本申请要求2015年3月17日提交的美国临时专利申请号62/134,523的权益，其公开内容整体通过引用被并入本文，用于所有目的。
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本申请涉及经由蛋白质o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)通过递送氧气至肿瘤的肿瘤免疫性调节。
发明背景
在小鼠转移性肿瘤模型中，持续补充性充氧(氧合，oxygenation)已显示抑制肿瘤生长和防止肿瘤免疫逃逸——通过抑制a2ar(a2a腺苷受体)腺苷能途径，导致t和nk细胞激活(hatfieldetal.,2015scitranslmed,7(277),277ra230)。具体地，用60％呼吸氧气持续治疗携带mca205、b16或4t1肺转移的小鼠导致转移性病灶集中点数量>2倍减少和存活率增加。这些数据与肿瘤和淋巴细胞低氧减少、活化cd8t细胞(cd8+cd69+cd44+)肿瘤浸润增加、免疫刺激细胞因子和趋化因子上调有关，并且取决于完整的a2ar信号传导。同时，呼吸高氧显示减少肺肿瘤微环境(tme)中treg的数量和抑制其活性——因foxp3、cd39/cd73(a2ar上游的腺苷生成酶)和ctla-4表达减少。最后，持续呼吸高氧增强了肺肿瘤的ctla-4/pd-1双阻断引起的肿瘤消退。
尽管有说服力的临床前证据证实了肿瘤充氧逆转免疫抑制性tme和抑制肿瘤生长的能力，但在人类临床试验中利用高比重或等比重氧气的补充性充氧产生了有限的效果(overgaard,2007jclinoncol,25(26),4066-4074)。这可能是因为可溶性氧气不能有效扩散到距血管～80μm之外，限制了其深入低氧肿瘤组织的渗透。因此，需要这样的氧气递送剂：渗透到患者的肿瘤中以运输氧气超过正常扩散限制，从而充氧低氧微环境以阻碍免疫抑制性途径。这将导致最大限度刺激抗肿瘤免疫响应——无论单独还是组合其它免疫检查点抑制剂和其它癌症免疫治疗方法。
用于递送治疗和其它用途的o2和/或no的h-nox蛋白被描述于美国专利号8,404,631和8,404,632；wo2007/139791、wo2007/139767和wo2014/107171；和us专利申请序号14/530,569，其内容均整体通过引用并入。
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技术实现要素：
在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的低氧诱导因子1α(hif-1α)和/或低氧诱导因子2α(hif-2α)表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽。在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的程序性死亡配体-1(pd-l1)表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽。在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的a2a腺苷受体(a2ar)表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽。
在上述实施方式中的一些实施方式中，肿瘤是脑肿瘤、成胶质细胞瘤、骨肿瘤、胰肿瘤、皮肤肿瘤、头或颈肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胃肿瘤、睾丸肿瘤、子宫内膜肿瘤、子宫颈肿瘤、阴道肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管肿瘤、肠肿瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肉瘤、或鳞状细胞肿瘤。
在一些方面，本发明提供了治疗个体癌症的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽。在一些实施方式中，癌症是脑癌、成胶质细胞瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、黑素瘤、肺癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肛门癌、肝癌、肝细胞癌、胃癌、睾丸癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、肠癌、甲状腺癌、肾上腺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肉瘤、肛门癌或鳞状细胞癌。
在上述方面和实施方式中的一些实施方式中，个体是哺乳动物。在进一步实施方式中，哺乳动物是人(例如，人患者)。在其它实施方式中，哺乳动物是宠物、实验室研究动物、或农场动物。在一些实施方式中，宠物、研究动物或农场动物是狗、猫、马、猴、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、猪、或牛。
在一些实施方式中，本发明提供了调节肿瘤免疫性或治疗个体的癌症的方法，其中o2载体多肽与放射治疗组合给予。在一些实施方式中，放射治疗在给予o2载体多肽后1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20或24小时被给予个体。在一些实施方式中，放射是x-放射。在一些实施方式中，约0.5戈瑞(gray)至约75戈瑞的x-放射被给予。在一些实施方式中，o2载体多肽的给予和/或放射的给予重复进行。在一些实施方式中，给予(给药，administration)重复多于约2次、3次、4次、5次、10次、15次、20次、25次或30次中的任一者。在一些实施方式中，给予在1周、2周、3周、或4周后重复。
在一些实施方式中，本发明提供了调节肿瘤免疫性或治疗个体癌症的方法，其中o2载体多肽与化学治疗或免疫治疗组合给予。在一些实施方式中，化学治疗包括细胞毒素。在一些实施方式中，o2载体多肽的给予和/或化学治疗的给予重复进行。在一些实施方式中，免疫治疗是抗癌疫苗、过继性免疫细胞治疗或靶向免疫检查点调节因子的药剂中的一种或多种。在一些实施方式中，免疫治疗靶向ctla-4、pd1、pd-l1、或免疫检查点调节因子中的一种或多种。在一些实施方式中，过继性免疫治疗是嵌合抗原受体表达t细胞或工程tcr-t细胞。在一些实施方式中，免疫治疗是溶瘤病毒或双特异性t细胞衔接体(bite)。在一些实施方式中，o2载体多肽的给予和/或免疫治疗的给予重复进行。
在上述实施方式中的一些实施方式中，o2载体多肽在药物组合物中。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。在任一上述实施方式的一些实施方式中，o2载体多肽是h-nox蛋白。
在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的低氧诱导因子1α(hif-1α)和/或低氧诱导因子2α(hif-2α)表达的方法，包括向个体给予有效量的h-nox蛋白。在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的程序性死亡配体-1(pd-l1)表达的方法，包括向个体给予有效量的h-nox蛋白。在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的a2a腺苷受体(a2ar)表达的方法，包括向个体给予有效量的h-nox蛋白。
在上述实施方式中的一些实施方式中，肿瘤是脑肿瘤、成胶质细胞瘤、骨肿瘤、胰肿瘤、皮肤肿瘤、头或颈肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胃肿瘤、睾丸肿瘤、子宫内膜肿瘤、子宫颈肿瘤、阴道肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管肿瘤、肠肿瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肉瘤、或鳞状细胞肿瘤。
在一些方面，本发明提供了治疗个体癌症的方法，包括向个体给予有效量的h-nox蛋白。在一些实施方式中，癌症是脑癌、成胶质细胞瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、黑素瘤、肺癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肛门癌、肝癌、肝细胞癌、胃癌、睾丸癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、肠癌、甲状腺癌、肾上腺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肉瘤或鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，本发明提供了调节肿瘤免疫性或治疗个体癌症的方法，其中h-nox蛋白与放射治疗组合给予。在一些实施方式中，放射治疗在给予h-nox蛋白后1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20或24小时被给予个体。在一些实施方式中，放射是x-放射。在一些实施方式中，约0.5戈瑞至约75戈瑞的x-放射被给予。在一些实施方式中，h-nox蛋白的给予和/或放射的给予重复进行。在一些实施方式中，给药重复多于约2次、3次、4次、5次、10次、15次、20次、25次、30次或40次中的任一者。在一些实施方式中，给予在1周、2周、3周、或4周或更久后重复。
在一些实施方式中，本发明提供了调节肿瘤免疫性或治疗个体癌症的方法，其中h-nox蛋白与化学治疗或免疫治疗组合给予。在一些实施方式中，化学治疗包括细胞毒素。在一些实施方式中，h-nox蛋白的给予和/或化学治疗的给予重复进行。在一些实施方式中，免疫治疗是抗癌疫苗、过继性免疫细胞治疗或靶向免疫检查点调节因子的药剂中的一种或多种。在一些实施方式中，免疫治疗靶向ctla-4、pd1、pd-l1、或免疫检查点调节因子中的一种或多种。在一些实施方式中，过继性免疫治疗是嵌合抗原受体表达t细胞或工程tcr-t细胞。在一些实施方式中，免疫治疗是溶瘤病毒或双特异性t细胞衔接体(bite)。在一些实施方式中，h-nox蛋白的给予和/或免疫治疗的给予重复进行。
在上述方面和实施方式中的一些实施方式中，h-nox蛋白是腾冲嗜热厌氧菌(t.tengcongensis)h-nox、嗜肺军团菌(l.pneumophilia)2h-nox、智人(h.sapiens)β1、褐家鼠(r.norvegicus)β1、狼(c.lupus)h-nox、黑腹果蝇(d.melangaster)β1、黑腹果蝇cg14885-pa、秀丽隐杆线虫(c.elegans)gcy-35、点形念珠藻(n.punctiforme)h-nox、新月柄杆菌(c.crescentus)h-nox、奥奈达希瓦氏菌(s.oneidensis)h-nox、或丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)h-nox。在一些实施方式中，h-nox蛋白包括相应于seqidno:2中所示的腾冲嗜热厌氧菌的h-nox结构域的h-nox结构域。
在一些实施方式中，h-nox包括一种或多种远侧袋突变。在一些实施方式中，远侧袋突变是腾冲嗜热厌氧菌h-nox的l144的相应位点处的氨基酸取代。在一些实施方式中，h-nox是包括第144位氨基酸取代的腾冲嗜热厌氧菌h-nox。在一些实施方式中，第144位氨基酸取代是l144f取代。
在一些实施方式中，h-nox蛋白是多聚h-nox蛋白。在一些实施方式中，多聚h-nox蛋白包括单体，其中单体包括h-nox结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，多聚h-nox蛋白是三聚h-nox蛋白。在一些实施方式中，三聚h-nox蛋白包括一个或多个三聚结构域。在一些实施方式中，三聚h-nox蛋白包括3个单体，其中单体包括h-nox结构域和三聚结构域，其中三聚结构域是噬菌体t4三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是折叠子结构域。在一些实施方式中，折叠子结构域包括seqidno:4的氨基酸序列。
在一些实施方式中，h-nox蛋白融合至免疫球蛋白的fc结构域。在一些实施方式中，h-nox蛋白共价结合至聚乙二醇。
在一些实施方式中，h-nox蛋白的o2解离常数在血红蛋白的2数量级之内，并且其中h-nox蛋白的no反应性比血红蛋白的低至少10倍。在一些实施方式中，在20℃下多聚h-nox蛋白的o2解离常数在约1nm和约1000nm之间。在一些实施方式中，在20℃下h-nox蛋白的o2解离常数在约1μm和约10μm之间。在一些实施方式中，在20℃下h-nox蛋白的o2解离常数在约10μm和约50μm之间。在一些实施方式中，在20℃下h-nox蛋白的no反应性小于约700s-1。在一些实施方式中，h-nox蛋白的no反应性比血红蛋白的低至少100倍。在一些实施方式中，h-nox蛋白的no反应性比血红蛋白的低至少1,000倍。在一些实施方式中，在20℃下h-nox蛋白的氧气k解离小于或等于约0.65s-1。在一些实施方式中，在20℃下h-nox蛋白的氧气k解离在约0.21s-1和约0.65s-1之间。在一些实施方式中，在20℃下h-nox蛋白的氧气k解离在约1.35s-1和约2.9s-1之间。在一些实施方式中，在37℃下h-nox蛋白的血红素自氧化速率小于约1h-1。
在上述实施方式中的一些实施方式中，h-nox蛋白在药物组合物中。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，本发明提供了o2载体多肽用于减少个体的肿瘤中的hif-1α和/或hif-2α表达的应用。在一些实施方式中，本发明提供了o2载体多肽用于减少个体的肿瘤中的pd-l1表达的应用。在一些实施方式中，本发明提供了o2载体多肽用于减少个体的肿瘤中的a2ar表达的应用。
在上述应用的一些实施方式中，肿瘤是脑肿瘤、成胶质细胞瘤、骨肿瘤、胰肿瘤、皮肤肿瘤、头或颈肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胃肿瘤、睾丸肿瘤、子宫内膜肿瘤、子宫颈肿瘤、阴道肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管肿瘤、肠肿瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肉瘤、或鳞状细胞肿瘤。
在一些实施方式中，本发明提供了o2载体蛋白用于治疗个体癌症的应用。在一些实施方式中，癌症是脑癌、成胶质细胞瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、黑素瘤、肺癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肛门癌、肝癌、肝细胞癌、胃癌、睾丸癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、肠癌、甲状腺癌、肾上腺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肉瘤、或鳞状细胞癌。
在上述应用的一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人。
在上述应用的一些实施方式中，o2载体多肽是h-nox蛋白。在一些实施方式中，h-nox蛋白是腾冲嗜热厌氧菌h-nox、嗜肺军团菌2h-nox、智人β1、褐家鼠β1、狼h-nox、黑腹果蝇β1、黑腹果蝇cg14885-pa、秀丽隐杆线虫gcy-35、点形念珠藻h-nox、新月柄杆菌h-nox、奥奈达希瓦氏菌h-nox、或丙酮丁醇梭菌h-nox。在一些实施方式中，h-nox蛋白包括相应于seqidno:2中所示的腾冲嗜热厌氧菌的h-nox结构域的h-nox结构域。在一些实施方式中，h-nox包括一种或多种远侧袋突变。在一些实施方式中，远侧袋突变是腾冲嗜热厌氧菌h-nox的l144的相应位点处的氨基酸取代。在一些实施方式中，h-nox是包括第144位氨基酸取代的腾冲嗜热厌氧菌h-nox。在一些实施方式中，第144位氨基酸取代是l144f取代。
在一些方面，本发明提供了调节个体的肿瘤免疫性的试剂盒，包括用于本文上述方法的o2载体蛋白。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括小瓶、容器、安瓿瓶、瓶、罐、或柔性包装中的一种或多种。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括一种或多种缓冲剂。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括使用说明。
附图说明
图1a和1b显示被低氧促进的主要免疫抑制性途径的模型(图1a)和可通过o2载体多肽治疗施加的治疗干预点(图1b)。
图2a-2c显示通过哌莫硝唑(pimonidazole)和hif-1elisa评估的、在peg化三聚体tth-noxl144f单次弹丸剂量后的肿瘤充氧。图2a显示通过竞争性elisa测量的哌莫硝唑水平。图2b显示通过夹心elisa测量的hif-1α水平。各图显示在peg化三聚体tth-noxl144f给予后的哌莫硝唑和hif-1α信号定量。平均值+/-sem。***p<0.001，**p<0.01，通过单程anova和bonferroni事后检验。图2c显示通过夹心h-noxelisa进行的肿瘤的peg化三聚体tth-noxl144f积累评估和以每克肿瘤组织表示的结果。
图3a-3d显示在peg化三聚体tth-noxl144f给予后肿瘤组织充氧的直接测量结果。利用peg化三聚体tth-noxl144f(图3a)、无功能对照tth-nox蛋白(图3c)、或始于po2＝0.44mmhg的100％氧气(图3b)和始于po2＝5mmhg的100％氧气(图3d)治疗肿瘤。
图4显示携带h460肿瘤的小鼠在peg化三聚体tth-noxl144f治疗后的放射效力增强。携带h460皮下异种移植肿瘤(150-300mm3)的小鼠用peg化三聚体tth-noxl144f预先治疗或单独以10gy治疗，照射，提取肿瘤，并处理用于克隆形成分析(clonogenicassay)。7天后在每个肿瘤的三份样品中对细胞数量计数。图上各点表示一种肿瘤的平均存活分数。
图5a-5c显示peg化三聚体tth-noxl144f下调了免疫抑制中涉及的hif-1α靶。携带h460皮下异种移植肿瘤(150-300mm3)的小鼠用peg化三聚体tth-noxl144f预先治疗或单独用介质治疗，并被收集用于qrt-pcr分析。图5a显示vegf的表达。图5b显示glut1的表达。图5c显示pd-l1的表达。
图6a显示融合至腾冲嗜热厌氧菌(thermoanaerobactertengcongensis)l144fh-nox序列c端并且包括his6标签的噬菌体t4fibritin的折叠子结构域的核酸(seqidno:5)和氨基酸序列(seqidno:6)。图6b显示无his6标签的l144fh-nox-折叠子单体的核酸(seqidno:7)和氨基酸序列(seqidno:8)。
图7a-7c显示b16f10皮下肿瘤(图7a)、ct26皮下肿瘤(图7b)和gl261颅内肿瘤(图7c)的肿瘤低氧和t细胞浸润的代表性图像。低氧(上部)和t细胞浸润(中部)通过免疫组织化学显示。下部显示多个肿瘤部分的定量分析结果。显著较少的cd4和cd8t细胞浸润肿瘤的低氧区域。
图8显示在h-nox治疗(omx)或介质对照治疗(veh)后肿瘤低氧区中cd8t细胞的定量。显示代表性图像。低氧区通过免疫组织化学分析用哌莫硝唑标记。在omx治疗后，omx给予前的肿瘤低氧区域中的cd4(数据未显示)和cd8t细胞浸润增加。
图9a和9b显示在h-nox治疗(omx)或介质对照治疗(veh)后肿瘤常氧区和低氧区中的t细胞定量。cd4和cd8t细胞均被评价。评价的肿瘤区域包括肿瘤外周和肿瘤中心的区域。多个部分的定量图像分析结果显示在图9a中，并且代表性图像显示在图9b中。利用碳酸酐酶ix(caix)表达的免疫组织化学分析标记低氧区。在omx治疗后，omx给予前的低氧肿瘤区域中的cd4和cd8t细胞浸润增加。
图10显示作为gl261肿瘤模型的低氧(哌莫硝唑)和cd3血管的免疫组织化学结果。
图11显示犬口腔黑素瘤肿瘤中的h-nox肿瘤渗透、肿瘤低氧和cd8t细胞定位的免疫组织化学分析。组织用苏木精和曙红(h&e)、dna相互螯合染料(dapi)以及抗h-nox(omx)、抗碳酸酐酶ix(caix)和抗cd8的抗体染色，以评估在h-nox(omx)治疗以前的低氧肿瘤区域中的cd8淋巴细胞定位。图像揭示cd8阳性t细胞遍及在h-nox(omx)治疗以前的低氧肿瘤区域定位(caix阳性)。
图13a-13f显示，低氧肿瘤区域具有免疫抑制性并且呈现皮下4t1-luc同系小鼠肿瘤中的t细胞浸润减少。(图13a)哌莫硝唑阳性低氧区和(图13b)cd8-阳性t细胞的肿瘤区域#1的免疫荧光染色，(图13c)用dapi复染来突出核。(图13d)哌莫硝唑阳性低氧区和(图13e)cd4-阳性t细胞的肿瘤区域#2的免疫荧光染色，(图13f)用dapi复染来突出核。
具体实施方式
定义
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域技术人员普遍理解的含义。本领域技术人员还将理解，与本文所述相似或等同的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明。
用于本文时，除非明确另外指出，术语“一个”、“一种”和类似术语的使用指代一种(个)或多种(个)。
在本申请中，除非明确说明或被本领域技术人员理解，“或”的使用意为“和/或”。在多项从属权利要求的环境中，“或”回指多于一个在前独立或从属权利要求。
“大约”一个数值或参数的提及在本文中包括(和描述)针对该数值或参数本身的实施方式。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。
要理解，本文所述发明的方面和实施方式包括“包括”该方面和实施方式、“由该方面和实施方式组成”和“主要由该方面和实施方式组成”。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用来指代氨基酸残基的多聚体，并且不限于最小长度。这种氨基酸残基多聚体可包含天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体、和多聚体。全长蛋白和其片段均被包括在该定义之内。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化、及类似修饰。此外，对于本发明的目的，“多肽”指代包括天然序列的修饰如删除、添加、和取代(性质上总体上是保守的)的蛋白质，只要蛋白质保持期望的活性。这些修饰可以是有意的——如通过定点诱变，或可以是偶然的，如通过产生该蛋白质的宿主的突变或pcr扩增导致的错误。如本文所用，蛋白质可包括共价或非共价结合的2个或更多个亚单位；例如，蛋白质可包括2个或更多个结合的单体。
术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可以可互换地使用，并且指代核苷酸多聚体。这种核苷酸多聚体可包含天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于dna、rna、和pna。“核酸序列”指代构成核酸分子或多核苷酸的核苷酸线性序列。
如本文所用，“h-nox蛋白”意为具有h-nox结构域(命名血红素-一氧化氮和氧气结合域)的蛋白质。h-nox蛋白可包含或可不包含h-nox结构域以外的一种或多种其它结构域。在一些实例中，h-nox蛋白不包括鸟苷酸环化酶结构域。h-nox蛋白可包括或可不包括聚合结构域。
如本文所用，“多聚h-nox蛋白”是包括2个或更多个h-nox结构域的h-nox蛋白。h-nox结构域可以共价或非共价结合。
如本文所用，“h-nox结构域”是通过血红素结合一氧化氮和/或氧气的蛋白质的全部或部分。h-nox结构域可包括血红素，或可被发现是能够结合血红素的脱辅基蛋白(apoproprotein)。在一些实例中，h-nox结构域包括6个α螺旋，然后2个β链，然后1个α-螺旋，然后2个β链。在一些实例中，h-nox结构域相应于seqidno:2中所示的腾冲嗜热厌氧菌h-nox的h-nox结构域。例如，h-nox结构域可与seqidno:2中所示的腾冲嗜热厌氧菌h-nox的h-nox结构域具有至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％的同一性。在一些实施方式中，h-nox结构域可与seqidno:2中所示的腾冲嗜热厌氧菌h-nox的h-nox结构域具有10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-99％或100％的同一性。
如本文所用，“聚合结构域”是促进单体部分结合形成多聚结构的结构域(例如，多肽结构域)。例如，聚合结构域可促进单体h-nox结构域结合生成多聚h-nox蛋白。示例性聚合结构域是t4噬菌体的折叠子结构域，其促进三聚多肽形成。聚合结构域的其它实例包括但不限于arc、poz、卷曲螺旋结构域(包括gcn4、亮氨酸拉链(leucinezippers)、velcro)、子宫珠蛋白、胶原蛋白、3链卷曲螺旋(胞外基质蛋白-1)、血小板反应蛋白(thrombosporins)、trpv1-c、p53、mnt、avadin、抗生蛋白链菌素、bcr-abl、comp、维罗毒素(verotoxin)亚单位b、camkii、rck、和来自n乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白的结构域、stm3548、kaic、tyrr、hcp1、ccmk4、gp41、炭疽保护抗原、气单胞菌溶素、a-溶血素、c4b-结合蛋白、mi-ck、芳基硫酸酯酶a、和病毒衣壳蛋白。
如本文所用，“氨基酸连接序列”或“氨基酸间隔序列”是可用于连接蛋白质的2个结构域的短多肽序列。在一些实施方式中，氨基酸连接序列的长度是1、2、3、4、5、6，7，8，9，10个或多于10个氨基酸。示例性氨基酸连接序列包括但不限于gly-ser-gly序列和arg-gly-ser序列。
如本文所用，“his6标签”指代附接至多肽的包括6个his残基的肽。his6标签可用于促进蛋白质纯化；例如利用针对his6标签的色谱。在纯化后，可利用肽链端解酶切割his6标签。
本文所用的术语“基本上相似的”或“基本上相同的”表示2个或更多个数值之间的相似度足够高，使得本领域技术人员认为在所述数值度量的生物学特征的环境中这2个或更多个数值之间的差异几乎没有或没有生物学和/或统计学显著性。在一些实施方式中，2个或更多个基本上相似的数值相差不大于约5％、10％、15％、20％、25％、或50％中的任一个。
本文所用的短语“基本上减少的”或“基本上不同的”表示2个数值之间的差异度足够高，使得本领域技术人员认为在所述数值度量的生物学特征的环境这2个数值之间的差异具有统计学显著性。在一些实施方式中，2个基本上不同的数值相差大于约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、或90％中的任一个。在一些实施方式中，2个基本上不同的数值相差约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、95％-99％或100％中的任一个。
“天然序列”多肽包括与自然界发现的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可具有来自任何生物体的天然存在的多肽的氨基酸序列。这种天然序列多肽可从自然界分离，或可通过重组或合成方式生成。术语“天然序列”多肽具体地包括该多肽的天然存在的截短形式或分泌形式(例如，胞外结构域序列)、该多肽的天然存在的变体形式(例如，可选拼接形式)和天然存在的等位变体。
多肽“变体”意为在对齐序列和引入间隙(如需，以实现最大百分比序列同一性，而不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。这种变体包括例如这样的多肽：其中在多肽的n端或c端添加、或删除一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，变体将与天然序列多肽具有至少约80％、90％或95％氨基酸序列同一性中的任一个。在一些实施方式中，变体将与天然序列多肽具有约80％-90％、90％-95％或95％-99％氨基酸序列同一性中的任一个。
“进化保守突变”是一种蛋白质中的氨基酸被相同蛋白质家族中的另一种蛋白质的相应位置处的氨基酸置换。
如本文所用，相对于肽、多肽或抗体序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”和“同源性”被定义为，在对齐序列和引入间隙(如需，以实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中的氨基酸残基与具体肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。以确定百分比氨基酸序列同一性为目的的对齐可以本领域技术内的不同方式实现，例如，利用公众可获得的计算机软件，如blast、blast-2、align或megaligntm(dnastar)软件。本领域技术人员可确定适于测量对齐的参数，包括跨越被比较序列全长实现最大对齐所需的任何算法。
如本文所用，“k解离”指代解离速率，如o2或no从蛋白质的释放速率。数值较低的k解离表示较慢的解离速率。
如本文所用，“k结合”指代结合速率，如o2或no与蛋白质的结合速率。数值较低的k结合表示较慢的结合速率。
如本文所用，“氧气亲和力”是指代氧气结合至蛋白质的血红素部分的强度的定性术语。这种亲和力受氧气的k解离和k结合两者影响。数值较低的氧气kd值意味着较高亲和力。
如本文所用，“no稳定性”指代在存在氧气的情况下蛋白质对于no导致的氧化的稳定性或耐受性。例如，蛋白质在存在氧气的情况下结合至no时不被氧化的能力指示蛋白质的no稳定性。在一些实施方式中，小于约50、40、30、10、或5％中任一者的h-nox蛋白在20℃下培育约1、2、4、6、8、10、15、或20小时中任一者后被氧化。
如本文所用，“no反应性”指代血红素结合蛋白的血红素中的铁在存在氧气的情况下被no氧化的速率。以s-1为单位的no反应性的较低数值表示较低的no反应性。
如本文所用，“自氧化速率”指代血红素结合蛋白的血红素中的铁自氧化的速率。以s-1为单位的数值较低的自氧化速率表示较低的自氧化速率。
术语“载体”用于描述可经改造以包含可在宿主细胞中传播(繁殖，propagated)的克隆多核苷酸或多核苷酸的多核苷酸。载体可包括下列元素中的一种或多种：复制起点、调控目标多肽的表达的一种或多种调控序列(如，例如，启动子和/或增强子)、和/或一种或多种可选择的标记基因(如，例如，抗生素抗性基因和可用于比色测定的基因，例如，β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”指代用于在宿主细胞中表达目标多肽的载体。
“宿主细胞”指代可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞，如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。示例性原核细胞包括细菌细胞；例如，大肠杆菌(e.coli)细胞。
本文所用的术语“分离的”指代这样的分子：已经与一般与分子一起在自然界发现或产生的组分中的至少一些分开的分子。例如，多肽在其与产生其的细胞的组分中的至少一些分开时被称为“分离的”。当多肽在表达后被细胞分泌时，将包含多肽的上清液与产生多肽的细胞物理分开被认为是“分离”多肽。类似地，多核苷酸在其不是其一般在自然界被发现所在的较大多核苷酸(如，例如，基因组dna或线粒体dna，在dna多核苷酸的情况下)的部分、或与产生其的细胞的组分中的至少一些分开(例如，在rna多核苷酸的情况下)时被称为“分离的”。因此，在宿主细胞中载体包含的dna多核苷酸可被称为“分离的”。
术语“个体”或“对象”在本文中可互换地用于指代动物；例如，哺乳动物。在一些实施方式中，提供治疗哺乳动物的方法，该哺乳动物包括但不限于，人、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪类、绵羊类、山羊类、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物(sportanimals)、和哺乳动物宠物。在一些实例中，“个体”或“对象”指代需要疾病或障碍治疗的个体或对象。
本文所用的“疾病”或“障碍”指代需要疗的状况。
术语“肿瘤”在本文中用于指代呈现异常高增殖和生长水平的细胞群。肿瘤可以是良性的、恶变前的、或恶性的；恶性肿瘤细胞是癌性的。肿瘤细胞可以是实体肿瘤细胞或白血病肿瘤细胞。术语“肿瘤生长”在本文中用于指代构成肿瘤的一个或多个细胞的增殖或生长，导致肿瘤尺寸相应增加。
如本文所用，“治疗”是获得有益的或期望的临床结果的方法。本文所用的“治疗”涵盖疾病治疗剂在包括人类在内的哺乳动物中的任何给予或施用。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病程度降低、疾病状态稳定化(例如，不恶化)、防止(例如，转移)疾病蔓延、延迟或减缓疾病进程、疾病状态改善或缓和、和缓解(部分或全部)——无论可检测的或是不可检测的。“治疗”还可意为与若不接受治疗的预期生命相比延长生命。“治疗”还包括增殖性疾病的病理后果减少。本发明的方法考虑这些方面治疗中的任意一种或多种。
术语“抑制”(“inhibition”或“inhibit”)指代任何表型特征的减少或停止或该特征的发生、程度、或可能性的减少或停止。“降低”或“抑制”是与参考相比，减少、降低或阻止活性、功能、和/或数量。在某些实施方式中，“降低”或“抑制”意为能够导致总体减少20％或更多。在另一实施方式中，“降低”或“抑制”意为能够导致总体减少50％或更多。在再另一实施方式中，“降低”或“抑制”意为能够导致总体减少75％、85％、90％、95％、或99％。
本文所用的“参考”指代用于比较目的的任何样品、标准、或水平。参考可获自健康和/或无疾病样品。在一些实例中，参考可获自无治疗样品。在一些实例中，参考获自对象个体的无疾病或无治疗样品。在一些实例中，参考获自非对象或患者的一个或多个健康个体。
本文所用的“预防”包括提供关于可易患疾病但还未被诊断患有该疾病的对象的疾病发生或复发的预防。
本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如下列的因素而改变：疾病状态、个体年龄、性别、和体重、和物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引起期望的响应的能力。治疗有效量还是治疗有益效果重于物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用的量。治疗有效量可在一种或多种给予中递送。
术语“药物制剂”和“药物组合物”指代这样的制剂：其形式使活性成分(一种或多种)的生物学活性有效，并且其不包含对于该制剂所给予的对象有不可接受的毒性的额外组分。这种制剂可以是无菌的和基本上不含内毒素的。
“药学上可接受的载体”指代本领域通常与治疗剂一起应用共同构成给予对象的“药物组合物”的无毒固体、半固体、或液体填充剂、稀释剂、封装材料、制剂辅料、或载体。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且与制剂的其它成分是可相容的。药学上可接受的载体适于所用制剂。
“无菌”制剂是无菌的或基本上不含活体微生物及其孢子。
与一种或多种进一步治疗剂“组合”给予包括同时(并行)和连续或以任何顺序相继给予。
如本文所用，“结合”指代一种治疗模式附加另一治疗模式的给予。由此，“结合”指代一种治疗模式在另一种治疗模式给予之前、期间或之后给予个体。
术语“包装插入物”用于指代治疗产品的商品包装中通常包括的、包含关于适应症、用法、用量、给药、组合治疗、涉及这种治疗产品使用的禁忌症和/或警告的信息的说明书。
“制造制品”是包括至少一种试剂——例如，治疗疾病或障碍(例如，癌症)的药物、或特异性检测本文描述的生物标记物的探针——的任何制造品(例如，包装或容器)或试剂盒。在某些实施方式中，制造品或试剂盒作为执行本文描述的方法的单元被促进、分配、或销售。
h-nox蛋白
h-nox蛋白家族概述
多聚h-nox蛋白
来自腾冲嗜热厌氧菌的示例性h-nox结构域为约26.7kdal。在一些实施方式中，多聚h-nox蛋白具有大于约50kdal、75kdal、100kdal、125kdal，至约150kdal中任一者的原子质量。
本发明提供了这样的多聚h-nox蛋白：在给予h-nox蛋白至个体后，与包括单个h-nox结构域的相应单体h-nox蛋白相比，该多聚h-nox蛋白显示在个体的一个或多个组织中积累较多。相应的h-nox蛋白指代包括多聚h-nox蛋白的h-nox结构域中的至少一个的h-nox蛋白单体形式。多聚h-nox积累优先的组织包括但不限于肿瘤和血管损伤组织。在一些实施方式中，多聚h-nox蛋白在哺乳动物中在给予h-nox蛋白至个体后维持至少约1、2、3、4、6、12或24小时。在一些实施方式中，多聚h-nox蛋白在哺乳动物中在给予h-nox蛋白至个体后维持约1-2、2-3、3-4、4-6、6-12或12-24小时。在一些实施方式中，小于约10％的多聚h-nox在给予h-nox蛋白至个体后的少于约1小时、2小时或3小时中的任一者之内通过肾从哺乳动物清除。
在一些实施方式中，h-nox结构域在相应位置具有与腾冲嗜热厌氧菌h-nox的下列远侧袋残基中的任一种相同的氨基酸：thr4、ile5、thr8、trp9、trp67、asn74、ile75、phe78、phe82、tyr140、leu144、或前述2种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，h-nox结构域在相应于腾冲嗜热厌氧菌h-nox的pro115或arg135的位置处分别具有脯氨酸或精氨酸——基于其氨基酸序列的序列对齐。在一些实施方式中，h-nox结构域具有组氨酸——相应于褐家鼠β1h-nox的his105。在一些实施方式中，h-nox结构域具有或预期具有如下二级结构：包括6个α-螺旋，然后2个β链，然后1个α-螺旋，然后2个β链。对于h-nox蛋白，这种二级结构已被报告。
如需，可利用标准方法测试新鉴定的h-nox蛋白或h-nox结构域以确定其是否结合血红素。可利用标准方法——如本文描述的那些、通过确定h-nox结构域是否结合o2来测试h-nox结构域充当o2载体的能力。如需，可将本文描述的突变中的一种或多种引入h-nox结构域，以优化其作为o2载体的特性。例如，可引入一个或多个突变以改变其o2解离常数、氧气k解离、血红素自氧化速率、no反应性、no稳定性或前述2种或更多种的任意组合。标准技术，如本文描述的那些，可用于测量这些参数。
突变型h-nox蛋白
在本发明的一些实施方式中，多聚h-nox蛋白的突变型h-nox蛋白或突变型h-nox结构域的序列不同于自然界存在的所有h-nox蛋白或结构域。在不同实施方式中，突变蛋白的氨基酸序列与自然界存在的h-nox蛋白的相应区域具有至少约10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99、或99.5％同一性中的任一者。在不同实施方式中，突变蛋白的氨基酸序列与自然界存在的h-nox蛋白的相应区域具有约10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-99％、或99.5％的同一性。在一些实施方式中，突变蛋白是包含来自全长蛋白的至少约25、50、75、100、150、200、300、或400个连续氨基酸中的任一者的蛋白质片段。在一些实施方式中，突变蛋白是包含来自全长蛋白的25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-300、或300-400个连续氨基酸的蛋白质片段。序列同一性可被测量——例如，利用序列分析软件，以其中指定的默认参数(例如，thegeneticscomputergroup,universityofwisconsinbiotechnologycenter,1710universityavenue,madison,wi53705的序列分析软件包)。该软件程序通过给不同氨基酸置换、删除和其它修饰指定同源性程度来匹配相似序列。
在本发明的一些实施方式中，突变型h-nox蛋白或多聚h-nox蛋白的突变型h-nox结构域包括一个或多个氨基酸的插入(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的插入)。在本发明的一些实施方式中，突变型h-nox蛋白或突变型h-nox结构域包括一个或多个氨基酸的删除(例如，n端、c端、和/或内部残基的删除，如至少约5、10、15、25、50、75、100、150、200、300、或更多个氨基酸中的任一者的删除或5-10、10-15、15-25、25-50、50-75、75-100、100-150、150-200、200-300、或300-400个氨基酸的删除)。在本发明的一些实施方式中，突变型h-nox蛋白或突变型h-nox结构域包括一个或多个氨基酸的置换(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的置换)、或前述2种或更多种的组合。在一些实施方式中，突变蛋白与自然界存在的蛋白质相比具有至少一个氨基酸变化。在一些实施方式中，突变型核酸序列编码与自然界存在的蛋白质相比具有至少一个氨基酸变化的蛋白质。在一些实施方式中，核酸不是编码氨基酸序列与自然界存在的蛋白质相同的蛋白质的、自然界存在的核酸的简并形式。
在一些实施方式中，h-nox蛋白或多聚h-nox蛋白的h-nox结构域中的突变是进化保守突变(也称i类突变)。i类突变的实例列举在表1a中。在表1a中，突变根据人β1h-nox的序列来编号/注释，但所有h-nox序列的突变都是相似的。因此，任何其它h-nox蛋白中的相应位置可突变成所示残基。例如，人β1h-nox的phe4可突变成酪氨酸，因为其它h-nox蛋白在该位置处具有酪氨酸。相应的苯丙氨酸残基可突变成任何其它h-nox蛋白中的酪氨酸。在具体实施方式中，一个或多个突变受限于进化保守残基。在一些实施方式中，一个或多个突变可包括至少一种进化保守突变和至少一种非进化保守突变。如需，基于本文提供的教导，对这些突变型h-nox蛋白进行针对no/o2解离常数、no-反应性、稳定性、和生理相容性的经验筛选。
表1a.靶向进化保守残基的示例性i类h-nox突变
在一些实施方式中，突变是远侧袋突变，如α-螺旋a、d、e、或g中的残基的突变(pellicena,p.etal.(2004年8月31日).procnatl.acadsciusa101(35):12854-12859)。示例性远侧袋突变(也称ii类突变)列举在表1b中。在表1b中，突变根据人β1h-nox的序列来编号/注释，但所有h-nox序列都是相似的。由于在各所述残基处数种取代提供可变的突变，各所示位置处的残基可变成任何其它天然存在或非天然存在的氨基酸(表示为“x”)。这种突变可产生具有多种期望的亲和力、稳定性、和反应性特性的h-nox蛋白。
表1b.靶向远侧袋残基的示例性ii类h-nox突变
不在远侧袋中的残基也可影响血红素基团的三维结构；此结构进而影响o2和no与血红素基团中的铁的结合。因此，在一些实施方式中，h-nox蛋白或多聚h-nox蛋白的h-nox结构域具有远侧袋之外的一个或多个突变。可突变但不在远侧袋中的残基的实例包括腾冲嗜热厌氧菌h-nox的pro115和arg135。在一些实施方式中，突变在包括his105作为连接血红素铁的残基的近侧袋中。
在一些实施方式中，当存在2个或更多个突变时；至少一个突变在远侧袋之中，并且至少一个突变在远侧袋之外(例如，近侧袋中的突变)。在一些实施方式中，所有突变均在远侧袋中。
本发明还涉及本文描述的突变的任意组合，如双突变，三突变、或更高的多突变。例如，本文描述的任何突变的组合可在相同h-nox蛋白中进行。注意，本发明还包括其它哺乳动物或非哺乳动物h-nox蛋白中的同等位置处的突变。示例性突变型h-nox蛋白或突变型h-nox结构域包括使o2或no配体结合相对于相应的野生型h-nox结构域改变的一个或多个突变，并且作为生理相容性哺乳动物o2血液气体载体而工作。
突变的残基编号表示在所述具体h-nox蛋白的序列中的位置。例如，腾冲嗜热厌氧菌i5a指代腾冲嗜热厌氧菌h-nox中第五位的异亮氨酸被丙氨酸置换。相同的异亮氨酸向丙氨酸的突变可在任何其它h-nox蛋白或h-nox结构域中的相应残基处进行(该残基可以是或可以不是其它h-nox蛋白序列中的第五残基)。由于哺乳动物β1h-nox结构域的氨基酸序列相差至多2个氨基酸，在被引入野生型大鼠β1h-nox蛋白时产生期望的突变型h-nox蛋白或h-nox结构域的突变，在被引入诸如人的其它哺乳动物的野生型β1h-nox蛋白或h-nox结构域时，也被预期产生期望的突变型h-nox蛋白或h-nox结构域。
在一些实施方式中，h-nox蛋白是包括3个腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域和3个折叠子结构域的三聚体。在一些实施方式中，h-nox蛋白是包括3个腾冲嗜热厌氧菌w9f/l144fh-nox结构域和3个折叠子结构域的三聚体。在一些实施方式中，h-nox蛋白是包括3个腾冲嗜热厌氧菌野生型h-nox结构域和3个折叠子结构域的三聚体。
h-nox蛋白的修饰
在一些实施方式中，h-nox蛋白包括多种标签中的一种；例如协助h-nox蛋白纯化。标签的实例包括但不限于his6、flag、gst、和mbp。在一些实施方式中，h-nox蛋白包括多个his6标签中的一个。一个或多个his6标签可在多聚h-nox蛋白使用前被去除；例如，通过用肽链端解酶处理。在一些实施方式中，h-nox蛋白是包括3个腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域、3个折叠子结构域、和3个his6标签的三聚体。在一些实施方式中，h-nox蛋白是包括3个腾冲嗜热厌氧菌w9f/l144fh-nox结构域、3个折叠子结构域、和3个his6标签的三聚体。在一些实施方式中，h-nox蛋白是包括3个腾冲嗜热厌氧菌野生型h-nox结构域、3个折叠子结构域、和3个his6标签的三聚体。
聚合结构域
连接体可用于将聚合结构域接合至h-nox结构域；例如，例如，氨基酸连接体。在一些实施方式中，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个氨基酸中的任一者的连接体可布置在聚合结构域与h-nox结构域之间。示例性连接体包括但不限于gly-ser-gly和arg-gly-ser连接体。
噬菌体t4fibritin三聚结构域
示例性聚合结构域是噬菌体t4的折叠子结构域。来自噬菌体t4的wac基因编码fibritin蛋白——具有c端三聚结构域(残基457-483)的486个氨基酸的蛋白质(efimov,v.p.etal.(1994)jmolbiol242:470-486)。该结构域能够在体外和体内使fibritin三聚(boudko,s.p.etal.(2002)eurjbiochem269:833-841；letarov,a.v.,etal.,(1999)biochemistry(mosc)64:817-823；tao,y.,etal.,(1997)structure5:789-798)。分离的27残基三聚结构域，常被称为“折叠子结构域”，已被用于在多种不同蛋白质(包括hiv包膜糖蛋白(yang,x.etal.,(2002)jvirol76:4634-4642)、腺病毒粘附素(papanikolopoulou,k.,etal.,(2004)jbiolchem279:8991-8998；papanikolopoulou,k.etal.(2004)jmolbiol342:219-227)、胶原蛋白(zhang,c.,etal.(2009)biotechnolprog25:1660-1668)、噬菌体p22gp26(bhardwaj,a.,etal.(2008)proteinsci17:1475-1485)、和狂犬病病毒糖蛋白(sissoeff,l.,etal.(2005)jgenvirol86:2543-2552)中构建嵌合三聚体。折叠子结构域的示例性序列显示在图1中并通过seqidno:4提供。
分离的折叠子结构域折叠成单个β-发夹结构并且三聚成为包括3个发夹的β-螺旋桨结构(guthe,s.etal.(2004)jmolbiol337:905-915)。单独折叠子结构域的结构已通过nmr确定(guthe,s.etal.(2004)jmolbiol337:905-915)，并且数个蛋白质与折叠子结构域三聚的结构以通过x射线晶体学解决(papanikolopoulou,k.,etal.,(2004)jbiolchem279:8991-8998；stetefeld,j.etal.(2003)structure11:339-346；yokoi,n.etal.(2010)small6:1873-1879)。结构域折叠并且三聚，迅速降低错折叠中间体或离途低聚(off-pathwayoligomerization)产物的可能性(guthe,s.etal.(2004)jmolbiol337:905-915)。折叠子结构域非常稳定，能够在>10％sds、6.0m盐酸胍、或80℃时保持三级结构和低聚(bhardwaj,a.,etal.(2008)proteinsci17:1475-1485；bhardwaj,a.,etal.(2007)jmolbiol371:374-387)，并且可提高融合至折叠子结构域的序列的稳定性(du,c.etal.(2008)applmicrobiolbiotechnol79:195-202)。
在一些实施方式中，h-nox结构域的c端连接至折叠子结构域的n端。在其它实施方式中，h-nox结构域的n端连接至折叠子结构域的n端。在再其它实施方式中，h-nox结构域的c端连接至折叠子结构域的c端。在一些实施方式中，h-nox结构域的n端连接至折叠子结构域的c端。
在一些实施方式中，连接体用于接合折叠子结构域至h-nox结构域。在一些实施方式中，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个氨基酸中任一者的连接体可布置在聚合结构域与h-nox结构域之间。示例性连接体包括但不限于gly-ser-gly和arg-gly-ser连接体。在一些实施方式中，本发明提供了三聚h-nox蛋白，其从n端至c端包括：腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接体、和折叠子结构域。在一些实施方式中，本发明提供了三聚h-nox蛋白，其从n端至c端包括：腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接体、折叠子结构域、arg-gly-ser氨基酸连接体、和his6标签。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域包括l144f突变。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域包括w9f突变和l144f突变。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域是野生型h-nox结构域。
单体h-nox结构域亚单位
一方面，本发明提供了可结合形成多聚h-nox蛋白的重组单体h-nox蛋白(即，多聚h-nox蛋白的单体h-nox亚单位)。在一些实施方式中，本发明提供了重组h-nox蛋白，其包括本文描述的h-nox结构域和聚合结构域。h-nox结构域和聚合结构域可共价连接或非共价连接。在一些实施方式中，重组单体h-nox蛋白的h-nox结构域的c端连接至聚合结构域的n端。在其它实施方式中，重组单体h-nox蛋白的h-nox结构域的n端连接至聚合结构域的n端。在再其它实施方式中，重组单体h-nox蛋白的h-nox结构域的c端连接至聚合结构域的c端。在一些实施方式中，重组单体h-nox蛋白的h-nox结构域的n端连接至聚合结构域的c端。在一些实施方式中，重组单体h-nox蛋白不包括鸟苷酸环化酶结构域。
在一些实施方式中，单体h-nox蛋白包括野生型h-nox结构域。在本发明的一些实施方式中，单体h-nox蛋白包括h-nox结构域中的一个或多个突变。在一些实施方式中，与相应的野生型h-nox结构域相比，一个或多个突变改变o2解离常数、氧气k解离、血红素自氧化速率、no反应性、no稳定性或前述2种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，突变是远侧袋突变。在一些实施方式中，突变包括不在远侧袋中的突变。在一些实施方式中，远侧袋突变相应于腾冲嗜热厌氧菌的l144突变(例如，l144f突变)。在一些实施方式中，重组单体h-nox蛋白包括相应于腾冲嗜热厌氧菌的w9和l144突变的2个远侧袋突变(例如，w9f/l144f突变)。
在一些方面，本发明提供了结合形成三聚h-nox蛋白的重组单体h-nox蛋白。在一些实施方式中，重组h-nox蛋白包括h-nox结构域和三聚结构域。在一些实施方式中，三聚结构域是本文讨论的折叠子结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域是腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域的c端共价连接至折叠子结构域的n端。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域的c端共价连接至折叠子结构域的c端。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌结构域是l144fh-nox结构域。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌结构域是w9f/l144fh-nox结构域。在一些实施方式中，腾冲嗜热厌氧菌结构域是野生型h-nox结构域。
在一些实施方式中，h-nox结构域利用氨基酸连接序列共价连接至聚合结构域。在一些实施方式中，氨基酸连接序列的长度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个氨基酸。示例性氨基酸连接序列包括但不限于gly-ser-gly序列和arg-gly-ser序列。在一些实施方式中，多聚h-nox蛋白是三聚h-nox蛋白，其包括3个h-nox结构域和3个三聚序列，其中h-nox结构域通过氨基酸连接序列共价连接至三聚结构域。在一些实施方式中，单体h-nox蛋白从n端至c端包括下列：l144f腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、和折叠子结构域。在一些实施方式中，单体h-nox蛋白从n端至c端包括下列：w9f/l144f腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、和折叠子结构域。在一些实施方式中，单体h-nox蛋白从n端至c端包括下列：野生型腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、和折叠子结构域。
在一些实施方式中重组单体h-nox蛋白包括seqidno:6或seqidno:8的氨基酸序列。
野生型和突变型h-nox蛋白的特征
在不同实施方式中，包括多聚h-nox蛋白在内的h-nox蛋白的o2k解离在20℃下在约0.01至约200s-1之间，如约0.1至约200-1、约0.1至100s-1、约1.0至约16.0s-1、约1.35至约23.4s-1、约1.34至约18s-1、约1.35至约14.5s-1、约0.21至约23.4s-1、约1.35至约2.9s-1、约2至约3s-1、约5至约15s-1、或约0.1至约1s-1。在一些实施方式中，h-nox蛋白的氧气k解离在20℃下小于或等于约0.65s-1(如在20℃下约0.21s-1至约0.65s-1之间)。
在不同实施方式中，包括多聚h-nox蛋白在内的h-nox蛋白的o2k结合在20℃下在约0.14至约60μm-1s-1之间，如约6至约60μm-1s-1、约6至12μm-1s-1、约15至约60μm-1s-1、约5至约18μm-s-1、或约6至约15μm-1s-1。
在不同实施方式中，包括多聚h-nox蛋白在内的h-nox蛋白的动力学或计算的o2结合kd在约1nm至1mm、约1μm至约10μm、或约10μm至约50μm之间。在一些实施方式中，计算的o2结合kd在20℃下是约2nm至约2μm、约2μm至约1mm、约100nm至约1μm、约9μm至约50μm、约100μm至约1mm、约50nm至约10μm、约2nm至约50μm、约100nm至约1.9μm、约150nm至约1μm、或约100nm至约255nm、约20nm至约2μm、20nm至约75nm、约1μm至约2μm、约2μm至约10μm、约2μm至约9μm、或约100nm至500nm中的任一者。在一些实施方式中，动力学或计算的o2结合kd在20℃下小于约100nm、80nm、50nm、30nm、25nm、20nm、或10nm中的任一者。
在不同实施方式中，包括多聚h-nox蛋白在内的h-nox蛋白的动力学或计算的o2结合kd在相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的约0.01至约100倍之内，如在相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的约0.1至约10倍之间或约0.5至约2倍之间。在不同实施方式中，h-nox蛋白的动力学或计算的no结合kd在相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的0.01至约100倍之内，如相同条件下(如在20℃下)的血红蛋白的约0.1至约10倍之间或约0.5至约2倍之间。
在一些实施方式中，小于约50、40、30、10、或5％的包括多聚h-nox蛋白在内的h-nox蛋白中的任一者在20℃下培育约1、2、4、6、8、10、15、或20小时中的任一者后被氧化。
在不同实施方式中，包括多聚h-nox蛋白在内的h-nox蛋白的no反应性在20℃下小于约700s-1，如在20℃下小于约600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1、或0.6s-1。在不同实施方式中，h-nox蛋白的no反应性在20℃下在约0.1至约600s-1之间，如在20℃下约0.5至约400s-1、约0.5至约100s-1、约0.5至约50s-1、约0.5至约10s-1、约1至约5s-1、或约0.5至约2.1s-1之间。在不同实施方式中，h-nox蛋白的反应性比相同条件下如在20℃下的血红蛋白的低至少约10、100、1,000、或10,000倍。
在不同实施方式中，包括多聚h-nox蛋白在内的h-nox蛋白的血红素自氧化速率在37℃下小于约1.0h-1，如在37℃下小于约0.9h-1、0.8h-1、0.7h-1、0.6h-1、0.5h-1、0.4h-1、0.3h-1、0.2h-1、0.1h-1、或0.05h-1中的任一者。在不同实施方式中，h-nox蛋白的血红素自氧化速率在37℃下在约0.006至约5.0h-1之间，如在37℃下在约0.006至约1.0h-1、0.006至约0.9h-1、或约0.06至约0.5h-1之间。
在一些实施方式中，包括多聚h-nox蛋白溶液在内的h-nox蛋白溶液的粘度在1和4厘泊(cp)之间。在一些实施方式中，h-nox蛋白溶液的胶粒渗透压在20和50mmhg之间。
o2和/或no结合的测量
本领域技术人员可容易通过本领域已知的方法和下文描述的非限制性示例性方法确定包括多聚h-nox蛋白如三聚h-nox蛋白在内的任何h-nox蛋白的氧气和一氧化氮结合特征。
动力学kd：k解离与k结合的比
确定包括多聚h-nos蛋白在内的野生型和突变型h-nox蛋白的动力学kd值，基本上如boon,e.m.etal.(2005).naturechemicalbiology1:53-59所述，其整体通过引用被并入本文，具体地关于o2结合速率、o2解离速率、o2结合的解离常数、自氧化速率、和no解离速率的测量。
k结合(o2结合速率)
k解离(o2解离速率)
为测量k解离，将蛋白质(5μm血红素)的feii-o2复合体稀释在无氧50mmtea、50mmnacl、ph7.5缓冲剂中，并与包含不同浓度的连二亚硫酸盐和/或饱和co气体的等体积相同缓冲剂(无氧)快速混合。数据在配备有设定至20℃的neslabrte-100恒温浴的hi-techscientificsf-61停流分光光度计(tgkscientificltd.，bradfordonavon，英国)中上获得。作为在437nm下——feii-feii-o2差光谱(differencespectrum)中的最大值——或在425nm下——feii-feii-co差光谱中的最大值——的吸光度增加，监测o2从血红素的解离。利用作为仪器一部分的软件，将最终痕量拟合至单一指数。每次实验进行最多6次，并且所得速率取平均。测量的解离速率无关于连二亚硫酸盐浓度并且无关于饱和co——作为还原后物种的捕集器(trap)，均存在和不存在10mm连二亚硫酸盐。
动力学kd
利用k解离和k结合的测量，通过计算k解离与k结合的比，确定动力学kd。
计算的kd
为测量计算的kd，将上述获得的k解离和动力学kd的值作图。k解离与动力学kd之间的线性关系通过方程式(y＝mx+b)限定。然后将k解离值沿直线内插，以利用excel：mac2004(microsoft,redmond,wa)获得计算的kd。在不存在测量的k结合的情况下，这种内插法提供了将k解离关联至kd的途径。
自氧化速率
与no反应的速率
p50测量
如需，突变型或野生型h-nox蛋白的p50值可如guarnone,r.etal.(1995年9月/10月).haematologica80(5):426-430(其整体通过引用被并入本文，具体地关于p50值的测量)所述测量。p50值利用hemox分析仪来确定。测量室始于0％氧气，并且向100％氧气缓慢地递增地上升。室内的氧气探针测量氧气饱和％。第二探针(uv-vis光)测量2种波长的吸光度——调整至血红素蛋白(例如，与血红素复合的蛋白质如h-nox)uv-vis光谱的α和β峰。这些吸收峰在血红素蛋白结合氧气时线性地增加。然后将从未结合至100％结合的百分比变化针对％氧气值作图，生成曲线。p50是该曲线上50％血红素蛋白结合至氧气的点。
h-nox核酸
本发明还描述了编码本文所述的突变型h-nox蛋白、多聚h-nox、或重组单体h-nox蛋白亚单位中的任一者的核酸。
在一些实施方式中，核酸包括编码2个或更多个h-nox结构域的核酸。在一些实施方式中，包括2个或更多个h-nox结构域的核酸连接，使得多聚h-nox蛋白由该核酸表达。在进一步实施方式中，核酸包括编码一个或多个聚合结构域的核酸。在一些实施方式中，包括2个或更多个h-nox结构域和一个或多个聚合结构域的核酸连接，使得多聚h-nox蛋白由该核酸表达。
在一些实施方式中，核酸包括编码聚合结构域的任何核酸的部分或完整核酸序列。在一些实施方式中，核酸包括编码h-nox结构域和聚合结构域的核酸。在一些实施方式中，编码h-nox结构域的核酸和编码聚合结构域的核酸连接，使得产生的多肽是包括h-nox结构域和聚合结构域的融合蛋白。
在一些实施方式中，核酸包括编码一个或多个his6标签的核酸。在一些实施方式中，核酸进一步包括编码位于编码h-nox结构域、聚合结构域和/或his6标签的核酸之间的连接序列的核酸。
在一些实施方式中，本发明提供了编码h-nox结构域和折叠子结构域的核酸。在一些实施方式中，h-nox结构域是腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域是野生型腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域是腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域是腾冲嗜热厌氧菌w9f/l144fh-nox结构域。
在一些实施方式中，本发明提供了编码下列的核酸(5’至3’)：l144f腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、和折叠子结构域。在一些实施方式中，本发明提供了编码下列的核酸(5’至3’)：w9f/l144f腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、和折叠子结构域。在一些实施方式中，本发明提供了编码下列的核酸(5’至3’)：野生型腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、和折叠子结构域。
在一些实施方式中，本发明提供了编码下列的核酸(5’至3’)：l144f腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、折叠子结构域、arg-gly-ser连接序列、和his6标签。在一些实施方式中，本发明提供了编码下列的核酸(5’至3’)：w9f/l144f腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、折叠子结构域、arg-gly-ser连接序列、和his6标签。在一些实施方式中，本发明提供了编码下列的核酸(5’至3’)：野生型腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域、gly-ser-gly氨基酸连接序列、折叠子结构域、arg-gly-ser连接序列、和his6标签。
在一些实施方式中，核酸包括seqidno:5或seqidno:7中所示的核酸序列。
本发明还包括细胞或细胞群包含编码本文描述的突变型h-nox蛋白的至少一种核酸。示例性细胞包括昆虫、植物、酵母、细菌、和哺乳动物细胞。这些细胞可用于利用标准方法如本文描述的那些方法生产突变型h-nox蛋白。
在一些实施方式中，本发明提供了包括编码h-nox结构域和折叠子结构域的核酸的细胞。在一些实施方式中，h-nox结构域是腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域是野生型腾冲嗜热厌氧菌h-nox结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域是腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域。在一些实施方式中，h-nox结构域是腾冲嗜热厌氧菌w9f/l144fh-nox结构域。在一些实施方式中，本发明提供了包括包含seqidno:5或seqidno:7中所示的核酸序列的核酸的细胞。
h-nox蛋白制剂
在一些实施方式中，药物组合物包括本文描述的一种或多种野生型或突变型h-nox蛋白——包括多聚h-nox蛋白——和药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂的实例包括但不限于，任何标准药物载体或赋形剂如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液，和各种类型的润湿剂。用于气溶胶或胃肠外给予的示例性稀释剂为磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包括这种载体的组合物通过公知常规方法(参见，例如，remington'spharmaceuticalsciences,18thedition,a.gennaro,ed.,mackpublishingco.,easton,pa,1990；和remington,thescienceandpracticeofpharmacy20thed.mackpublishing,2000，其均整体通过引用被并入本文其整体，具体地关于制剂)来配制。在一些实施方式中，制剂是无菌的。在一些实施方式中，制剂基本上不含内毒素。
虽然本领域普通技术人员已知的任何适当载体可用于本发明的药物组合物，但载体类型将取决于给予模式而不同。组合物可配制用于任何适当的给予方式，包括，例如，静脉内、动脉内、囊内、肿瘤内、吸入、腹膜内、肺内、肌内、皮下、气管内、经粘膜、眼内、鞘内、或经皮给予。关于胃肠外给予，如皮下注射，载体可包括，例如，水、盐水、醇、脂肪、蜡、或缓冲剂。关于口服给予，可采用任何上述载体或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、或碳酸镁。可生物降解微球(例如，聚乳酸聚乙醇酸酯(polylactatepolyglycolate))也可用作载体。
在一些实施方式中，药物或非药物组合物包括缓冲剂(例如，中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水等)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖等)、抗氧化剂、螯合剂(例如，edta、谷胱甘肽等)、防腐剂、可用于结合和/或运输氧气的另一化合物、无活性成分(例如，稳定剂，填充剂等)、或前述2种或更多种的组合。在一些实施方式中，组合物被配制为冻干物。h-nox蛋白还可利用公知的技术被封装在脂质体或纳米颗粒内。可用于h-nox蛋白的其它示例性制剂被描述于，例如，美国专利号6,974,795、和6,432,918，其均整体通过引用被并入本文其整体，具体地关于蛋白质制剂。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的野生型或突变型h-nox蛋白。在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的多聚h-nox蛋白，该多聚h-nox蛋白包括2个或更多个野生型或突变型h-nox结构域。在一些实施方式中，药物组合物包含有效量的本文所述的重组单体h-nox蛋白，该重组单体h-nox蛋白包括野生型或突变型h-nox结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，制剂包括三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，制剂包括三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌w9f/l144fh-nox结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，制剂包括三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，制剂包括peg化的三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，药物组合物包括有效调节肿瘤免疫性(例如，增强对肿瘤的免疫响应)的量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)。
在一些实施方式中，给予人的h-nox蛋白有效量在几克至超过约350克之间。h-nox蛋白的其它示例性剂量包括在适当的输注速率如约0.5ml/min下约4.4.、5、10、或13g/dl中的任一者(其中g/dl是输注到循环中之前的h-nox蛋白溶液的浓度)(参见，例如，winslow,r.chapter12inbloodsubstitutes)。将理解，每个剂型的个体剂量所包含的活性成分的单位含量无需自身构成有效量，因为必需的有效量可通过多次给予的组合效果来实现。构成药物组合物的h-nox蛋白量的选择取决于根据本领域普通技术人员确定的所用剂型、所治疗状况、和所实现具体目的。
示例性组合物包括遗传改造(基因工程，geneticallyengineered)重组h-nox蛋白，其可被分离或纯化，相对于相应的野生型h-nox蛋白包括共同赋予改变的o2或no配体结合的一个或多个突变，并且作为生理相容性哺乳动物血液气体载体生效。例如，本文所述的突变型h-nox蛋白。在一些实施方式中，h-nox蛋白是多聚h-nox蛋白。在一些实施方式中，h-nox蛋白是本文所述的重组单体h-nox蛋白，该重组单体h-nox蛋白包括野生型或突变型h-nox结构域和聚合结构域。在一些实施方式中，组合物包括三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，组合物包括三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌w9f/l144fh-nox结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，组合物包括三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域和折叠子结构域。在一些实施方式中，组合物包括peg化的三聚h-nox蛋白，该三聚h-nox蛋白包括3个单体，每个单体均包括腾冲嗜热厌氧菌l144fh-nox结构域和折叠子结构域。
调节肿瘤免疫性的方法
在一些方面，本发明提供了调节携肿瘤个体的肿瘤免疫性的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)。在一些实施方式中，肿瘤免疫性调节包括增强对肿瘤的免疫响应。在一些实施方式中，本发明提供了增加对个体的肿瘤的白细胞浸润的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽。在一些实施方式中，本发明提供了增加对个体的肿瘤的淋巴细胞浸润的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽。在一些实施方式中，对肿瘤的淋巴细胞浸润增加包括cd4细胞、cd8细胞、或nk细胞中的一种或多种的浸润增加。在一些实施方式中，肿瘤免疫性调节包括增加抗原加工。在一些实施方式中，肿瘤免疫性调节包括增加树突状细胞(dc)的呈递能力。在一些实施方式中，肿瘤免疫性调节包括增加对肿瘤的淋巴细胞浸润、增加抗原加工、或增加dc呈递能力中的一种或多种。在一些实施方式中，肿瘤免疫性调节包括淋巴细胞激活。在一些实施方式中，肿瘤免疫性调节包括细胞因子分泌。在一些实施方式中，o2载体多肽是三聚tth-noxl144f多肽。在一些实施方式中，o2载体多肽是peg化的三聚tth-noxl144f多肽。
在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的hif-1α表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)。在一些实施方式中，向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)，导致hif-1α表达减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的hif-1α表达相比，hif-1α表达的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，与无o2载体蛋白治疗情况下的hif-1α表达相比，hif-1α表达减少多于约1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、8hr、10hr、12hr、16hr、20hr、24hr、30hr、36hr、42hr或48hr中的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽是三聚tth-noxl144f多肽。在一些实施方式中，o2载体多肽是peg化的三聚tth-noxl144f多肽。
在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的hif-1α表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)，其中以血管上皮细胞生长因子(vegf)表达减少来测量hif-1α表达的减少。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体的给予导致vegf表达减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的vegf表达相比，vegf表达的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，vegf表达减少——与无o2载体蛋白治疗情况下的vegf表达相比——多于约1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、8hr、10hr、12hr、16hr、20hr、24hr、30hr、36hr、42hr或48hr中的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽是三聚tth-noxl144f多肽。在一些实施方式中，o2载体多肽是peg化的三聚tth-noxl144f多肽。
在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的hif-1α表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)，其中以1型葡萄糖转运体(glut1)的表达减少测量hif-1α表达的减少。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体的给予导致glut1表达减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的glut1表达相比，glut1表达的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，glut1表达减少——与无o2载体蛋白治疗情况下的glut1表达相比——多于约1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、8hr、10hr、12hr、16hr、20hr、24hr、30hr、36hr、42hr或48hr中的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽是三聚tth-noxl144f多肽。在一些实施方式中，o2载体多肽是peg化的三聚tth-noxl144f多肽。
在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的pd-l1表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体的给予导致pd-l1表达减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的pd-l1表达相比，pd-l1表达的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体的给予导致pd-l1与pd-1的相互作用减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的pd-l1与pd1的相互作用相比，pd-l1与pd1的相互作用的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，pd-l1表达减少——与无o2载体蛋白治疗情况下的pd-l1表达相比——多于约1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、8hr、10hr、12hr、16hr、20hr、24hr、30hr、36hr、42hr或48hr中的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽是三聚tth-noxl144f多肽。在一些实施方式中，o2载体多肽是peg化的三聚tth-noxl144f多肽。
在一些实施方式中，本发明提供了个体的肿瘤中的减少a2ar表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体给予导致a2ar表达减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的a2ar表达相比，a2ar表达的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体的给予导致a2ar与腺苷的相互作用减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的a2ar与腺苷的相互作用相比，a2ar与腺苷的相互作用的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，a2ar表达减少——与无o2载体蛋白治疗情况下的a2ar表达相比——多于约中1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、8hr、10hr、12hr、16hr、20hr、24hr、30hr、36hr、42hr或48hr的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽是三聚tth-noxl144f多肽。在一些实施方式中，o2载体多肽是peg化的三聚tth-noxl144f多肽。
在一些实施方式中，本发明提供了减少个体的肿瘤中的hif-2α表达的方法，包括向个体给予有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体的给予导致hif-2α表达减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的hif-2α表达相比，hif-2α表达的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，有效量的o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)对个体的给予导致hif-2α表达减少。在一些实施方式中，与无o2载体多肽治疗情况下的hif-2α表达相比，hif-2α表达的减少多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者。在一些实施方式中，hif-2α表达减少——与无o2载体蛋白治疗情况下的hif-2α表达相比——多于约中1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、8hr、10hr、12hr、16hr、20hr、24hr、30hr、36hr、42hr或48hr的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽是三聚tth-noxl144f多肽。在一些实施方式中，o2载体多肽是peg化的三聚tth-noxl144f多肽。
在一些实施方式中，本发明提供了通过本文描述的任何方法调节个体的肿瘤免疫性(例如，增强对肿瘤的免疫响应)的方法。肿瘤的实例包括但不限于脑肿瘤、成胶质细胞瘤、骨肿瘤、胰肿瘤、皮肤肿瘤、头或颈肿瘤、黑素瘤、肺肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、肝细胞癌、胃肿瘤、睾丸肿瘤、子宫内膜肿瘤、子宫颈肿瘤、阴道肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食管肿瘤、肠肿瘤、甲状腺肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肉瘤、或鳞状细胞肿瘤。
在一些实施方式中，本发明提供了通过本文描述的任何方法调节个体的肿瘤免疫性(例如，增强对肿瘤的免疫响应)的方法，从而提供治疗个体的癌症的方法。可通过本发明的方法治疗的癌症的实例包括但不限于脑癌、成胶质细胞瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、黑素瘤、肺癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肛门癌、肝癌、肝细胞癌、胃癌、睾丸癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、肠癌、甲状腺癌、肾上腺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、肉瘤、或鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，本发明提供了通过本文描述的任何方法调节个体的肿瘤免疫性的方法。在一些实施方式中，个体是哺乳动物；例如，人。在一些实施方式中，哺乳动物是宠物、实验室研究动物、或农场动物。宠物、研究动物或农场动物的非限制性实例包括狗、猫、马、猴、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、猪和牛。
o2载体多肽可通过任何途径给予，包括但不限于静脉内、动脉内、肿瘤内、囊内、吸入、腹膜内、肺内、肌内、皮下、气管内、经粘膜、眼内、鞘内、或经皮给予。
在一些方面，氧气至肿瘤的持续递送是抑制低氧介导的肿瘤免疫性和增强肿瘤免疫响应所期望的。在本发明的一些实施方式中，o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)的给予重复进行。o2载体多肽的给予可重复直到建立起稳健的肿瘤免疫响应。在一些实施方式中，o2载体多肽的给予重复至少约2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、12次、14次、20次、30次、40次、50次或100次中的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽的给予重复约2次和约20次之间。在一些实施方式中，o2载体多肽的给予重复约20次和约40次中的任一者、约40次和约60次中的任一者、约60次和约80次中的任一者、约80次和约100次中的任一者、或其间的任何次数之间。在一些实施方式中，o2载体多肽的给予重复一日一次或两次，重复约42至约84次给予。
示例性用药频率包括但不限于一周至少1、2、3、4、5、6、或7次(即，一日一次)。在一些实施方式中，o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)被给予一天至少2、3、4、或6次。在一些实施方式中，o2载体多肽被每4小时、每8小时、每12小时、每24每小时、每48小时或一周2次或一周3次给予。在一些实施方式中，o2载体多肽被给予下列中的任一者：1小时和2小时之间、2小时和4小时之间、4小时和8小时之间、8小时和12小时之间、或12小时和24小时之间。在一些实施方式中，o2载体多肽每4小时、每8小时、每12小时或每24小时被给予，给予约1至约10天的时期。在一些实施方式中，o2载体多肽可被给予，例如，经几天或几周的时期。在一些实施方式中，o2载体多肽被给予更长时期，如几个月或几年。组合物的用药频率可基于给药医师的判断经各疗程调节。
在一些实施方式中，o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)被弹丸式给予。在一些实施方式中，弹丸体积大于约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、50ml、75ml、或100ml中的任一者。在一些实施方式中，弹丸剂量的给予如上重复。
在一些实施方式中，o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)通过输注被给予。在一些实施方式中，输注大于15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、16小时、20小时或24小时约中的任一者。在一些实施方式中，输注在约15分钟和30分钟、30分钟和1小时、1小时和2小时、2小时和3小时、3小时和4小时、4小时和5小时、5小时和6小时、6小时和7小时、7小时和8小时、8小时和9小时、9小时和10小时、10小时和12小时、12小时和16小时、16小时和20小时或20小时和24小时中的任一者之间。在一些实施方式中，输注速率大于约1ml/hr、2ml/hr、3ml/hr、4ml/hr、5ml/hr、6ml/hr、7ml/hr、8ml/hr、9ml/hr、10ml/hr、20ml/hr、30ml/hr、40ml/hr、50ml/hr、60ml/hr、70ml/hr、80ml/hr、90ml/hr、100ml/hr、200ml/hr、300ml/hr、400ml/hr、500ml/hr、600ml/hr、700ml/hr、800ml/hr、900ml/hr、1000ml/hr、2000ml/hr、3000ml/hr、4000ml/hr、5000ml/hr、6000ml/hr、7000ml/hr、8000ml/hr、9000ml/hr、10,000ml/hr或其间的任何速率中的任一者。在一些实施方式中，输注如上重复。
在一些实施方式中，o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)被给予的剂量大于约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg、1000mg/kg、或其间的任何剂量中的任一者。在一些实施方式中，剂量以一次或多次弹丸给予提供。在一些实施方式中，剂量以一次或多次输注提供。在一些实施方式中，剂量在多于一次给予中提供(例如，100mg/kg剂量可通过2剂50mg/kg提供)。
在本发明的一些实施方式中，o2载体多肽(例如，h-nox蛋白)与放射治疗组合应用。在一些实施方式中，o2载体多肽在给予放射前至少1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或24小时中的任一者被给予个体。在一些实施方式中，放射x辐射。在一些实施方式中，x辐射剂量是约0.5gy至约75gy中的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽给予和放射给予的循环重复1、2、3、4、5或6次中的任一者。在一些实施方式中，o2载体多肽给予和放射给予的循环在约1周、2周、3周、4周、5周或6周中的任一者之后重复。在一些实施方式中，o2载体多肽和放射治疗的给予与另一治疗结合应用；例如，化学治疗和/或免疫治疗。
具有h-nox蛋白的试剂盒
还提供用于调节个体的肿瘤免疫性的的制造制品和试剂盒。在一些实施方式中，制造制品或试剂盒包括如下任何o2载体多肽——该o2载体多肽包括本文描述的任何h-nox蛋白，该h-nox蛋白包括多聚h-nox蛋白和peg化的多聚h-nox蛋白；和适当的包装。在一些实施方式中，本发明包括具有下列的试剂盒：(i)h-nox蛋白(如本文描述的野生型或突变型h-nox蛋白或本文描述的其制剂)和(ii)将该试剂盒用于递送o2至个体的说明书。
容器可以是单位剂量、批量包装(bulkpackages)(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，还可提供这样的试剂盒：包含充足剂量的本文公开的h-nox蛋白，以长期提供对个体有效的治疗，如约1周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、或更久中的任一者。试剂盒还可包括多个单位剂量的h-nox蛋白和使用说明书，并以充足量包装以在药房中(例如，医院药房和合成药房)中储存和使用。在一些实施方式中，试剂盒包括干燥的(例如，冻干的)组合物，其可再构、再悬浮或再水合以形成总体上稳定的h-nox蛋白水悬浮液。
h-nox蛋白的示例性生产方法
如上所述，几种野生型h-nox蛋白和核酸的序列已知，并且用于生成本发明的突变型h-nox结构域和核酸。重组h-nox蛋白的突变、表达、和纯化技术已被描述于，例如，boon,e.m.etal.(2005).naturechemicalbiology1:53-59和karow,d.s.etal.(august10,2004).biochemistry43(31):10203-10211、美国专利号8,404,631和8,404,632、wo2007/139791、和wo2007/139767——其通过引用被并入本文其整体，具体地关于重组h-nox蛋白的突变、表达和纯化。这些技术或其它标准技术可用于生成任何突变型h-nox蛋白。
可利用标准技术将突变型h-nox核酸并入载体，如表达载体。例如，限制酶可用于切割突变型h-nox核酸和载体。然后，可连接切割后的突变型h-nox核酸和切割后的载体的相容性末端。利用标准技术(例如，电穿孔)，所得载体可被插入细胞(例如，昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞、或细菌细胞)，以表达编码的h-nox蛋白。
具体地，异源蛋白质已被表达在多种生物表达系统中，如昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞、和细菌细胞。因此，任何适当的生物学蛋白质表达系统可用于生产大量重组h-nox蛋白。在一些实施方式中，h-nox蛋白(例如，突变型或野生型h-nox蛋白)是分离的蛋白质。
在一些实施方式中，多聚h-nox蛋白包括一个或多个his6标签。包括至少一个his6标签的h-nox蛋白可利用层析来纯化；例如，利用ni2+-亲和层析。在纯化后，可去除his6标签；例如，通过利用肽链端解酶。在一些实施方式中，本发明提供了纯化的多聚h-nox蛋白，其中多聚h-nox蛋白通过his6标签的使用而纯化。在一些实施方式中，纯化的h-nox蛋白经肽链端解酶处理去除his6标签。
在一些实施方式中，h-nox蛋白包括一个或多个聚乙二醇分子(即，peg化)。生产peg化蛋白质的方法在本领域已知。
实施例
实施例——意图仅仅示例本发明并且因此不应以任何方式被认为限制本发明——也描述和详细说明了上述发明的方面和实施方式。实施例不意图代表下文实验是进行的全部或仅有的实验。除非另外描述，温度是摄氏度，并且压力处于或接近大气压。
实施例1.h-nox能够有效充氧低氧肿瘤微环境
评价远侧袋中携带l144f取代的peg化三聚腾冲嗜热厌氧菌(thermoanaerobactertengcongensis)(tt.)h-nox(图6b)的充氧肿瘤微环境和增加放射敏感性的能力。peg化三聚tth-noxl144f向携带低氧肿瘤的小鼠的给予引起肿瘤快速和持续充氧——通过外部低氧标记物——哌莫硝唑、低氧诱导转录因子1α——hif-1-α、和oxylite氧气检测纳米纤维(分别在图2和3)直接测量。
虽然动物的补充充氧成功增加了小鼠肿瘤组织5-10mmhg氧气浓度的充氧，但其对氧气水平较低(<5mmhg)的区域无效果。相比之下，peg化三聚体tth-noxl144f能够甚至在严重低氧肿瘤组织(<5mmhg)中也增加充氧。这可能是因为peg化三聚体tth-noxl144f的组织渗透较优，这能够使氧气递送至超过氧气梯度扩散极限的区域。此外，虽然在持续暴露动物于95％-100％呼吸氧气时实现了小鼠肿瘤的最大补充充氧[增加高氧和对正常组织炎性损伤的风险(kallet&matthay,2013respircare,58(1):123-141；thieletal.,2005plosbiol,3(6),e174)]，单个弹丸i.v.剂量的peg化三聚体tth-noxl144f可使组织充氧保持多于7小时，而不增加正常组织中的氧气水平。对照tth-nox蛋白(野生型变体)——在低氧组织中存在的氧气浓度下不能释放氧气——对肿瘤充氧不具有任何效果(图3c)。
对7至8周龄nu/nu雌性小鼠皮下植入以3×106个h460人肺癌细胞，并监测直到肿瘤达到～500mm3的平均尺寸(肿瘤细胞植入后10-18天)。将携带h460肿瘤的小鼠用混合在20％氧气中的异氟醚麻醉，并利用微操纵器将oxylitetm探针(oxfordoptronix,uk)植入h460皮下异种移植肿瘤。oxylitetm由氯化钌染料组成——持于末梢处直径230μm的多聚体基质中。在平衡～20-30分钟后，利用4-通道单元相邻的光学荧光传感器测量po2。经确认的低起始po2进入远离相邻血管的低氧组织(～0.2mmhg；在图3d中除5mmhg处以外)。在探针植入后，停留探针～20-30min以进行po2测量至稳定，并给予小鼠呼吸100％o2(图3b，图3d)或注射以peg化h-nox(图3a中的l144f，图3c中的wt)，并记录荧光淬灭。
相对于高氧气体给予，peg化三聚体tth-noxl144f递送氧气至低氧肿瘤区域的较优能力通过更有效的放射肿瘤细胞杀伤被进一步证明(图4)。
在peg化三聚体tth-noxl144f给予后，所有peg化三聚体tth-noxl144f治疗的肿瘤的放射治疗效力有>15倍的增加，使肿瘤细胞的存活分数从单独10gy治疗组的30％降低至h-nox(l144f)预治疗肿瘤的<2％。在相同实验中，对携带肿瘤小鼠用100％氧气的治疗显示放射增强的可变增加(variableincrease)(～3倍)，可能是源于个体肿瘤之间肿瘤充氧不等，这可能是因为肿瘤之间血管密度不均。
实施例2.h-no充当增强宿主抗肿瘤响应的免疫激活剂
peg化三聚体tth-noxl144f诱导的充氧抑制了hif-1α途径(图2b)并缓解了hif-1α依赖性的和hif-1α非依赖性的肿瘤免疫抑制。对携带h460皮下异种移植肿瘤(200-350mm3)的小鼠用单独介质或用peg化三聚体h-nox(l144f)治疗，并在注射后7、16或24小时收集用于qrt-pcr分析。平均值+/-sem。每组n＝5-6，*p<0.05，通过t检验。单个剂量h-nox的治疗导致hif-1α和其效应体的显著下调，其效应体包括宿主免疫响应的直接和间接调节因子：pd/pdl-1和vegf信号传导、代谢和生长因子调节因子(图5)。
例如，peg化三聚体tth-noxl144f介导的hif-1α和a2ar腺苷能信号传导下调可导致激活和效应t细胞至肿瘤组织募集，造成淋巴细胞肿瘤浸润增加、转移性肿瘤生长减少和肿瘤消退。此外，h-nox诱导的肿瘤充氧可通过抑制多种低氧依赖性机制来降低肿瘤细胞免疫规避，该低氧依赖性机制包括肿瘤细胞表面上的mhc1的下调和pdl-1表达的上调、和骨髓衍生的抑制细胞(mdsc)(包括直接抑制免疫效应细胞以及促进血管形成和转移的tam)的激活和募集(参见图1b)。h-nox治疗可通过下调vegf、csf1和其它hif-1依赖性细胞因子信号传导(chaturvedietal.,2014procnatlacadsciusa,111(20):e2120-2129；lewis&hughes,2007breastcancerres,9(3):209)以及hif-1-和hif-2介导的巨噬细胞激活(fangetal.,2009blood,114(4):844-859；takedaetal.,2010genesdev,24(5):491-501)来抑制巨噬细胞至tme的募集。
最后，在刺激宿主的抗肿瘤免疫响应时，h-nox可充当共激活剂，增强其它目标癌症免疫治疗——如但不限于抗pd1(程序细胞死亡蛋白1)、抗pdl-1(程序细胞死亡蛋白配体1)、抗ctla-4、或靶向其它免疫检查点的调节因子的治疗、抗癌症疫苗、过继性免疫细胞治疗或其组合。例如，在pdl1+肿瘤患者中，h-nox可先于和结合双重pd1/ctla-4封锁治疗或组合pdl-1治疗被给予癌症患者。其还可充当其它癌症治疗的辅助剂，其它癌症治疗包括但不限于，化学治疗、放射治疗或可受益于活性抗肿瘤免疫防御的其它非免疫靶向治疗或基于细胞的治疗。事实上，h-nox可协同放射，通过同时刺激对来自损伤肿瘤组织的放射暴露肿瘤特异性抗原的抗肿瘤免疫响应(demariaetal.,2005intjradiatoncolbiolphys,63(3),655-666)和氧气依赖性肿瘤细胞杀伤(brown,2010intjradiatbiol,86(11),907-917)。在放射治疗期间，h-nox还可通过改善放射致血管损伤带来的低氧而充当正常组织放射保护剂。
实施例3.b16f10和ct26皮下肿瘤和颅内gl261-荧光素酶肿瘤中的低氧和t细胞的测量。
b16f10和ct26皮下肿瘤和颅内gl261-荧光素酶肿瘤的生成。对6至8周龄c57bl/6j雌性小鼠在侧面皮下植入以1×106个b16f10小鼠黑素瘤癌细胞(图7a)。对6至8周龄balb/c雌性小鼠在侧面皮下植入以1×106个ct26结肠肿瘤细胞(图7b)。对重20g的雄性c57bl/6j在右侧尾状核中颅内注射以3×105个gl261-luc细胞(+0.5mma/p，+2.3mmm/l和-3.2mmd/v)(图7c)。在处死前使颅内肿瘤生长21天。一周3次用卡尺测量皮下肿瘤，并基于下列公式计算肿瘤尺寸:(长度×宽度2)÷0.5。在肿瘤达到～300mm3的平均尺寸后(肿瘤细胞植入后10-14天)，开始治疗。
治疗。在处死前1-8小时对携带200-400mm3皮下肿瘤或第21天颅内肿瘤的小鼠ip.注射以外源低氧标记物哌莫硝唑(60mg/kg，hypoxyprobe，burlingtonmassachusetts)。
免疫组织化学。对啮齿动物进行安乐死，并切除肿瘤用于免疫组织化学(ihc)测验。将肿瘤在oct中冷冻，并以12μm切片用于ihc加工。将切片用4％pfa在4℃下固定15分钟，然后阻断和在室温下用5％bsa、5％山羊血清、和0.1％吐温20透化1-2小时。然后将切片与兔抗哌莫硝唑抗体(hypoxyprobe，1:100)(图7a，7b，7c，上图)和大鼠抗cd3抗体、大鼠抗cd4抗体(biolegend，1:50)或大鼠抗cd8抗体(biolegend，1:50)一起在4℃下培育过夜(图7a、7b、7c，中图)，然后与抗兔二抗或抗大鼠二抗(1:1000，jacksonimmunoresearchlaboratories，westgrove，pa，usa)一起在室温下培育2小时。将切片安装在slowfadedapi(invitrogen)中。利用配备有ccd数码摄像机的hdaxioimagerzeiss显微镜使切片成像。定量。在每个动物中，计数跨越1-1.5mm肿瘤厚度的5个肿瘤切片中每个切片的2-4张照片中的哌莫硝唑阳性区域和哌莫硝唑阴性区域中的cd3+、cd4+或cd8+t细胞数量。每个区域中的cd4+和cd8+细胞总和除以哌莫硝唑阳性区域和哌莫硝唑阴性区域的总和，获得每mm2肿瘤组织的t细胞总数(图7a、7b、和7c，下图)。肿瘤低氧区域(h)显示比常氧区域(n)低2.5至超过10倍的t细胞。
实施例4.低氧肿瘤的h-nox治疗。
b16f10皮下肿瘤的生成。对6至8周龄c57bl/6j雌性小鼠在侧面皮下植入以1×106个b16f10小鼠黑素瘤癌细胞。一周3次利用卡尺测量肿瘤，并基于下列公式计算肿瘤尺寸：(长度×宽度2)÷0.5。在肿瘤达到～300mm3的平均尺寸后(肿瘤细胞植入后10-14天)，开始治疗。
治疗。基于肿瘤尺寸将携带200-400mm3肿瘤的小鼠随机分到各治疗组并肿瘤内注射以介质(制剂缓冲剂：50mm琥珀酸盐、50mmnacl、3.4mmedta、和10mm还原的谷胱甘肽，ph7)或包含2mgpeg化h-nox(l144f)的100μl制剂缓冲剂。在介质或h-nox治疗前1小时，对小鼠ip.注射以外源低氧标记物哌莫硝唑(60mg/kg，hypoxyprobe，burlingtonmassachusetts)。
免疫组织化学。h-nox注射后6小时，对啮齿动物进行安乐死，并切除肿瘤用于免疫组织化学(ihc)测验。将肿瘤在oct中冷冻，并以12μm切片用于ihc加工。将切片用4％pfa在4℃下固定15分钟，然后阻断和用5％bsa、5％山羊血清、和0.1％吐温20在室温下透化1-2小时。然后将切片与兔抗哌莫硝唑抗体(hypoxyprobe，1:100)或兔抗碳酸酐酶ix抗体(caix，novusbiological1:1000)和大鼠抗cd4抗体(biolegend，1:50)或大鼠抗cd8抗体(biolegend，1:50)抗体一起在4℃下培育过夜，然后与抗兔二抗或抗大鼠二抗(1:1000，jacksonimmunoresearchlaboratories，westgrove，pa，usa)一起在室温下培育2小时。将切片安装在slowfadedapi(invitrogen)中。利用配备有ccd数码摄像机的hdaxioimagerzeiss显微镜使切片成像(图8和9b)。
定量。在每个动物中，计数跨越1-1.5mm肿瘤厚度的5个肿瘤切片中的每个切片的4张照片中的哌莫硝唑阳性、哌莫硝唑阴性、caix阳性和caix阴性区域中的cd4+和cd8+t细胞数量。每个区域中的cd4+和cd8+细胞的总和除以哌莫硝唑阳性、哌莫硝唑阴性、caix阳性和caix阴性区域的总和，获得每mm2肿瘤组织的t细胞总数。图8和9a显示的结果证明，与介质对照(制剂缓冲剂)相比，omx治疗增强了cd4+和cd8+淋巴细胞在标记为肿瘤低氧区域的之前的哌莫硝唑阴性(图8)或caix阴性(图9b)中的积累。
实施例5.肿瘤低氧和肿瘤血管的测量。
h460、b16f10和ct26皮下肿瘤和颅内gl261-荧光素酶肿瘤的生成。对7至8周龄nu/nu雌性小鼠在后肢中皮下植入以3×106个h460人肺癌细胞。对6至8周龄c57bl/6j雌性小鼠在侧面皮下植入以1×106个b16f10小鼠黑素瘤癌细胞。6至8周龄balb/c雌性小鼠在侧面皮下植入以1×106个ct26结肠肿瘤细胞。对重20g的雄性c57bl/6j在右侧尾状核中颅内注射以3×105个gl261-luc细胞(+0.5mma/p，+2.3mmm/l和-3.2mmd/v)。使颅内肿瘤在处死前生长21天。一周3次利用卡尺测量皮下肿瘤，并基于下列公式计算肿瘤尺寸：(长度×宽度2)÷0.5。在肿瘤达到～300mm3的平均尺寸后(肿瘤细胞植入后10-14天)，开始治疗。治疗。在处死前1-8小时对携带200-400mm3皮下肿瘤或第21天颅内肿瘤的小鼠ip.注射以外源低氧标记物哌莫硝唑(60mg/kg，hypoxyprobe，burlingtonmassachusetts)。
免疫组织化学和elisa。对啮齿动物进行安乐死，并切除肿瘤用于免疫组织化学(ihc)和elisa测定。关于elisa，将b16f10、ct26和h460肿瘤在补充有抗蛋白酶的提取缓冲剂(abcam试剂盒#ab117996)中均质化。利用bradford测验定量每个肿瘤中的蛋白质浓度，并利用竞争性哌莫硝唑(hypoxyprobe-1，hypoxyprobe，burlingtonmassachusetts)elisa测定来测验样品的低氧水平。关于ihc，将gl261肿瘤在oct中冷冻，并以12μm切片用于ihc加工。将切片用100％甲醇在-20℃下固定20分钟，然后阻断和用5％bsa、5％山羊血清、和0.1％吐温20在室温下透化1-2小时。然后将切片与兔抗哌莫硝唑抗体(hypoxyprobe，1:100)和大鼠抗cd31抗体(bdbioscience，1:50)一起在4℃下培育过夜，然后与抗兔二抗或抗大鼠二抗(1:1000，jacksonimmunoresearchlaboratories，westgrove，pa，usa)一起在室温下培育2小时。将切片安装在slowfadedapi(invitrogen)中。利用配备有ccd数码摄像机的hdaxioimagerzeiss显微镜使切片成像(图10)。
定量。关于哌莫硝唑elisa，利用标准曲线的5参数拟合来进行ic50值(“kd”)的定量，并根据每个样品中的蛋白质浓度将数值标准化。关于gl261ihc，在每个动物中，利用imagej(跨越1mm肿瘤厚度的5个肿瘤切片中每个切片的1-2张照片)确定肿瘤组织内哌莫硝唑+区域的百分比(图10)。这些数据显示，虽然是个体动物之间和肿瘤类型之间低氧水平有一个范围，其存在在大部分所测尺寸的肿瘤中是显著的。
实施例6.肿瘤中的h-nox积累的测量。
b16f10和ct26皮下肿瘤和颅内gl261-荧光素酶肿瘤的生成。对6至8周龄c57bl/6j雌性小鼠在侧面皮下植入以1×106个b16f10小鼠黑素瘤癌细胞。对6至8周龄balb/c雌性小鼠在侧面皮下植入以1×106个ct26结肠肿瘤细胞。对重20g的雄性c57bl/6j在右侧尾状核中颅内注射以3×105个gl261-luc细胞(+0.5mma/p，+2.3mmm/l和-3.2mmd/v)。使颅内肿瘤在处死前生长21天。一周3次利用卡尺测量皮下肿瘤，并基于下列公式计算肿瘤尺寸：(长度×宽度2)÷0.5。在肿瘤达到～300mm3的平均尺寸后(肿瘤细胞植入后10-14天)，开始治疗。
治疗。基于肿瘤尺寸将携带200-400mm3皮下肿瘤的小鼠随机分到各治疗组，并静脉内(650mg/kg)、皮下(650mg/kg)、或肿瘤内(2mg，100μl)注射以介质(制剂缓冲剂：50mm琥珀酸盐、50mmnacl、3.4mmedta、和10mm还原的谷胱甘肽，ph7)或包含peg化h-nox(l144f)的制剂缓冲剂。基于利用xenogenivis光谱测量的生物发光信号将携带第21天颅内肿瘤的小鼠随机分到各治疗组，并静脉内注射以单独制剂缓冲剂或包含750mg/kgh-nox(l144f)的制剂缓冲剂。
皮下肿瘤组织中peg化h-nox(l144f)积累的测量。h-nox或介质注射后6h(b16f10)或8h(ct26)收集肿瘤。将肿瘤在补充有抗蛋白酶的提取缓冲剂(abcam试剂盒#ab117996)中均质化，并利用bradford测验定量每个肿瘤中的蛋白质浓度。通过h-nox夹心elisaelisa(检测灵敏度在1ng/ml)定量peg化h-nox(l144f)浓度，并相对于肿瘤重量标准化，以μg/g肿瘤组织表示h-nox量。通过标准曲线的5参数拟合确定肿瘤溶解物中h-nox水平的定量。
通过ihc进行的gl261中h-nox(l144f)的生物分布。h-nox注射后2h，对啮齿动物进行安乐死，并切除肿瘤用于免疫组织化学(ihc)测验。将肿瘤在oct中冷冻，并以12μm切片用于ihc加工。将切片在-20℃下用100％甲醇固定20分钟，然后阻断和用5％bsa、5％山羊血清、和0.1％吐温20在室温下透化1-2小时。然后将切片与兔抗h-nox抗体(1:500，定制兔多克隆，由anaspecinc，fremont，ca生产)和大鼠抗cd31抗体(bdbioscience，1:50)一起在4℃下培育过夜，然后与抗兔二抗或抗大鼠二抗(1:1000，jacksonimmunoresearchlaboratories，westgrove，pa，usa)一起在室温下培育2小时。将切片安装在slowfadedapi(invitrogen)中。利用配备有ccd数码摄像机的hdaxioimagerzeiss显微镜使切片成像。在每个动物中，利用imagej(跨越1mm肿瘤厚度的5个肿瘤切片中每个切片的1-2张照片)确定肿瘤组织内的h-nox阳性区域百分比。
实施例7.犬口腔黑素瘤肿瘤中的低氧和t细胞的测量。
犬口腔黑素瘤。在所有者同意的情况下募集携带口腔黑素瘤肿瘤的宠物狗用于研究，并在手术前4h静脉内注射(缓慢输注)以peg化h-nox(l144f)。通过ihc分析从手术提取的组织。
免疫组织化学。h-nox注射后4小时，将肿瘤切除，在oct中冷冻，并以12μm切片用于ihc加工。将切片用4％pfa在4℃下固定15分钟，然后阻断和用5％bsa、5％山羊血清、和0.1％吐温20在室温下透化1-2小时。然后将切片与兔抗碳酸酐酶ix抗体(caix，novusbiological1:1000)或兔抗h-nox抗体(1:500，定制兔多克隆，由anaspecinc，fremont，ca生产)和大鼠抗cd4抗体(abdserotech，1:50)或大鼠抗cd8抗体(abdserotech，1:50)一起在4℃下培育过夜，然后与抗兔二抗或抗大鼠二抗(1:1000，jacksonimmunoresearchlaboratories，westgrove，pa，usa)一起在室温下培育2小时。将切片安装在slowfadedapi(invitrogen)中。利用配备有ccd数码摄像机的hdaxioimagerzeiss显微镜使切片成像(图11)。图像揭示了在omx给予前表达低氧标记物caix——指示低氧状态——的肿瘤区域中存在大量淋巴细胞，表明omx治疗缓解免疫抑制性微环境和允许淋巴细胞浸润。
4t1-luc肿瘤模型。8周龄雌性balb/c小鼠购自charlesriver实验室。使表达荧光素酶的4t1小鼠乳腺肿瘤细胞(4t1-fluc-neo；imanislifesciences)在补充有10％胎牛血清、1×青霉素/链霉素、和0.7mg/mlg-418(invivogen)的rpmi培养基中生长。使细胞经胰蛋白酶处理，并重新悬浮于培养基:matrigel(corning)的50:50混合物中，并且将100μl体积中的2×105个细胞皮下注射到小鼠中。在植入后第10天和第14天，测量肿瘤并计算体积(长度×宽度×高度×0.523)，对小鼠同时注射以120mg/kgi.p.哌莫硝唑(pimo，hypoxyprobe)和i.v.30mg/kgef5(hypoxiaimagingcenter)，在pimo/ef5注射后90min处死，并收集肿瘤。将收集的肿瘤在oct中冷冻用于免疫染色，以及利用轻柔型macs解离器解离成单个细胞，然后与0.75mg/ml胶原蛋白酶/分散酶(dispase)(roche)一起在37℃下在振荡下培育45min。使解离的细胞经过70μm过滤器。
流式细胞术。将未固定的解离细胞用t细胞的抗体(仓鼠抗小鼠cd3-alexafluor488，克隆145-2c11，ebioscience；大鼠抗小鼠cd4-apc，克隆rm4-5，bdbiosciences；大鼠抗小鼠cd8-pe，克隆53-6.7，bdbiosciences)染色，并利用facscalibur进行流式细胞术。以选通(gating)为目的，脾用作t细胞阳性对照。还是在解离细胞通过70μm过滤器过滤后，将细胞用活力染料570(bdbiosciences)染色，用福尔马林和甲醇固定，用低氧标记物的抗体(兔抗哌莫硝唑，hypoxyprobe，然后驴抗兔alexafluor647；缀合至alexafluor488的小鼠抗ef5，hypoxiaimagingcenter)染色，并在facscalibur上进行分析。利用flowjo分析流式细胞术数据。
免疫荧光染色。将冷冻切片以10μm切割，用4％pfa固定，用一抗(大鼠抗小鼠cd4、大鼠抗小鼠cd8、兔抗pimo)染色，然后用二抗(驴抗大鼠alexafluor594、驴抗pimoalexafluor488)染色，和用dapi复染。
图13a-13f显示低氧肿瘤区域具有免疫抑制性并且呈现皮下4t1-luc同系小鼠肿瘤中的t细胞浸润减少。
序列
tt.wt
atgaaggggacaatcgtcgggacatggataaagaccctgagggacctttacgggaatgatgtggttgatgaatctttaaaaagtgtgggttgggaaccagatagggtaattacacctctggaggatattgatgacgatgaggttaggagaatttttgctaaggtgagtgaaaaaactggtaaaaatgtcaacgaaatatggagagaggtaggaaggcagaacataaaaactttcagcgaatggtttccctcctattttgcagggagaaggctagtgaattttttaatgatgatggatgaggtacacctacagcttaccaagatgataaaaggagccactcctccaaggcttattgcaaagcctgttgcaaaagatgccattgaaatggagtacgtttctaaaagaaagatgtacgattactttttagggcttatagagggtagttctaaatttttcaaggaagaaatttcagtggaagaggtcgaaagaggcgaaaaagatggcttttcaaggctaaaagtcaggataaaatttaaaaaccccgtttttgagtga
(seqidno:1)
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(seqidno:2)
折叠子结构域
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mmsmkgiifneflnfveksesytlvdqiimdshlkshgaytsigtyspkelfqlvkalamkngkptsvilqeygeylfevfakkypqffrekksvfqflealethihfevkklydytelphfecqyhsqnqmemiytssrpladfaeglikgcikyhkenmtivrenlpaktgfkvrfvltkgdpde(seqidno:10)
l1wt
atgaaaggtatcgtttttacctccttaaatgacatgattatagaacaatttggcatagaaacctgggaccaactcgtatcctcactagaccttccaagtggtggaagttatacagcaggcggcacttactcggatacagaatttcagcaattgattaaggccattgcgaagaggaccaatcagcacgcttctgtttttttagaggcctttggtgaatacatgtttcctatcttatcgagtaagtgcgcaatttttttaaaaaaggacatgacattaaaagaatttttaaaaagcattgatggaacaattcatgtggaagtagaaaagttatacccagatgaaacattacctaccattagctatgaagagcctgctgcaaaccaattggttatggtgtatcgatcgcatagaagactctgtcattttgcaatggggctcatccagggagcagcgcaacattttaaaaagaaaattaccattaagcagactcactgcatgttaaaaaaagatgatcattgtcgtttggagattacctttgagtga
(seqidno:11)
mkgivftslndmiieqfgietwdqlvssldlpsggsytaggtysdtefqqlikaiakrtnqhasvfleafgeymfpilsskcaiflkkdmtlkeflksidgtihveveklypdetlptisyeepaanqlvmvyrshrrlchfamgliqgaaqhfkkkitikqthcmlkkddhcrleitfe
(seqidno:12)
智人wt(1-385)
(seqidno:13)
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(seqidno:14)
智人β2(1-217)
atgtatggattcatcaacacctgcctgcagtctcttgtgacagagaaatttggtgaggagacatgggagaagctgaaggctcctgcagaagtgcaagatgtcttcatgacctacaccgtgtatgatgacatcatcaccattaagctcatccaagaagcctgcaaggttctggatgtgtccatggaagccattctgaagctctttggcgaatacttctttaagttctgtaagatgtctggctatgacaggatgctgcggacacttggaggaaatctcaccgagtttattgaaaacctagatgcactccacagttacctggcactgtcctatcaggaaatgaacgcaccatcctttcgagtggaggaaggagctgacggggcgatgcttctccactactactcagacagacatggtctgtgtcacattgtaccaggtatcattgaagctgtggccaaggacttctttgacactgatgtggccatgagtatcctggatatgaacgaagaggtggaaaggacagggaagaaagaacatgttgtgtttctggtcgtgcagaaggctcacagacagataagaggagcaaaggcaagccggccacaaggcagtgaggacagccaggcagaccaggaggctctccagggaacactcctt
(seqidno:15)
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(seqidno:16)
褐家鼠(rattusnorvegicus)β1(1-385)
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褐家鼠β1(1-385)
mygfvnhalellvirnygpevwedikkeaqldeegqflvriiyddsktydlvaaaskvlnlnageilqmfgkmffvfcqesgydtilrvlgsnvreflqnldalhdhlatiypgmrapsfrctdaekgkglilhyysereglqdivigiiktvaqqihgteidmkviqqrseecdhtqflieekeskeedfyedldrfeengtqdsrispytfckafpfhiifdrdlvvtqcgnaiyrvlpqlqpgkcsllsvfslvrphidisfhgilshintvfvlrskeglldveklecedeltgaeisclrlkgqmiylpeadsilflcspsvmnlddltrrglylsdiplhdatrdlvllgeqfreeykltqeleiltdrlqltlraled(seqidno:20)
褐家鼠β2
mygfintclqslvtekfgeetweklkapaevqdvfmtytvyddiitikliqeackvldvsmeailklfgeyffkfckmsgydrmlrtlggnltefienldalhsylalsyqemnapsfrveegadgamllhyysdrhglchivpgiieavakdffdtdvamsildmneevertgkkehvvflvvqkahrqirgakasrpqgsedsqadqealqgtllrmkerylnipvcpgekshstavrasvlfgkgplrdtfqpvyperlwveeevfcdafpfhivfdealrvkqagvniqkyvpgiltqkfaldeyfsiihpqvtfnissickfinsqfvlktrkemmpkarksqpmlklrgqmiwmeslrcmifmcspnvrslqeleeskmhlsdiaphdttrdlillnqqrlaemelscqlekkkeelrvlsnhlaiekkktetllyamlpehvanqlkegrkvaagefetctilfsdvvtftnicaacepiqivnmlnsmyskfdrltsvhdvykvetigdaymvvggvpvpveshaqrvanfalgmrisakevmnpvtgepiqirvgihtgpvlagvvgdkmpryclfgdtvntasrmeshglpskvhlsptahralknkgfeivrrgeievkgkgkmttyfliqnlnatedeimgrpsapadgkevctpgnqvrkspavprntdhqqqvykgdpadasnevtlagspvagrnstdavnnqpspdetktsvvasgpvlsafcvvl(seqidno:22)。
序列表
<110>spl卡里
a克尔托利察
n勒摩恩
ja温格
kg梁
<120>通过蛋白质介导的o2递送调节肿瘤免疫性
<130>627042000940
<140>pct/us2016/022981
<141>2016-03-17
<150>62/134,523
<151>2015-03-17
<160>30
<170>fastseqforwindowsversion4.0
<210>1
<211>555
<212>dna
<213>腾冲嗜热厌氧菌
<400>1
atgaaggggacaatcgtcgggacatggataaagaccctgagggacctttacgggaatgat60
gtggttgatgaatctttaaaaagtgtgggttgggaaccagatagggtaattacacctctg120
gaggatattgatgacgatgaggttaggagaatttttgctaaggtgagtgaaaaaactggt180
aaaaatgtcaacgaaatatggagagaggtaggaaggcagaacataaaaactttcagcgaa240
tggtttccctcctattttgcagggagaaggctagtgaattttttaatgatgatggatgag300
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cctgttgcaaaagatgccattgaaatggagtacgtttctaaaagaaagatgtacgattac420
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<210>2
<211>184
<212>prt
<400>2
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151015
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202530
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65707580
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<210>5
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<400>5
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<210>6
<211>225
<400>6
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225
<210>7
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<210>8
<211>167
<400>8
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glygluleuleuthrpheleu
165
<210>9
<211>564
<213>嗜肺军团菌
<400>9
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acaaaaggcgatcctgatgagtga564
<210>10
<211>187
<400>10
metmetsermetlysglyileilepheasnglupheleuasnpheval
glulysserglusertyrthrleuvalaspglnileilemetaspser
hisleulysserhisglyalatyrthrserileglythrtyrserpro
lysgluleupheglnleuvallysalaleualametlysasnglylys
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