能否对猪场疫苗免疫状态进行真实评估和客观反映！
参考文献：
1.ArjanStegeman.Aujeszky’sdisease(pseudorabies)viruseradicationcampaignintheNetherlands.VeterinaryMicrobiology55(1997)175-180.
2.ArjanStegeman(1995)Pseudorabiesviruseradicationbyarea‐widevaccinationisfeasible,VeterinaryQuarterly,17:4,150-156,DOI:10.1080/01652176.1995.9694556