本发明涉及环境监测及微生物分子检测技术领域，具体涉及一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒。
背景技术：
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒，采用本发明的检测方法检测饮用水中隐孢子虫，结果准确可靠，特异性强，而且可以检测到10个ssurrna基因拷贝，灵敏度高，采用该检测方法测定的去离子水和地下水源水中隐孢子虫的加标回收率分别达到了55％和46％。
基于上述目的，本发明提供的一种饮用水中隐孢子虫的检测方法，包括以下步骤：
(1)饮用水的前处理
采用过滤器过滤饮用水，过滤器内的滤膜截留饮用水中微生物，然后采用有机溶剂溶解滤膜，待滤膜完全溶解后，加入缓冲液沉淀微生物，离心回收沉淀物；
(2)水样dna提取
将沉淀物涡旋后形成悬浮物，加入裂解液进行冻融前处理，冻融前处理完成后加入蛋白酶用于破坏隐孢子虫卵囊外部结构，离心取上清液，上清液用于提取隐孢子虫dna；
(3)qpcr检测
采用qpcr方法对隐孢子虫卵囊dna进行扩增，根据扩增结果判断饮用水中是否感染了隐孢子虫，并能确定感染量。
在本发明中，优选的，步骤(1)中所述滤膜为1～2μm孔径的混合醋酸纤维素滤膜，所述过滤器为盘式过滤器，所述有机溶剂为丙酮；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
本发明的检测方法使用盘式过滤器过滤饮用水，丙酮溶解滤膜，并加入磷酸盐(pbs缓冲液)沉淀微生物，可溶性杂质溶解在上清液中，在前处理中被去除，有助于提高下游基因定量试验的扩增效率，离心回收沉淀；盘式过滤器中的滤膜孔径为1～2μm，并可根据饮用水的体积调整滤膜的直径(例如处理10l饮用水可采用142mm直径滤膜)，滤膜过滤饮用水样品量大，可以截留较多饮用水中的微生物，降低检出限，提高检测灵敏度。
在本发明中，滤膜的完全溶解是提高回收率的一个关键步骤，如果滤膜不能充分溶解，隐孢子虫卵囊会被包裹在半溶解的胶粘状的滤膜碎片中不能释放出来，影响dna的提取。因此，要保证丙酮完全溶解滤膜。因此，在本发明中，优选的，采用丙酮溶解滤膜的具体步骤为：收集滤膜于离心管中，加入丙酮，离心弃上清液，继续加入丙酮，再离心取沉淀，重复此操作2～3次，直至滤膜完全溶解。
在本发明中，优选的，在收集滤膜之前还包括以下步骤：依次用pbst缓冲液、体积分数为70％～100％的乙醇、超纯水清洗过滤器，增加回收率。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述裂解液为atl裂解液，所述裂解液与所述悬浮物的体积比为2.25:1；所述冻融前处理为在液氮和沸水中反复冻融5次，每次冻融为在液氮中2min，在沸水中2min。
尽管液氮/沸水处理对dna构像破环较大，容易使dna二级结构混乱，进而影响以后的扩增效果，液氮/沸水冻融次数过多dna扩增效率明显下降。本发明研究发现，5次液氮/沸水冻融既有助于破坏卵囊外部结构又没有影响扩增效率。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述蛋白酶为蛋白酶k，所述蛋白酶k与ep管中混合液的体积比为1:10；加入蛋白酶用于破坏隐孢子虫卵囊外部结构的具体步骤为：冻融前处理完成后加入蛋白酶k，55～60℃下水浴2.5～3.5h，然后在88～92℃下水浴15～25min，取出后冰浴1.0～1.5min；采用qiaampdnaminikit试剂盒提取上清液中的隐孢子虫卵囊dna。
隐孢子虫卵囊外部结构中含有大量丝状蛋白组织，蛋白酶k对这种结构组织有较强的裂解效果，超声波几乎对这种结构没有任何破坏，pepsin的裂解效果也不如蛋白酶k明显，因此，蛋白酶k对隐孢子虫卵囊壁起了主要裂解作用。
本发明采用qiaampdnaminikit试剂盒配合冻融前处理提取饮用水中的隐孢子虫卵囊dna，在蛋白酶的裂解完成后增加了去除杂质等抑制剂的操作步骤，核酸提取中采用qiaampdnaminikit这套体系里的试剂(atl和蛋白酶k)，没有任何外加试剂干扰提取液配比，能够最大量回收dna。
在本发明中，优选的，步骤(3)中所述qpcr方法为sybrgreen染料法qpcr或taqman探针法qpcr，sybrgreen染料法qpcr和taqman探针法qpcr所使用的引物对均为jvaf引物和jvar引物，taqman探针法qpcr所使用的探针为隐孢子虫探针，所述jvaf引物的核苷酸序列为seqidno:1所示，所述jvar引物的核苷酸序列为seqidno:2所示，所述隐孢子虫探针的核苷酸序列为seqidno:3所示。
sybrgreen染料法是以sybrgreenⅰ荧光染料为基础的一种qpcr检测方法，sybrgreenⅰ是一种非特异的荧光染料，当与双链dna(dsdna)结合后发出强烈荧光，可以根据其荧光信号检测出结合的dsdna数量；taqman探针是一种寡核苷酸探针，在5’端连接的是荧光集团，而猝灭剂连接在3’端，寡核苷酸与靶序列特异性互补，每扩增一条dna链，就有1个探针被切断并释放1个荧光信号，随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光集团不断增多，荧光信号不断增强。本发明jvaf/r引物对的sybrgreen染料法qpcr中溶解曲线峰形单一，无非特异性扩增，而且和探针法一样，也可以检测到10个ssurrna基因拷贝(一个隐虫卵囊含有20个ssurrna基因拷贝)，该体系ct响应值远远低于探针法，而且检测结果与探针法相同，结果准确可靠。
在本发明中，优选的，根据扩增结果判断饮用水中是否感染了隐孢子虫的方法为：当扩增结果有ct值时，则判断为阳性样品，表明饮用水中感染了隐孢子虫；当扩增结果无ct值时，则判断为阴性样品，表明饮用水中没有感染隐孢子虫。
本发明建立了qpcr(荧光实时定量pcr)方法对隐孢子虫卵囊进行检测，并对体系中引物及核酸提取进行了筛选和优化。本研究比较了不同冻融处理及不同dna提取试剂盒对隐孢子虫卵囊dna提取效果，结果显示qiaampdnaminikit配合冻融前处理(液氮/沸水5个循环)提取dna含量较高；本研究比较了隐孢子虫sybrgreen染料法及taqman探针法qpcr，结果显示探针法和染料法均可以检测到10个ssurrna基因拷贝(一个隐虫卵囊含有20个ssurrna基因拷贝)，sybrgreen染料法ct响应值较低。采用本发明的检测体系测定的去离子水和井水隐孢子虫的加标回收率分别达到了55％和46％。
在本发明中，优选的，sybrgreen染料法qpcr反应体系：
2×powersybrgreenmastermix：10μl；
10μmol/l的jvaf引物：0.25μl；
10μmol/l的jvar引物：0.25μl；
隐孢子虫dna：1μl；
加水补足20μl；
扩增条件为：95℃预变性10min；第二步，40个循环包括95℃变性15s；60℃退火1min，共40个循环；在60℃处采集数据。
在本发明中，优选的，taqman探针法qpcr反应体系：
10μmol/l的jvaf引物：0.5μl；
10μmol/l的jvar引物：0.5μl；
10μmol/l的隐孢子虫探针(5’fam,3’bhq1)：0.3μl；
扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，57℃退火45s，72℃延伸45s，共40个循环；在72℃延伸45s处采集数据。
本发明采用盘式过滤器过滤截留饮用水中微生物--丙酮溶解滤膜--磷酸盐沉淀微生物--冻融前处理和蛋白酶破坏卵囊外部结构--离心得到上清液，上清液用于直接提取卵囊dna，这种方法不仅可用于检测饮用水中的隐孢子虫，也为检测饮用水中其他病原微生物，如贾第鞭毛虫(giardin)和产气荚膜梭状杆菌(clostridiumperfringens)等提供可行性检测方法。
另一方面，本发明还提供了一种饮用水中隐孢子虫的检测试剂盒，包括seqidno:1所示的jvaf引物，seqidno:2所示的jvar引物，蛋白酶k，atl裂解液，2×powersybrgreenmastermix，使用说明书，阳性对照，阴性对照；所述阳性对照为克隆有ssurrna基因的pmd18-t载体，所述阴性对照为无rna酶与dna酶的ddh2o。此试剂盒适用于sybrgreen染料法qpcr检测饮用水中隐孢子虫。
另一种饮用水中隐孢子虫的检测试剂盒，包括seqidno:1所示的jvaf引物，seqidno:2所示的jvar引物，seqidno:3所示的隐孢子虫探针，atl裂解液，使用说明书，阳性对照，阴性对照；所述阳性对照为克隆有ssurrna基因的pmd18-t载体，所述阴性对照为无rna酶与dna酶的ddh2o。此试剂盒适用于taqman探针法qpcr检测饮用水中隐孢子虫。
与现有技术相比，本发明的饮用水中隐孢子虫的检测方法具有以下有益效果：
(1)本发明建立了饮用水中隐孢子虫qpcr检测方法，使用滤膜过滤、丙酮溶解、回收微生物，直接提取回收的悬浮液dna，检测结果快(6h内可完成)，实验成本低，灵敏性好，特异性强，采用该检测方法测定的去离子水和地下水源水中隐孢子虫的加标回收率分别达到了55％和46％。
(2)在本发明的检测方法中，采用盘式过滤器滤膜截留饮用水中微生物，滤膜面积大，可以过滤较多水样，降低检出限，提高检测灵敏性；并采用丙酮多次溶解滤膜，保证滤膜的充分溶解；采用qiaampdnaminikit试剂盒配合冻融前处理提取饮用水中的隐孢子虫卵囊dna，能够最大量回收dna。
(3)本发明筛选了特异性jvaf/r引物对，并建立了sybrgreen染料法qpcr，在该方法中溶解曲线峰形单一，无非特异性扩增，结果准确可靠，灵敏性高。
附图说明
图1为本发明隐孢子虫dna四种提取方法的qpcr检测图，其中图1a为taqman探针法，图1b为sybrgreen染料法；
图2为本发明隐孢子虫qpcr标准曲线，其中图2a为taqman探针法的标准曲线，图2b为sybrgreen染料法的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
以下实施例所涉及的仪器为：蠕动泵(bt3001f,保定兰格),摆动式离心机(x-22r,beckman,usa)，荧光pcr仪(abi7300)，普通pcr仪(eppendorf，mastercycler)，盘式过滤器为ks-ii不锈钢过滤器(142mm，生产厂家：日本advantec公司)；滤膜为孔径1μm，直径142mm混合醋酸纤维膜(cat.no.a100a142c日本advantec公司)；dna提取试剂盒qiaampdnaminikit(cat.no.51304),mpfastprepdnakit(cat.),连接载体pmd18-t购自takara公司,感受态细胞top10及质粒提取试剂盒均购自康为世纪。nanodrop1000(thermoscientific)。
实施例1隐孢子虫检测方法中特异性引物的筛选
1.试验方法
筛选了4套隐孢子虫引物分别进行特异性测试。这4套引物分别是(1)扩增ssurrna基因的jvaf/r引物，片段大小是159bp；(2)扩增ssurrna基因的cru18sf/r引物，片段大小是299bp；(3)扩增ssurrna基因的18sf/r引物，片段大小是283bp；(4)扩增actin基因的actinf/r引物，片段大小是163bp。模板分别是隐孢子虫标准品dna、5l管网水dna、5l去离子水dna，扩增产物经琼脂糖电泳检测扩增产物。
普通pcr反应体系：2×goldsarbestmastermix(康为世纪)25ul；10μmol/l上游引物及下游引物各0.5μl；dna模板2μl；加水补足50μl。普通pcr扩增程序：第一步，95℃预变性10min；第二步，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸19s，共39个循环；第三步，最后72℃延伸7min；
普通pcr扩增产物在1.8％的琼脂糖凝胶电泳上检测，将假阳性扩增产物通过minelutepcrpurificationkit(qiagen公司)纯化后交给华大基因公司进行克隆测序。
2.试验结果
使用4对引物进行普通pcr测试，模板分别是隐孢子虫标准品dna、5l管网水dna、5l去离子水dna，扩增产物经琼脂糖电泳检测扩增产物，结果见表1。
表1隐孢子虫引物测试
“+”表示扩增产物阳性，片段大小正确；“-”表示扩增产物阴性，没有扩增产物。
由表1可知，前三对引物均检测隐孢子虫cryptosporidiumspp.的ssurrna基因区域，第4对引物检测actin基因区域，这4套引物对隐孢子虫标准品dna的扩增结果均显示正确片段的阳性扩增，均未见非特异条带产物，对5l去离子水dna的扩增结果均显示阴性。然而，对5l管网水dna的扩增结果显示，除引物对jvaf/r未显示有阳性扩增外，其余三对引物对显微镜镜检隐孢子虫为阴性的管网水dna均显示了阳性扩增。将阳性扩增条带回收进行克隆测序，序列结果在genbank中比对，最相似微生物不是隐孢子虫，而是藻类微生物。表1中除了jvaf/r之外的三对引物均出现了假阳性扩增，因此，在后续实验中，均采用jvaf/r这对引物，以防出现假阳性扩增。
实施例2隐孢子虫标准品dna提取方法的建立
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1隐孢子虫小标样
100±1个完整的隐孢子虫卵囊(oocystsofcryptosporidiumparvum,iowastrain)悬浮于0.75ml磷酸盐缓冲液内，购自美国waterborne公司。产品编号是pacir3，产品批号是94，用于体系测试和优化。
1.1.2试剂配制
磷酸盐缓冲液(pbs)：nacl(分析纯)8.0g，na2hpo4.12h2o(分析纯)2.9g，kcl(分析纯)0.2g，kh2po4(分析纯)0.2g，加水至1000ml。
1.2试验方法
1.2.1隐孢子虫标准品dna四种提取方法比较
将盛有隐孢子虫标准品的样品管(lot#94)最大速度涡旋5-10分钟，取37.5μl标准品悬浮溶液提取dna。共采用四种方法提取dna，每个方法4个平行。方法1-3均是qiaampdnaminikit(qiagen公司)和样品冻融前处理联合使用，首先加入360μlatl裂解液到盛有37.5μl标准品悬浮溶液的ep管中，进行冻融前处理，用来裂解卵囊囊壁。冻融前处理完成后，加入蛋白酶k56℃水浴3h，参照说明书操作，最后收集洗脱dna进行后续qpcr检测。方法1-4具体区别见表2。
表2四种dna提取方法列表
1.2.2sybrgreen染料法qpcr
sybrgreen染料法qpcr反应体系：2×powersybrgreenmastermix：10μl，10μmol/l的jvaf引物：0.25μl，10μmol/l的jvar引物：0.25μl，隐孢子虫dna：1μl，加水补足20μl；
1.2.3taqman探针法qpcr
taqman探针法qpcr反应体系：10μl，10μmol/l的jvaf引物：0.5μl，10μmol/l的jvar引物：0.5μl，10μmol/l的隐孢子虫探针：0.3μl，隐孢子虫dna：1μl，加水补足20μl；
四种方法分别比较了液氮/65℃冻融和液氮/沸水水浴冻融前处理，qiaampdnaminikit和mpfastdnaspinkit试剂盒对隐孢子虫卵囊dna提取的影响，qpcr的基因定量结果见图1。ct值越高，基因拷贝数越低，即dna产量越低。从图1a和图1b中可以看出，sybrgreen染料法和taqman探针法qpcr的检测结果相同：方法3的基因拷贝数高于方法2，方法1与方法2之间没有明显差异，方法1-3的基因拷贝数远高于方法4。方法3，液氮2min/沸水2min水浴，冻融5次之后使用qiaampdnaminikit的方法提取隐孢子虫dna量较高。mpfastdnaspin试剂盒提取隐孢子虫dna产量最低。因此，方法3是较理想的隐孢子虫dna的提取方法。
实施例3隐孢子虫qpcr检测标准曲线的绘制
1.1试验方法
1.1.1质粒制备
引物对jvaf/r扩增标准品隐孢子虫dna，pcr产物均经过minelutepcrpurificationkit(qiagen公司生产)纯化后进行连接克隆，提取含有正确插入片段的克隆子的质粒(连接载体pmd18-t购自takara公司，感受态细胞top10及质粒提取试剂盒均购自康为世纪)，并使用nanodrop1000(thermoscientific)测定质粒dna浓度，最后10倍逐级稀释为包含101copies/μl到包含107copies/μl7个系列浓度用作qpcr标准曲线。
1.1.2sybrgreen染料法qpcr
1.1.2taqman探针qpcr
使用同一套不同稀释浓度的质粒标准品，分别使用sybrgreen染料法和taqman探针法qpcr检测标准曲线。结果见图2。taqman探针法的标准曲线为：y＝-3.2275x+40.53，r2＝0.9937，sybrgreen染料法的标准曲线：：y＝-3.3911x+35.13，r2＝0.9958。
从图2中可见，染料法灵敏性高于探针法，基因拷贝数为10的染料法检测的ct值在30-35之间，探针法检测的ct值在35-40之间。一个卵囊中有20个ssurrna基因的拷贝，从图2中可以看出，两种方法均可以检测到10个ssurrna基因拷贝，即0.5个卵囊，达到并满足了隐孢子虫检测的要求。
实施例4饮用水中隐孢子虫检测方法的建立
1.1隐孢子虫大标样
大约5×106个卵囊(oocystsofcryptosporidiumparvum,iowastrain)悬浮于8ml磷酸盐缓冲液内，购自美国waterborne公司。产品编号是p104@5×10/6，批号为6-15，用于4±1个隐孢子虫dna提取实验和水样加标测试。
1.2试剂配制
磷酸盐缓冲液(pbs)，成分如下：nacl(分析纯)8.0g，na2hpo4·12h2o(分析纯)2.9g，kcl(分析纯)0.2g，kh2po4(分析纯)0.2g，加纯水到1000ml，用盐酸或氢氧化钠调节ph值到8.0左右(最好过膜)。
pbst溶液(pbs+0.1％吐温80)：nacl(分析纯)8.0g，na2hpo4.12h2o(分析纯)2.9g，kcl(分析纯)0.2g，kh2po4(分析纯)0.2g，吐温801.0ml，加水至1000ml。
1.3试验方法
1.3.1饮用水样前处理(膜过滤及丙酮溶解)
水样前处理过程如下，取饮用水水源水样10l，使用盘式过滤器和蠕动泵过滤水样，滤膜为142mm直径、1μm孔径的混合醋酸纤维素滤膜，水样完全过滤后再依次用pbst200-300ml、体积分数为70％～100％乙醇、miliq超纯水清洗过滤容器；收集滤膜放于50ml离心管中，添加40ml丙酮并晃动直至滤膜完全溶解；1550g离心力离心10分钟，弃上清液，重复离心3次，直至滤膜完全溶解；向管中加入磷酸盐缓冲液，直至40ml，2000g离心力离心15分钟，弃上清液，再加入磷酸盐缓冲液继续离心，洗去残留的丙酮。将沉淀物全部转移到5ml离心管，14000g离心，去掉部分上清夜，留取不超过400μl沉淀物。
1.3.2饮用水样dna提取
加入一定体积atl裂解液到盛有饮用水样沉淀物的ep管中，采用实施例2中方法3进行冻融前处理，冻融前处理完成后，加入蛋白酶k56℃水浴3h，取出ep管并放于90℃水浴中水浴20分钟，取出ep管冰浴1分钟，14000g离心5分钟，去除蛋白质等多种杂质。将上清液转到另一个ep管中，重新按照试剂盒操作进行，不再加入蛋白酶k，其他步骤参照qiaampdnaminikit操作说明。收集洗脱dna进行后续qpcr检测，qpcr检测过程参照实施例2。
1.3.3结果判定
当扩增结果有ct值时，则判断为阳性样品，表明饮用水中感染了隐孢子虫，并可根据标准曲线，确定隐孢子虫的感染量；当扩增结果无ct值时，则判断为阴性样品，表明饮用水中没有感染隐孢子虫。
实施例5饮用水中加标回收率的测定
将高浓度隐孢子虫大标样卵囊悬液分别稀释5000倍，最大速度涡旋5-10分钟，以将沉入底部和粘附在管壁的卵囊均匀悬浮起来，先取少量卵囊稀释悬液，共做10个平行，在显微镜下进行免疫荧光镜检确认隐孢子虫的数量。按照显微镜镜检结果进行计算，取80μl卵囊悬液(加标数量确定为100±10个卵囊)，分别加到10l去离子水、10l水地下水源水(井水)测试加标回收率。水样前处理和水样dna提取按照实施例4的方法。
2.水样加标的回收率
10l去离子水、10l井水分别加标100个隐孢子虫，盘式过滤器过滤，丙酮溶解，磷酸盐沉淀微生物，沉淀物进行冻融前处理，上清液提取dna并使用qpcr检测，结果见表3和表4。去离子水样品中杂质比较少，dna提取时不需要去除杂质，直接采用实施例2中的方法3进行dna提取，去离子水的加标回收率达到55％，加标井水样品直接进行dna提取，没有扩增产物，对加标井水样品进行前处理后再进行dna提取，去除了杂质等抑制剂后，井水回收率达到46％。
表3去离子水中隐孢子虫加标回收
表4井水中隐孢子虫加标回收
实施例6本发明试剂盒的组成
本实施例将饮用水中隐孢子虫的检测方法中所用到的试剂组装成试剂盒，试剂盒组成如下所示：
(1)2×powersybrgreenmastermix；
(2)jvaf引物和jvar引物：使用时，用去离子水配制成浓度为10μmol/l；
jvaf引物(5’-3’)：atgacgggtaacggggaat，其为seqidno:1序列；
jvar引物(5’-3’)：ccaattacaaaaccaaaaagtcc，其为seqidno:2序列；
(3)阳性对照为克隆有ssurrna基因的pmd18-t载体，配制浓度为101copies/μl～107copies/μl；
(4)阴性对照为无rna酶与dna酶的ddh2o；
(5)蛋白酶k；
(6)atl裂解液；
(7)使用说明书
使用说明书记载本发明的饮用水中隐孢子虫的检测步骤；
根据本实施例中使用说明书中记载的检测步骤，使用试剂盒包含的各组分可实现对饮用水中隐孢子虫的sybrgreen染料法qpcr检测。
实施例7本发明试剂盒的组成
jvaf引物：其为seqidno:1序列；
jvar引物：其为seqidno:2序列；
(3)隐孢子虫探针(5’fam,3’bhq1)：使用时，用去离子水配制成浓度为10μmol/l；
隐孢子虫探针(5’-3’)：fam-cgcgcctgctgccttccttagatg-bhq，其为seqidno:3序列；
(4)阳性对照为克隆有ssurrna基因的pmd18-t载体，配制浓度为101copies/μl～107copies/μl；
(5)阴性对照为无rna酶与dna酶的ddh2o；
(6)蛋白酶k；
(7)atl裂解液；
(8)使用说明书
根据本实施例中使用说明书中记载的检测步骤，使用试剂盒包含的各组分可实现对饮用水中隐孢子虫的taqman探针法qpcr检测。
由上述内容可知，本发明建立了qpcr(荧光实时定量pcr)方法对隐孢子虫卵囊进行检测，并对体系中引物及核酸提取进行了筛选和优化。本研究比较了不同冻融处理及不同dna提取试剂盒对隐孢子虫卵囊dna提取效果，结果显示qiaampdnaminikit配合冻融前处理(液氮/沸水5个循环)提取dna含量较高；本研究比较了隐孢子虫sybrgreen染料法及taqman探针法qpcr，结果显示探针法和染料法均可以检测到10个ssurrna基因拷贝(一个隐虫卵囊含有20个ssurrna基因拷贝)，sybrgreen染料法ct响应值较低。采用本发明的检测体系测定的去离子水和井水隐孢子虫的加标回收率分别达到了55％和46％。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。