1、显微技术简介GeraldKarp,2010分辨率分辨率：指分辨物体间最小间隔的能力。指分辨物体间最小间隔的能力。R=0.61/NA其中其中为入射光线波长；为入射光线波长；NA为镜口率为镜口率sin/2，n=介质折射率；介质折射率；=镜口角镜口角（样品对物镜镜口的张角）（样品对物镜镜口的张角）。思考：思考：如何提高显微镜的分辨能力？如何提高显微镜的分辨能力？肉眼光学显微镜透射电镜分辨率0.2mm0.2m0.2nm应用范围可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000)可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）观察石蜡切片和
2、半薄切片观察超薄切片几种介质的折射率几种介质的折射率显微镜显微镜分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光可见光（400-700）紫外光紫外光（约（约200nm)电子束电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜电磁透镜不要求真空不要求真空不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差和透射形成明暗反差电子波性电子波性DeBroglie波波
3、1924年，德布罗意提出了运动着的微观粒子（如中子、电子、离年，德布罗意提出了运动着的微观粒子（如中子、电子、离子等）也具有波粒二象性假说子等）也具有波粒二象性假说-运动着的微观粒子也伴随着一个波运动着的微观粒子也伴随着一个波-物物质波或德布罗意波。质波或德布罗意波。静电透镜：与一定形状的光学介质界面（如玻璃凸透镜的旋转对静电透镜：与一定形状的光学介质界面（如玻璃凸透镜的旋转对称弯曲折射界面）可以使光线聚焦成像相似，一定形状的等电位曲面称弯曲折射界面）可以使光线聚焦成像相似，一定形状的等电位曲面族也可使电子束聚焦成像，产生这种旋转对称等电位曲面族的电极装族也可使电子束聚焦成像，产生这种旋转对
4、称等电位曲面族的电极装置即为静电透镜。置即为静电透镜。一、光学显微镜术一、光学显微镜术光学显微镜(L.M)Hooke(1665)用光学显微镜观察软木的结构，首次建立了Cell的名词。镜下结构称光镜（lightmicroscopeLM)结构；放大倍数1000倍；分辨率0.2m；组织制成薄片，以利光线通过。显微镜显微镜主体主体CCDCCD或或数码相机数码相机调节座调节座物镜转换架物镜转换架物镜物镜目镜目镜载物台载物台聚光镜聚光镜（滤光片）（滤光片）光源开关光源开关（滤光片）（滤光片）成像透镜成像透镜反射镜反射镜或分束镜或分束镜生物切片生物切片计算机计算机图象采集卡图象采集
5、卡视频信号线视频信号线1.石蜡切片术石蜡切片术(paraffinsectioning)石蜡切片法石蜡切片法是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列处理制成永久制片的方法。在研究植物的细胞、组织、胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。制片过程（1）取材（1.0cm）固定(甲醛）酒精脱水（低-高）透明（二甲苯）浸蜡包埋切片（510um）展片；（2）脱蜡（二甲苯）酒精（高-低）水苏木精-伊红染色酒精脱水（低-高）透明（二甲苯）封片（树胶）取材取材根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。
8、小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。固定的目的和作用在于：防止组织自溶和腐败；使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。固定的注意事项(1)固定的材料越新鲜
9、越好。因此，采集或割取后须立即投入预先准备好的固定液中进行固定，切勿耽误。(2)材料大小以直径不超过5mm为宜，材料与固定液的比例为1:20。(3)根据材料的性质和制片的目的选择固定液。(4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液固定。(5)含有气泡的材料投入团定液后，材料不会下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易的抽气方法是将材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽动几次。也小用抽气装置进行抽气。(6)固定时，要防止材料变形。(7)外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，应将整个器官投入固定液22h后，再将其修成小块材料继续则定。(8)含
10、行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水洗净后再行固定。(9)材料投入固定液后须经常摇晃。(10)容器外需贴标签。常用的固定液福尔马林醋酸酒精混合固定液（FAA液）是植物制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定也通用于昆虫和甲壳类的固定。FAA液配方：福尔马林5m1冰醋酸5m150或70酒精90m1一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩；加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬预染色脱水脱水脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。现采用的脱水剂一般是丙酮或
13、折叠一牛皮纸盒。将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。我们可以看到：水和酒精可以相溶。酒精和二甲苯相溶。二甲苯和石蜡可以相溶。因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不
14、成良好的切片。切片切片修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。贴片贴片指用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色和观察。常用的粘片剂有下列二种：(1)明胶黏片剂(2)蛋清黏片剂1:1的蛋清与甘油在干净的载玻片上涂粘片剂、加水2-3滴，将检查过的蜡带放置其上，并将载玻片移至烫片箱上
16、量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝等。其中最常用的为苏木精和洋红。(2)合成染色剂全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料。除上述两类外，在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。根据染色剂的化学性质分碱性染色剂、酸性染色剂和中性染色剂。碱性、酸性和中性染色剂都是由一种酸和一种碱所构成的盐类。碱性染色剂和酸性染色剂的主要区别，就在于染色剂的主要有色部分是阳离子还是阴离子。若染色剂电离后，其分子的主要部分成阳离子为碱性染色剂若电离后，其分子的主要部分为阴离子即为酸性染色剂。名词：1、嗜碱性：细
17、胞和组织的酸性物质或结构与碱性染料（如苏木精）亲合力强，称嗜碱性。2、嗜酸性：碱性物质或结构与酸性染料（如伊红）亲合力强，称嗜酸性。3、中性：若与两种染料的亲合力均不强的。4、亲银性：银染法中有些组织结构可直接使硝酸银还原而显示，称此为亲银性。5、嗜银性：有些结构无直接还原作用，需加入还原剂方能显色，称此为嗜银性。6、异染性：有些组织成分如结缔组织和软骨基质中的糖氨多糖，当用甲苯胺蓝等碱性染料染色后呈紫红色，这种现象称为异染性。根据用途分(l)细胞核染色剂用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。
18、(2)细胞质染色剂用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。（3）脂质染色剂用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。细胞壁的染料酸性品红番红固绿甲苯胺蓝苏木精结晶紫亮绿苏丹IV细胞核染料（碱性）碱性品红苏木精洋红番红地衣红结晶紫甲苯胺蓝细胞质染料（酸性）酸性品红曙红固绿苦味酸伊红各种荧光染料染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染染色原理有关染色的理论至今是一个并末完全清楚的很复杂的问题。目前一般还是从物理和化学的作用来解释各种组织或细胞的染色现象。染色的物理作用
19、此理论认为组织细胞的染色是以物理作用为基础的，主要是依靠下列三种物理作用的一种或全部，使染色剂进入组织或细胞内。(1)毛细管作用及渗透作用，但染色剂与组织细胞没有牢固的结合(2)吸收作用，又称溶解学说。这种学说认为组织细胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。组织吸收染色剂，作牢固的结合。组织的着色与溶液的颜色相同，但不一定和干燥染色剂的颜色相同。例如，品红溶液为红色，所染组织也为红色，而干燥的品红则为绿色。苏丹类染色剂使脂质着色，是一种溶解现象。因为苏丹类染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度。当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时染色剂就从酒精中溶解到脂质中，从而使其着色。
20、(3)吸附作用吸附作用是固体物质的特性，即较大的物体能从周围溶液(染液)中吸附一些小颗粒(化合物或离子)到自身的特性。细胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此能选择性地吸收不同的离子，即某种蛋白质对某种染色剂有吸附作用,而对别种染色剂无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。染色的化学作用化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细胞内般也可区分为酸性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳离子(碱性部分)较牢固地结合
21、。例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸性的组成成分故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(曙红)的亲和力很大，易于着色。所以，在苏木精曙红(H.E)染色中，细胞核被碱性染色剂苏木精所染，细胞质被酸性染色剂曙红所染。这也就是细胞核是嗜碱性的，细胞质是嗜酸性的。除染色质外，粘液和软骨的基质等都是嗜碱性的，细胞质内含的某些颗粒也为嗜酸性。须注意的是嗜碱性和嗜酸性是相对而不是绝对的，若细胞在碱性染色剂溶液中停留过久，则细胞质也可染上碱性染色剂的颜色。某些细胞(如血细胞）具有特殊性质，能和中性染色剂发生亲和力而结合。由此可见，细胞各成分的染
22、色强弱是与细胞成分及染色剂的性质有密切关系：两者之间的亲和力强，染色就深；亲和力弱或无，染色也就浅或无。但是，染色的实际情况是极为复杂的，组织细胞的染色作用，还随所用溶液的pH值而变动。染色剂和染色液的配制Deiafield氏苏木精苏木精4g无水酒精25ml10铵明矾(硫酸铝铵)水溶液400m1配制时先将苏木精溶于无水酒精，待先全溶解后加入10铵明矾水溶液，充分搅动混合后，注入细口瓶内，瓶口用纱布封住。然后将瓶置于温暖有光处34天后过滤，滤后再加入100m1甘油和100ml甲醇，混合均匀后，瓶口仍用纱布封口，再置于光线充足处12月使之成熟。待颜色变成紫褐色时即为成熟。成熟
24、的载片经历脱水透明步骤最后用树胶封片。苏木精苏木精（hematoxylin）：）：细胞核和胞质内的嗜细胞核和胞质内的嗜碱性物质着蓝紫色碱性物质着蓝紫色。伊红伊红（eosin）：）：细胞质基质和间质内的胶细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色。原纤维等着红色。H.EH.EH.E染色：苏木精（染色：苏木精（HematoxylinHematoxylin）伊红（）伊红（EosinEosin）染色）染色碱性染料碱性染料将嗜碱性物质（本将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色身酸性）染成蓝色酸性染料酸性染料将嗜酸性物质（本将嗜酸性物质（本身碱性）染成红色身碱性）染成红色细胞核中的细胞核中的DNADNA、R
25、NARNA细胞质中的细胞质中的RNARNA细胞质、膜性结构细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、（线粒体、溶酶体、滑面内质网）滑面内质网）染色方法染色方法现现象象番红固绿对染法番红固绿对染法木质化的细胞壁及细胞核木质化的细胞壁及细胞核红红纤维素的细胞壁及细胞壁纤维素的细胞壁及细胞壁绿绿铁矾苏木精法铁矾苏木精法细胞一般结构及细胞分裂时期细胞一般结构及细胞分裂时期的优良染剂，细胞分裂时期的的优良染剂，细胞分裂时期的染色体染成染色体染成黑色黑色高碘酸席夫反应法高碘酸席夫反应法（PAS法）法）植物组织染成不同程度的红色，植物组织染成不同程度的红色，可将纤维素细胞壁及淀粉粒染可将纤维素细胞壁及淀粉粒染成成
28、精）酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。2、洋红（、洋红（Carmine）洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出胭脂红，再用明矾处理，除去其中杂洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出胭脂红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能
29、染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶砂等。洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。3、靛蓝洋红（、靛蓝洋红（Indigocarmine）是由木蓝（是由木蓝（Indigofera）提出的靛蓝（）提出的靛蓝（Indigo）加上亚硫酸钠而成。为蓝色酸性染料，作为细胞质的染色）加上亚
30、硫酸钠而成。为蓝色酸性染料，作为细胞质的染色剂。常与苦味酸合成苦味酸靛蓝洋红（剂。常与苦味酸合成苦味酸靛蓝洋红（picro-indigo-carmine），呈绿色，可与碱性品红作对比染色。），呈绿色，可与碱性品红作对比染色。4、地衣红（、地衣红（Orcein）是由地衣（是由地衣（Lecanoraparella）中取得的染料，可在酸性或碱性溶液中染色。植物细胞学中应用较多，尤其对于某些）中取得的染料，可在酸性或碱性溶液中染色。植物细胞学中应用较多，尤其对于某些植物的染色体染色，效果比醋酸洋红更好。配制方法与洋红相似，通常也多溶入醋酸中（植物的染色体染色，效果比醋酸洋红更好。配制方法与洋红相
31、似，通常也多溶入醋酸中（2.2）染色。现在已多用其人工合成染料。）染色。现在已多用其人工合成染料。人工染料人工染料人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。1、酸性品红（、酸性品红（Acidfuchsin）酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（酸性品红是酸性染料，呈红色
32、粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。是良好的细胞制染色剂，在动物）。是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染，能显示线粒体。组织切片在染色前先浸在带制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染，能显示线粒体。组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。2、刚果红（、刚果红（Congored）刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于
33、水喝酒精，遇酸呈蓝色。它能作染料，也用作指示剂。它在植物刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。它能作染料，也用作指示剂。它在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于它能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于它能溶于水和酒精，所以洗
34、涤和脱水处理要迅速。3、甲基蓝（、甲基蓝（Methylblue）甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。它跟伊红合用能染神经细甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。它跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用它染色后不能长久保存。胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用它染色后不能长久保存。4、固绿（、固绿（Fastgreen）固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4
35、%）和酒精（溶解度为）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。5苯胺蓝（苯胺蓝（Anilineblue）是一种混合酸性染料，平常所用很难有一定的标准。此染料一般很难溶于水，也不易溶于酒精（是一种混合酸性染料，平常所用很难有一定的标准。此染料一般很难溶于水，也不易溶于酒精（1.5）。植物制片）。植物制片中可与番红合用，作为组织染色；也可作藻类植物染色。
36、因为这种染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。中可与番红合用，作为组织染色；也可作藻类植物染色。因为这种染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。6、苏丹、苏丹（Sudan）苏丹苏丹是弱酸性染料，不溶解于水，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为是弱酸性染料，不溶解于水，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。常用）。常用70酒精中的饱和溶酒精中的饱和溶液。苏丹液。苏丹是脂肪染色剂。是脂肪染色剂。7、苏丹、苏丹（Sudan）苏丹苏丹是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，现在多用以代替苏丹是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，现在多用以代替苏丹，可染树脂、乳汁管、蜡质以及角质
37、等结构，也，可染树脂、乳汁管、蜡质以及角质等结构，也可使叶绿体染成暗红色。可使叶绿体染成暗红色。8、伊红（、伊红（Eosin）这类染料种类很多。常用的伊红这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达摄氏度是溶解度达44%）和）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。9、碱性品（复）红（、碱性品（复）红（Basicf
38、uchsin）碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度8%）。碱性品红）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。
39、在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。酸。10、结晶紫（、结晶紫（Crystalviolet）结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度8.75%）。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面）。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。它是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和应用极广，是一种优良的染色剂。它是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他
40、染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。11、龙胆紫、龙胆紫（Gentianviolet）龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上
41、用龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。12、中性红（、中性红（Neutralred）中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度1.8%）。它的碱性溶液中呈现黄色，）。它的碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物和显示动植物在强碱性溶液中呈
42、蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。陈久的中性红水溶液，用作显示尼尔体的常用染料。组织中活细胞的内含物等。陈久的中性红水溶液，用作显示尼尔体的常用染料。13、番红（、番红（Safranin）番红是碱性染料，能溶于水和酒精。番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，示番红是碱性染料，能溶于水和酒精。番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，示维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织，还能染孢子囊。维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织，还能染孢
43、子囊。14、亚甲蓝或美蓝（、亚甲蓝或美蓝（Methyleneblue）亚甲蓝或美蓝是碱性染料，呈蓝色粉末状，能溶于水（溶解度亚甲蓝或美蓝是碱性染料，呈蓝色粉末状，能溶于水（溶解度9.5%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度6%）。亚甲蓝是动）。亚甲蓝是动物学和细胞学染色上十分重要的细胞核染料，其优点是染色不会过深。物学和细胞学染色上十分重要的细胞核染料，其优点是染色不会过深。15、甲基绿（、甲基绿（methylgreen）甲基绿是碱性染料。它是绿色粉末状，能溶于水（溶解度甲基绿是碱性染料。它是绿色粉末状，能溶于水（溶解度8%）和酒精（溶解度）和酒精（溶解度3%）。甲基绿是最有价值的细胞和）
44、。甲基绿是最有价值的细胞和染色剂，细胞学上常用来染染色质，跟酸性品红一起可作植物木质部的染色。染色剂，细胞学上常用来染染色质，跟酸性品红一起可作植物木质部的染色。16、甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种、甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基一个是胺基,一个是醌型苯环一个是醌型苯环,来构成色原显色。染来构成色原显色。染料除有发色团外料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能
45、促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生帮助发色团对组织产生染色力染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团还含有两个助色团,为硷性染料为硷性染料,甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，性紫红色，封藏封藏封藏于中
46、性树胶中，使材料能在显微镜下清晰地显示出来，并能长期保存。方法：将含材料的载玻片放在吸水纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（必须在二甲苯干燥前进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。韭菜根横切面韭菜根横切面女贞茎横切女贞茎横切面（皮孔）面（皮孔）南瓜茎横切面局部南瓜茎横切面局部2、半薄切片技术、半薄切片技术观察细胞最常用的方法是先制作切片，然后用显微镜观察与摄影。以下介绍用低粘性Spurr树脂包埋植物材料，用半/超薄切片机切片的方法。2.1半薄切片主要步骤半薄切片主要步骤取材取材固定固定漂洗、脱水漂洗、脱水
47、渗透、包埋渗透、包埋半薄切片半薄切片半薄切片染色半薄切片染色每一步都是关每一步都是关键键,任何任何环节的环节的疏忽疏忽都会导致都会导致制片的制片的失败失败2.2常用固定剂常用固定剂(1)四氧化锇四氧化锇(OsO4)-OSMIUMTETRAOXIDE强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白蛋白质、磷酸脂蛋白；固定变性固定变性DNA及核蛋白，及核蛋白，不能不能固定天然固定天然DNA、RNA及糖原；及糖原；具有具有固定固定和和电子染色电子染色双重作用，样品图象反差较好；双重作用，样品图象反差较好；酶的钝化剂
50、显示保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。较差，没有电子染色作用。(3)甲醛甲醛-Formaldehyde渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好；（种子）固定作用好；细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛；性的保存优于戊二醛；缺点缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失；部分细胞基质将丢失；常用常用多聚甲醛戊二醛多聚甲醛戊二醛的混合固定液。的混合固定液。(4)高锰酸钾高锰酸钾强氧化剂，较好固定强氧化剂，较
51、好固定脂蛋白脂蛋白;对对神经髓鞘神经髓鞘、叶绿体叶绿体及其他各种及其他各种膜结膜结构构的研究均可作为固定剂；的研究均可作为固定剂；只用于某些常用固定剂难以固定的植只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定后固定.2.3漂洗漂洗漂洗的目的漂洗的目的:组织固定后脱水前的漂洗组织固定后脱水前的漂洗:清除残留固定剂清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察.双重固定中双重固定中,在锇酸固定前的漂洗在锇酸固定前的漂洗:避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密
52、的避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构饿沉淀，破坏细胞结构.常常用用缓冲液缓冲液优优点点缺缺点点pH磷酸盐磷酸盐缓冲液缓冲液对细胞无毒性作用对细胞无毒性作用,缓冲能力强缓冲能力强固定时易产生固定时易产生沉淀沉淀,易长细菌易长细菌植物材植物材料一般料一般6.87.2二甲砷二甲砷酸盐缓酸盐缓冲液冲液不易长细菌不易长细菌,与低与低浓度钙质浓度钙质1-3mM不发生沉淀反应不发生沉淀反应有毒有毒(通风橱通风橱)醋酸醋酸巴比妥巴比妥缓冲液缓冲液固定时不产生沉淀固定时不产生沉淀易长细菌易长细菌,只适只适于配锇酸固定于配锇酸固定液液,不适合配醛不适合配醛类类(缓冲失效缓冲失效)二
53、甲基砷酸钠缓冲液配制：此液配制比较简单，比较稳定，能保存，不易被细菌污染；但有一定的毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制。尽量不使试剂与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入。另外，由于二甲砷酸盐不像磷酸盐那样会和铅试剂起反应产生沉淀，因此在细胞化学中使用普遍。常用浓度为0.1mol/L。配方如下：A液（0.4mol/L二甲砷酸钠贮存液）：Na(CH3)2ASO23H2O8.65g加双蒸水至100mLB液(0.2mol/L盐酸溶液)：HCl(36%-38%)1mL:加双蒸水到60mL取25mLA液、3-4mLB液混合，测pH，可用B液调整pH值到7.2左右，再加双蒸水到5
54、0mL，配成的二甲砷酸钠浓度为0.2mol/L。在配制固定液时也应稀释到0.1mol/L。最后配成的固定液中加1-3mmol/L的钙离子，可使结构保存更好。多聚甲醛戊二醛固定液配制：取2g多聚甲醛粉末溶于21mL蒸馏水，65下不断搅拌，加13滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加25%戊二醛4mL，加二甲基砷酸钠缓冲液（0.2mol/L，pH7.2）使总体积到50mL，并加25mg无水氯化钙。混合液的pH为7.2。本液对微管有良好的保存作用。后固定液：1OsO4溶液OsO4：0.5g，0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液：50mLOsO4一般为0.5或1克安瓶中封闭包装，配制时剥去商标，
56、度。其中可塑剂的用量调节包埋块的硬度。2.Spurr2.Spurr树脂的配制树脂的配制配制时，盛树脂的烧杯放在电子天平上，按表中试剂的序顺，边滴入试剂边称量，每加入一种试剂要充分搅拌后再加另一种试剂。盛树脂的烧杯要烘干，树脂配制好后，盛树脂的烧杯要用塑料纸封口，防止树脂吸湿。树脂要随配随用，配制好树脂只能在冰箱中存放2天。通常每一个样品需要用45ml树脂，按样品数计算总量，分二次配制，一次在浸渗开始时配制，另一次在最后一次更换纯树脂时配制1.1.材料的固定材料的固定固定是制片的第一步，它的主要目的是将植物细胞迅速杀死及固定。固定剂都是蛋白质凝固剂。凝固性固定剂：凝固性固定剂：破坏结
57、构。破坏结构。甲醇、乙醇、甲醇、乙醇、丙酮、三氯醋酸、氯仿等丙酮、三氯醋酸、氯仿等非凝固性固定剂：非凝固性固定剂：破坏结构少。破坏结构少。戊二醛、戊二醛、甲醛、锇酸、醋酸、重酪酸钾等甲醛、锇酸、醋酸、重酪酸钾等戊二醛：戊二醛：最常用的固定剂，还原剂。它能与蛋白质分最常用的固定剂，还原剂。它能与蛋白质分子的氨基和肽键交连，保持细胞结构和某些酶活性。子的氨基和肽键交连，保持细胞结构和某些酶活性。锇酸：锇酸：很好的固定剂，强氧化剂。不但能固定蛋白质，很好的固定剂，强氧化剂。不但能固定蛋白质，还能对脂类固定，因而能固定膜结构。还能对脂类固定，因而能固定膜结构。吸去管瓶中的前固定液，加入12ml缓冲液于
58、管瓶，将管瓶放在振荡机上低速振荡，10min后吸去缓冲液。共清洗3次，每次10min。清洗后，管瓶中加入0.5ml后固定液。振荡固定3h左右，使固定材料逐渐变黑。后固定过程也可在冰箱中进行(即过夜)。根据固定样本数根据固定样本数编写管瓶号码。编写管瓶号码。用双面刀片将植物材用双面刀片将植物材料切成料切成1mm1mm厚的薄片，把薄片放入盛有厚的薄片，把薄片放入盛有112ml2ml前固定液的管瓶中，固定时要将管瓶前固定液的管瓶中，固定时要将管瓶盖盖紧。将管瓶放在振荡机上低速振荡盖盖紧。将管瓶放在振荡机上低速振荡3h3h左右左右。2.2.脱水脱水所谓脱水，就是用乙醇或丙酮等有机溶剂浸渍已固定的材
59、料，逐步除去样品中的水分。(1)用吸管吸去管瓶中的后固定液，用缓冲液或重蒸水清冼管瓶和固定的材料三次，每次10min。(2)用20%、40%、60%、80%、90%、95%的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度处理2030min。(3)100%乙醇浸渍材料3次，每次30min。3.3.置换置换指一种溶剂更换另一种溶剂的过程。(1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml环氧丙烷(alc:PO7:3)，处理材料10min。(2)向管瓶中追加1ml环氧丙烷(使alc:PO5:5)，处理材料10min。(3)向管瓶中再追加2ml环氧丙烷(使alc:PO3:7)，处理材料10min。(4)倾倒出管瓶中的无水
60、乙醇和环氧丙烷混合液，加入纯环氧丙烷3次，每次10min。在置换过程中管瓶要盖紧盖子，一防环氧丙烷挥发使样品干燥，二除空气中湿气进入有机溶液。4.4.浸透浸透指树脂替换有机溶剂的过程。(1)在管瓶中加入1ml环氧丙烷，向内滴入1滴Spurr树脂，将管瓶放在振荡机上低速振荡12h。(2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每滴加一次Spurr树脂，振荡12h，共滴加0.3ml左右的树脂，使树脂浓度达到25%左右。(3)用吸管吸去管瓶中0.50.8ml的环氧丙烷和Spurr树脂的混合液，然后加入纯Spurr树脂0.5ml，使树脂浓度达到50%60%左右，振荡2