本发明属于医学领域。更具体来说，本发明涉及用于产生红系祖细胞和红细胞的新颖方法。
背景技术：
维持对组织的恒定氧气供应对于许多生物、尤其是人类的生存至关重要。红细胞通过血流在身体内运送氧气。这种转运是由血红蛋白提供的，血红蛋白是红细胞所特有的一种蛋白质，其能够结合氧。当红细胞到达组织时，氧通过毛细血管壁扩散。因此，红细胞的作用至关重要。
迄今为止，输血仅基于来自供者的血液。
在成人中，红细胞产生或红细胞生成发生在所谓的造血骨髓中，该骨髓存在于扁平骨中和长骨末端。在骨髓中，称为造血干细胞的多能干细胞依次分化为不同类型的红系祖细胞(bfu-e、cfu-e、原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞)。当成红细胞离开骨髓时，它们失去了其细胞核，变成网织红细胞，然后变成成熟红细胞。
允许体外产生红细胞的用于造血干细胞的分化培养基是已知的。然而，目前的方法对于大规模生产具有严重的缺陷，例如朝红细胞成熟的取向过快，这显著限制了生产产量，以及分化为无法正确执行去核步骤的细胞(akimovs等人,2005,《干细胞》(stemcells),23(9):1423-1433；hirosesi等人,2013,《干细胞报告》(stemcellreports),1(6):499-508；huangx,2013,《分子治疗》(mol.ther.),22(2):451-463)。最后，其它方法使用与饲养细胞共培养(kuritar等人,2013,plosone,8(3):e59890)，这既实施复杂又昂贵。
这样看来，体外产生红细胞的新颖方法的开发将有可能满足供应需求，以避免出现感染风险并避免免疫并发症。
在此描述的本发明尤其旨在满足这些需求。
技术实现要素：
发明人已经证实，在含有地塞米松、雷帕霉素小分子增强剂-28(smer28)和任选地二甲基草酰甘氨酸(dmog)的培养基中培养造血干细胞，不仅将这些干细胞分化为红系祖细胞，而且还显著扩增了该祖细胞群体并同时保留了它们最终分化为红细胞的能力。由此获得的红系祖细胞可以保持培养并扩增超过60天，而不会失去其分化为成熟去核细胞即红细胞的能力。
根据第一方面，本发明涉及一种用于产生红系祖细胞的体外方法，所述方法包括使造血干细胞与细胞培养基接触，所述细胞培养基优选地适应于造血干细胞的营养需求并且特别地适应于造血系细胞的生长和/或分化，并包含糖皮质激素和自噬诱导剂。
优选地，所述糖皮质激素选自可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、帕拉米松、倍他米松、地塞米松、可的伐唑及其衍生物和混合物。更特别优选地，所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松。最特别优选地，所述糖皮质激素是地塞米松。
优选地，所述自噬诱导剂选自雷帕霉素小分子增强剂-28(smer-28)、smer-10和smer-18，及其组合。更特别优选地，所述自噬诱导剂是雷帕霉素小分子增强剂-28(smer-28)。
根据一个特定的实施方式，所述培养基还包含缺氧诱导因子(hif)通路激活剂，优选脯氨酰羟化酶抑制剂，更优选二甲基草酰甘氨酸(dmog)。
造血干细胞优选通过多能干细胞、特别是胚胎干细胞(es)或诱导性多能干细胞(ips)的分化来获得，或者从脐带血或胎盘的有或没有转移(mobilization)的患者血液样品中或者骨髓样品或集合中分离。优选地，造血干细胞是人类造血干细胞。
造血干细胞可以被遗传修饰成特别是过表达选自以下的一种或多种基因：人类端粒酶逆转录酶(htert)、b淋巴瘤mo-mlv插入区1同源物(bmi1)、c-myc、1-myc和myb。优选地，造血干细胞可以被遗传修饰成过表达htert基因或过表达bmi1基因。它们也可以被修饰成过表达htert基因和bmi1基因。
选自人类端粒酶逆转录酶(htert)、b淋巴瘤mo-mlv插入区1同源物(bmi1)、c-myc、1-myc和myb的一种或多种基因优选置于一种或多种诱导型启动子的控制下。
这些造血干细胞也可以被遗传修饰成过表达：
-一种或多种核心红系网络(cen)通路转录因子，优选lim仅结构域2(lmo2)；和/或
-一种或多种epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路基因，优选超大b细胞淋巴瘤(bcl-xl)。
优选地，造血干细胞被遗传修饰成过表达bcl-xl基因或过表达lmo2基因。
选自epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路基因的一种或多种基因优选在一种或多种组成型启动子的控制下。
选自核心红系网络(cen)通路转录因子基因的一种或多种基因优选在一种或多种诱导型启动子的控制下。
造血干细胞也可以是永生化细胞。
优选地，将细胞在本发明的培养基中培养至少20天，更优选至少40天，特别优选至少60天。
在第二方面，本发明还涉及根据本发明的细胞培养基用于产生和/或扩增红系祖细胞的用途。
在第三方面，本发明涉及如上所述的遗传修饰的造血干细胞，并且涉及这些造血干细胞用于体外产生红系祖细胞和/或红细胞的用途。
在第四方面，本发明涉及一种用于产生红细胞的体外方法，该方法包括：
-根据本发明的方法产生红系祖细胞；和
-诱导所述红系祖细胞的成熟，
-以及任选地，回收所获得的红细胞。
优选地，通过在红细胞分化培养基中培养红系祖细胞来诱导红系祖细胞的成熟。
在另一方面，本发明还涉及一种细胞培养基，其优选适应于造血系细胞的生长和/或分化，并且包含糖皮质激素，优选地塞米松，和自噬诱导剂，优选smer-28，和任选地hif通路激活剂，优选dmog。
优选地，所述培养基包含浓度为0.01mm至0.1mm的糖皮质激素，和/或浓度为2μm至30μm的自噬诱导剂，和/或浓度为75μm至350μm的hif通路激活剂。
所述自噬诱导剂优选选自雷帕霉素小分子增强剂-28(smer-28)、smer-10和smer-18及其组合，并且更特别优选为smer-28。
所述糖皮质激素优选选自可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、帕拉米松、倍他米松、地塞米松、可的伐唑及其衍生物和混合物，更特别优选选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松，最特别优选为地塞米松。
所述缺氧诱导因子(hif)通路激活剂优选为脯氨酰羟化酶(phis)抑制剂，更优选为二甲基草酰甘氨酸(dmog)。
所述培养基还可包含(i)转铁蛋白，(ii)胰岛素，(iii)肝素和(iv)血清、血浆、血清合并物或血小板裂解物，优选血小板裂解物，以及任选地干细胞因子(scf)、epo和/或il-3。
本发明还涉及根据本发明的细胞培养基用于产生和/或扩增红系祖细胞的用途。
在第五方面，本发明还涉及一种用于产生红系祖细胞和/或红细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
-根据本发明的培养基；和/或
-根据本发明的遗传修饰的造血干细胞；和
-任选地，包含这种试剂盒的使用说明的指南。
最后，在第六方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒用于产生红系祖细胞和/或红细胞的用途。
附图说明
图1：根据不同的培养方案，第14天表面标志物cd117和cd235a的表达概况。a：方案4；b：方案3；c：方案1；d：方案2。
图2：根据不同的培养方案，被遗传修饰成过表达htert、bmi1和lmo2的细胞在第24天的表面标志物cd117和cd235a的表达概况。a：方案4；b：方案1；c：方案2。
图3：根据不同的培养方案，被遗传修饰成过表达htert、bmi1和bcl-xl的细胞在第24天的表面标志物cd117和cd235a的表达概况。a：方案4；b：方案1；c：方案2。
具体实施方式
发明人已经证实，与仅添加有地塞米松的对照培养基相比，在包含自噬诱导剂即雷帕霉素小分子增强剂-28(smer28)和糖皮质激素即地塞米松的培养基中培养造血干细胞显著增加了红系祖细胞的产生。由此获得的红系祖细胞可以保持培养并扩增超过60天。发明人还证实了这些红系祖细胞能够有效地分化为红细胞。
这种体外培养方法不仅具有简单和经济的优点，而且还为大规模工业生产红系祖细胞和然后生产红细胞开辟了道路。这可以减少血液短缺或输血僵局的风险，同时为输血患者提供最佳安全性。
因此，根据第一方面，本申请涉及一种用于产生红系祖细胞的体外方法，其包括使造血干细胞与包含自噬诱导剂和糖皮质激素的培养基接触。该方法的目的是诱导造血干细胞分化为红系祖细胞，并允许该祖细胞群体扩增，即增殖，同时保持其之后分化为红细胞的能力。因此，根据本发明的方法是用于产生和扩增红系祖细胞的方法。
如本文所用，术语“红系祖细胞”是指通过在红细胞生成期间造血干细胞的分化而获得的祖细胞。这些祖细胞是有核细胞，其具有分裂并随后通过去核分化为红细胞的能力。红系祖细胞优选选自以标志物cd117、cd34、cd41、cd71和cxcr4的表达为特征的爆发形成单位-e(bfu-e)，以标志物cd117、cd34、cd36和cd71的表达为特征的集落形成单位-e(cfu-e)，以标志物cd117、cd71、cd36和cd235a的表达为特征的原成红细胞，以标志物cd117、cd71、cd36和cd235a的表达为特征的嗜碱性成红细胞，以及以标志物cd36、cd71、cd235a的表达为特征的多染性成红细胞，及其混合物。
如本文所用，术语“造血干细胞”或“hsc”是指能够分化为血细胞和免疫细胞如白细胞、红细胞和血小板的多能干细胞。造血干细胞表达cd45、cd133和/或cd34抗原。优选地，造血干细胞表达cd45和cd34抗原，以及任选地cd133抗原。
根据优选的实施方式，所述hsc是人类hsc。
如本文所用，术语“细胞单采术”是指通过单采术从血液中移出hsc。单采术是一种通过体外血液循环收集某些血液成分的技术。通过离心和萃取分离出要收集的成分，而未收集的成分则重新注入捐献者或患者体内(治疗性单采术)。
还可以通过多能干细胞、特别是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞、优选诱导性多能干细胞的分化来获得hsc。将多能干细胞分化成hsc的技术是技术人员众所周知的。已经公开了几种方案，特别是lengerkec等人(2009,《美国纽约科学院年刊》(annnyacadsci),1176:219-27)的方案，其由17天分化组成，其中通过胚状体的中间阶段和以下细胞因子的组合：scf、flt-3配体、il-3、il-6、g-csf和bmp-4。
根据本发明的方法中使用的hsc也可以是遗传修饰的hsc，以增加其参与红细胞生成的能力和/或其扩增能力。因此，根据某些实施方式，根据本发明的方法可以包括hsc的遗传修饰，以增加其参与红细胞生成的能力和/或其扩增能力。遗传修饰这些细胞的方法是技术人员众所周知的，并且包括例如经由逆转录病毒或慢病毒将转基因引入细胞基因组中或任何其它形式的基因或蛋白质转移。
根据一个实施方式，这些hsc的扩增能力通过过表达选自人类端粒酶逆转录酶(htert)、b淋巴瘤mo-mlv插入区1同源物(bmi1)、c-myc、l-myc和myb的一种或多种基因来提高。
根据一个特定的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达htert。
根据另一个具体实施方式，hsc被遗传修饰成过表达htert以及选自b淋巴瘤mo-mlv插入区1同源物(bmi1)、c-myc、1-myc和myb的一种或多种基因。
根据一个优选的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达htert和/或bmi1，优选htert和bmi1。
hsc参与红细胞生成通路的能力可以通过过表达epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路和/或核心红系网络(cen)通路中涉及的一种或多种基因来提高。
如本文所用，术语“epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路”是指其关键蛋白是促红细胞生成素(epo)受体、janus激酶2(jak2)、信号转导及转录激活因子5(stat5)以及超大b细胞淋巴瘤(bcl-xl)的细胞信号通路。epo对于红细胞生成是必不可少的，它可以促进红系细胞参与和细胞存活。epo与其膜受体的结合引起epo-r的二聚化，当被激活时，epo-r又诱导jak2。然后，jak2磷酸化epo-r胞质尾部的酪氨酸残基。这些磷酸酪氨酸允许与含有src同源2(sh2)结构域的蛋白质相互作用，从而导致激活不同的信号通路，主要的是stat5通路。stat5首先被二聚化，然后被磷酸化，这导致其易位到细胞核中，在此其激活不同基因的转录，包括涉及细胞增殖和红系细胞分化的基因。
根据一个实施方式，hsc被遗传修饰成过表达epo-r/jak2/stat5p/bcl-xl通路的一种或多种基因，优选地选自编码epo-r、jak2、stat5p、bcl-xl和bcl-2及其组合的基因的一种或多种基因。
根据一个特定的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达编码bcl-xl的基因。
如本文所用，术语“cen通路”是指对于建立或维持红细胞的身份必不可少的一组转录因子。
根据一个实施方式，hsc被遗传修饰成过表达一种或多种cen通路基因，优选地选自以下的一种或多种基因：编码gata1(属于与dna序列“gata”结合的锌指蛋白家族的转录因子)、talbhlh转录因子1(tal1)、kruppel样因子1(klf1)、lim域结合1(ldb1)、lim仅结构域2(lmo2)的基因和干细胞白血病基因(scl)及其组合。
根据一个特定的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达编码lmo2的基因。
根据一个特定的实施方式，根据本发明的方法中使用的hsc被遗传修饰成过表达：
(i)选自以下的一种或多种基因：编码htert、bmi1、c-myc、l-myc和myb及其组合，优选htert和/或bmi1，并且更特别优选htert和bmi1的基因；和
(ii)一种或多种epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路基因，优选选自编码epo-r、jak2、stat5、bcl-xl和bcl-2及其组合，并且更特别优选bcl-xl的基因；和/或
(iii)一种或多种cen通路基因，优选选自编码gata1、tal1、klf1、ldb1、lmo2和scl及其组合，并且更特别优选lmo2的基因。
根据另一个特定的实施方式，根据本发明的方法中使用的hsc被遗传修饰成过表达：
(ii)一种或多种epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路基因，优选选自编码epo-r、jak2、stat5p、bcl-xl和bcl-2及其组合，并且更特别优选bcl-xl的基因；和
根据一个优选的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达
(i)编码htert的基因，以及任选地编码bmi1的基因，和
(ii)编码lmo2的基因和/或编码bcl-xl的基因，优选编码bcl-xl的基因。
特别地，hsc可以被遗传修饰成过表达编码htert的基因和编码bcl-xl的基因，以及任选地编码bmi1的基因。
根据另一个优选的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达
(i)编码htert和bmi1的基因，以及
(ii)编码lmo2的基因和/或编码bcl-xl的基因。
特别是，hsc可以被遗传修饰成过表达
(i)编码htert和bmi1的基因以及编码lmo2的基因，或
(ii)编码htert和bmi1的基因以及编码bcl-xl的基因。
如本文所用，术语“过表达”是指遗传修饰的细胞中基因的表达水平高于未遗传修饰的细胞中同一基因的表达水平。当细胞在遗传修饰之前不表达所讨论的基因但在修饰之后表达它时，该术语可以用“表达”代替。
可以通过技术人员已知的任何技术来实现hsc中基因的过表达，特别是通过将包含一种或多种待过表达的基因的核酸或几种各自包含一种待过表达的基因的核酸引入hsc中。因此，可以将一种或多种核酸布置在同一构建体上或独立的构建体中。可以通过技术人员已知的任何方法，特别是通过病毒转导、显微注射、转染、电穿孔和生物弹丸法，将它们引入hsc中。
如本文所用，术语“构建体”是指表达盒或表达载体。
在表达盒中，待过表达的一种或多种基因与它们表达所必需的序列可操作地连接。特别地，它们可以处于允许其在hsc中表达的启动子的控制下。通常，表达盒包括启动转录的启动子、一种或多种基因和转录终止子，或由其组成。表述“可操作地连接”表示元件被组合以使得编码序列的表达在转录启动子的控制下。通常，启动子的序列位于一个或多个目标基因的上游(5')。间隔子序列可以存在于调节元件与所述基因之间，只要它们不阻止通过编码蛋白的翻译的表达即可。表达盒还可以包括与启动子可操作地连接的至少一个“增强子”激活序列。
表达载体包括一种或多种所述的核酸或表达盒。该表达载体可用于转化宿主细胞并允许在所述细胞中表达目标核酸。载体可以通过技术人员众所周知的常规分子生物学技术来构建。
有利地，表达载体包括允许表达目标核酸的调控元件。这些元件可以包括例如转录启动子、转录激活子、终止子序列、起始和终止密码子。选择这些元件的方法是技术人员众所周知的。
载体可以是圆形或线性，单链或双链的。它有利地选自质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒和人工染色体。优选地，所述载体是病毒载体。
可以将待过表达的一种或多种基因置于相同或不同的组成型或诱导型启动子的控制下，无论它们是否存在于同一核酸上。
hsc可以被瞬时或稳定地转化/转染，并且一种或多种核酸、盒或载体可以作为游离体包含在细胞中或整合到hsc基因组中。它们可以插入到真核细胞基因组中的相同或不同区域中。
存在技术人员众所周知的许多技术，其允许稳定或瞬时表达目标基因。特别地，可以使用敲入技术，使用靶向表达系统，特别是crispr-cas9系统，将目标基因整合到细胞的基因组中(参见例如platt等人,《细胞》(cell).2014年10月9日；159(2):440-55或lo等人,《生物技术》(biotechniques).2017年4月1日；62(4):165-174)。这项技术允许将一个或多个目标基因的单拷贝插入到细胞基因组中的预定基因座，该技术基于一种或多种载体的转染，所述载体允许编码cas9核酸酶的基因与对将插入一个或多个基因的基因座具有特异性的向导rna(grna)的协同表达。由于cas9产生的断裂的修复，插入了所述一种或多种目标基因或包含所述一种或多种目标基因的盒。
如本申请中所用，术语“向导rna”或“grna”是指能够与cas9相互作用以将其引导至靶染色体区域的rna分子。
每个grna可以包括两个区域：
-在grna的5'端的第一区域(通常称为“sds”区域)，其与靶染色体区域互补并模拟内源crispr系统的crrna，和
-位于grna的3'端的第二区域(通常称为“手柄”区域)，该区域模拟反式激活crrna(tracrrna)与内源crispr系统crrna之间的碱基配对相互作用，并具有双链茎环结构，在3'端具有基本上单链的序列。该第二区域对于grna-cas9结合必不可少。
目标基因或包含一个或多个目标基因的盒侧接有grna靶向的断裂位点的同源序列，从而允许利用同源重组通过断裂修复插入所述基因或盒。
允许组成型表达的启动子的实例包括但不限于pef1α长、pcmv和pcag。
可以在本发明中使用的诱导型表达系统是tet-on系统，它基于四环素反式激活蛋白(tta)的使用，该蛋白是通过将大肠杆菌中存在的四环素阻遏物(tetr)蛋白与疱疹病毒中存在的vp16蛋白的激活域融合而产生的。rtta蛋白只有结合四环素才能与特定teto操作序列上的dna结合。几个重复teto序列被置于启动子例如ef1α长启动子的控制下。与启动子偶联的teto序列称为四环素反应元件(tre)，并且通过引起在启动子控制下的基因的表达增加来响应四环素反式激活蛋白(tta)结合。
当几个基因被过表达时，它们可以被置于同一启动子或几个启动子的控制下。
根据一个特定的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达选自编码htert、bmi1、c-myc、l-myc和myb及其组合，优选htert和/或bmi1并且更特别优选htert和bmi1的基因的一种或多种基因，并且将该基因或这些基因置于一种或多种诱导型启动子的控制下。
根据一个特定的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达优选选自编码gata1、tal1、klf1、ldb1、lmo2和scl及其组合并且更特别优选lmo2的基因的一种或多种cen通路基因，并且将该基因或这些基因置于一种或多种诱导型启动子的控制下。
根据一个特定的实施方式，hsc被遗传修饰成过表达一种或多种epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路基因，其优选选自编码epo-r、jak2、stat5p、bcl-xl和bcl-2及其组合并且更特别优选bcl-xl的基因，并且将该基因或这些基因置于一种或多种组成型启动子的控制下。
根据一个优选的实施方式，hsc被遗传修饰成在诱导型启动子的控制下过表达编码htert的基因并在组成型启动子的控制下过表达编码bcl-xl的基因。
根据另一个优选的实施方式，hsc被遗传修饰成在一种或多种诱导型启动子的控制下过表达编码htert、bmi1和lmo2的基因。
根据另一个优选的实施方式，hsc被遗传修饰成在一种或多种诱导型启动子的控制下过表达编码htert和bmi1的基因并在组成型启动子的控制下过表达编码bcl-xl的基因。
可替选地，或除了上述遗传修饰之外，还可以对根据本发明的方法中使用的hsc进行遗传修饰，以包含在诱导型启动子控制下的自杀基因，例如hsv-tk基因或casp9基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指取决于所考虑的自杀基因，在存在或不存在其它分子(药物或其它)的情况下，其表达引起表达其的有分裂能力的细胞死亡的任何基因。举例来说，通过加入更昔洛韦或ap1003，分别获得表达hsv-tk基因或casp9基因的细胞的细胞死亡。
根据某些实施方式，在根据本发明的方法中使用的hsc是永生化hsc。这些永生化细胞可以如上所述进一步遗传修饰。
永生化hsc可以从由恶性细胞建立的永生化细胞系获得。
优选地，永生化hsc获自由非恶性细胞建立的永生化细胞系，例如来自ips(kurita等人,plosone,2013,8,e59890)，脐带血细胞(kurita等人,同上；huang,x.等人,《分子治疗》(mol.ther.)2014,22,451-463)，胚胎干细胞(hirose,s.等人,《干细胞报告》(stemcellrep.)2013,1,499-508)，或从骨髓、细胞单采术或全外周血中分离的hsc(trakarnsanga等人,2017,《自然通讯》(naturecommunications),第8卷,14750)。
可以通过技术人员已知的任何技术来使hsc永生化，特别是通过用携带人类乳头瘤病毒16型致癌基因e6和e7(hpv16e6/e7)的慢病毒载体进行转导(akimov等人,《干细胞》(stemcells).2005年10月；23(9):1423-1433；trakarnsanga等人,同上)。任选地，hsc也可以用携带编码htert的基因的慢病毒载体进行转导(akimov等人,同上)。
根据一个优选的实施方式，在根据本发明的方法中使用的永生化hsc包含自杀基因，其允许在诱导红系祖细胞成熟变为成熟去核的红细胞后将所述永生化hsc消除。
根据本发明的方法包括使如上所述的hsc与糖皮质激素和自噬诱导剂接触，更特别地与适应于造血系细胞生长和/或分化并包含糖皮质激素和自噬诱导剂的培养基接触。
如本文所用，术语“自噬”、“自溶”和“自噬作用”是等同的并且可以互换使用。自噬是指细胞细胞质被其自身溶酶体部分降解。
自噬是一种生理过程，其有助于消除某些蛋白质(病毒、畸形等)和受损的细胞器。该过程也可以参与细胞内病原体的消除。几种信号通路检测不同类型的细胞应激，范围从营养剥夺到微生物入侵，并收敛以调节自噬。如本文所用，术语“自噬诱导剂”是指能够在细胞中诱导自噬的分子。
特别地，自噬诱导剂可以是mtor通路抑制剂，例如二甲双胍，雷帕霉素，哌立福新，依维莫司，白藜芦醇或他莫昔芬，自噬体形成激活剂如化合物mg-132(26s蛋白酶体抑制剂)、化合物saha(泛组蛋白脱乙酰酶抑制剂)、曲古抑菌素a或丙戊酸，或独立于mtor通路起作用的小分子如smer-28、smer-10或smer18。
根据一个特定的实施方式，自噬诱导剂是独立于mtor通路起作用的诱导剂，其优选选自雷帕霉素小分子增强剂-28(smer-28)、smer10和smer18及其组合。
根据一个优选的实施方式，所述自噬诱导剂是smer-28。
如本文所用，术语“糖皮质激素”、“皮质类固醇”或“类皮质激素”是等同的并且可以互换使用。这些术语是指天然或合成的类固醇激素，其具有孕烷核并且对蛋白质和碳水化合物的代谢有作用。
根据一个实施方式，糖皮质激素选自可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、帕拉米松、倍他米松、地塞米松、可的伐唑及其衍生物和混合物。
根据一个特定的实施方式，糖皮质激素是合成激素，优选选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、帕拉米松，倍他米松，地塞米松、可的伐唑及其衍生物和混合物。
根据一个优选的实施方式，糖皮质激素选自泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松及其衍生物和混合物，优选地选自泼尼松龙、甲基泼尼松龙和地塞米松。
根据一个特别优选的实施方式，糖皮质激素是地塞米松。
根据一个特定的实施方式，自噬诱导剂选自smer-28、smer10和smer18，优选为smer-28，并且糖皮质激素选自泼尼松龙、甲基泼尼松龙和地塞米松，优选为地塞米松。
根据一个非常特定的实施方式，自噬诱导剂是smer-28，并且糖皮质激素是地塞米松。
任选地，hsc也可以与hif通路的激活剂接触。如本文所用，术语“hif通路”是指由缺氧诱导因子(hif)引发的信号通路，其刺激epo分泌并因此激活epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路。
优选地，根据本发明的hif通路激活剂是脯氨酰羟化酶(phis)抑制剂。
如本文所用，术语“脯氨酰羟化酶(phis)”和“前胶原-脯氨酸双加氧酶”是等同的并且可以互换使用。脯氨酰羟化酶是hif在其脯氨酰残基上的羟化酶。当羟化时，hif受到抑制。因此，脯氨酰羟化酶的特异性抑制剂是能够抑制脯氨酰羟化酶并因此激活hif通路的分子，所述hif通路又激活epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路。
优选地，脯氨酰羟化酶抑制剂选自二甲基草酰甘氨酸(dmog)、n-草酰甘氨酸(nog)、去铁草胺(dfo)、fg-4383、f-0041、fg-2216、fg-4592、s956711、3,4-二羟基-苯甲酸乙酯(edhb)、tm6089、tm655、tm6008、8-羟基喹啉及其衍生物。
最特别优选地，hif通路激活剂是dmog。
在实施根据本发明的方法的过程中，将hsc在适应于造血系细胞生长和/或分化的培养基中培养。适应于hsc营养需求的许多培养基是技术人员已知的并且可商购获得，例如优选补充有干细胞因子(scf)、促红细胞生成素(epo)和脂质的stemspansfem(stemcelltechnologies)或人类stemmacshsc扩增培养基xf(invitrogen)。
优选地，以200至10000个细胞/毫升、优选500至2000个细胞/毫升并且更优选约1000个细胞/毫升的浓度培养hsc。
优选约每3天更换培养基，以使得细胞的浓度不超过约4000000个细胞/毫升。
在培养的第一天或培养几天后，例如10至15天后，可使hsc与糖皮质激素和自噬诱导剂接触。
优选地，使hsc同时与糖皮质激素和自噬诱导剂接触。
或者，hsc可首先与糖皮质激素接触，然后与自噬诱导剂接触，反之亦然。第二化合物的添加可以例如在与第一化合物接触后几个小时进行。
优选地，使hsc同时与糖皮质激素和自噬诱导剂接触。更特别优选地，从培养的第一天起使hsc与糖皮质激素和自噬诱导剂同时接触。
可以通过将糖皮质激素和/或自噬诱导剂添加到hsc培养基中或通过将hsc置于含有糖皮质激素和/或自噬诱导剂的培养基中来实现接触。
糖皮质激素和自噬诱导剂的浓度在整个培养或接触过程中可以是恒定的或变化的。
优选地，当培养基包含糖皮质激素时，糖皮质激素以0.001mm至10mm、优选0.01mm至1mm、更优选0.01mm至0.5mm并且特别优选0.02mm至0.1mm的浓度存在。
根据一个特定的实施方式，当培养基包含糖皮质激素时，糖皮质激素以约0.1mm的浓度存在。
优选地，当培养基包含自噬诱导剂时，自噬诱导剂以0.1μm至100μm、优选0.5μm至50μm、更优选1μm至30μm并且特别优选2μm至30μm的浓度存在于培养基中。或者，当培养基包含自噬诱导剂时，自噬诱导剂可以10μm至30μm的浓度存在于培养基中。
根据一个特定的实施方式，当培养基包含自噬诱导剂时，自噬诱导剂以约2μm的浓度存在于培养基中。
如本文所用，术语“约”是指指定值的±5％，优选为指定值的±2％的值的范围。例如，“约20”包括20±5％，或19至21。
类似地，在将hsc置于hif通路激活剂存在下的实施方式中，激活剂的浓度在整个培养或接触过程中可以是恒定的或者可以变化。
优选地，当培养基包含hif通路激活剂，优选dmog时，后者以1μm至1000μm、优选10μm至500μm、更优选50μm至400μm并且特别优选75μm至350μm的浓度存在于培养基中。
根据一个特定的实施方式，在培养10至15天后，将hsc置于糖皮质激素优选地塞米松和自噬诱导剂优选smer28的存在下。优选地，根据该实施方式，糖皮质激素的浓度为0.01mm至0.5mm，更特别优选0.02mm至0.1mm，并且自噬诱导剂的浓度为10μm至30μm。
根据另一个特定的实施方式，从培养的第一天起或在培养10天之前，将hsc置于糖皮质激素优选地塞米松和自噬诱导剂优选smer28的存在下。优选地，根据该实施方式，糖皮质激素的浓度为0.01mm至0.5mm，优选约0.1mm，并且自噬诱导剂的浓度为2μm至30μm，优选约2μm。
优选将hsc在包含糖皮质激素和自噬诱导剂以及任选地hif通路激活剂的培养基中保持至少10天。更特别优选地，将hsc在含有糖皮质激素和自噬诱导剂的培养基中保持至少20、30、40、50或60天。
应理解，在该步骤期间，细胞培养不仅包括hsc，还包括红系祖细胞。
发明人已经证实，使用含有糖皮质激素和自噬诱导剂的培养基显著扩增了红系祖细胞的产生，所述红系祖细胞不参与末端红系分化通路。因此，根据本发明的方法，hsc可以在含有糖皮质激素和自噬诱导剂的培养基中培养至少60、70、80、90或100天。优选地，将hsc在含有糖皮质激素和自噬诱导剂的培养基中培养最多70、80、90或100天。
可以维持培养直至出现成熟为成熟红细胞的标志物。优选地，当细胞不再扩增和/或少于10％、优选少于5％的细胞表达膜受体cd117时，停止培养。或者，当培养物中至少90％、优选至少95％的细胞已经达到多染性成红细胞阶段或处于分化的更高级阶段时，可以停止培养。
根据某些实施方式，该过程可以包括交替的以下阶段：其中培养基包含糖皮质激素和自噬诱导剂以及任选地hif通路激活剂的培养阶段，和其中培养基不包含糖皮质激素、自噬诱导剂和/或hif通路激活剂的培养阶段。
糖皮质激素、自噬诱导剂和hif通路激活剂可以同时或相继添加到培养基中或从培养基中去除。
改变培养基组成的技术是技术人员众所周知的。特别地，可以在预先存在的培养基中直接进行分子的添加或其浓度的增加，并且可以通过离心细胞并将其重悬于新的培养基中或通过稀释培养基来进行分子的去除或其浓度的降低。
根据本发明的方法可以进一步包括回收所获得的红系祖细胞的步骤。该步骤可以通过技术人员已知的任何技术进行，特别是通过离心和去除培养基。本发明的方法还可包括细胞分选步骤，特别是基于标志物cd117的表达的细胞选择步骤。可以选择cd117+细胞以延长红系祖细胞的扩增。相反，可以选择cd117-细胞以产生红细胞。
根据本发明的方法还可以包括洗涤获得/回收的红系祖细胞的步骤。该步骤可以通过技术人员已知的任何技术进行，特别是通过一系列离心和重悬步骤。
根据一个特定方面，本发明还涉及通过本发明的方法获得的红系祖细胞群体。
根据另一方面，本发明还涉及通过根据本发明的方法获得的红系祖细胞用于产生红细胞的用途。
如本文所用，术语“红细胞”、“成熟红细胞”、“红小体”、“红血球”和“成熟红血球”是等同的，并且可以互换使用。术语“红细胞”是指具有红细胞成熟的特征性标志物的去核细胞。它们特别表达糖蛋白a(cd235a)，但不表达标志物cd36。
因此，本发明涉及一种用于产生红细胞的体外方法，该方法包括：
-根据上述本发明方法产生红系祖细胞；和
-诱导所述红系祖细胞的成熟。
在这方面也考虑了上述根据本发明产生红系祖细胞的方法的实施方式。
红系祖细胞的成熟可包括表达红细胞成熟标志物如cd235a并通过去核。
本发明的方法还可包括细胞分选步骤，特别是cd117-细胞选择步骤。
可以通过技术人员已知的任何方法来诱导祖细胞的成熟。特别地，可以通过在红细胞分化培养基，例如补充有促红细胞生成素和任选地smer28的培养基中培养红系祖细胞来诱导成熟。优选地，通过在不包含干细胞因子(scf)或地塞米松并且补充有促红细胞生成素(约2.5iu/ml)和任选地smer28(约2.5μm)的培养基中培养红系祖细胞来诱导成熟。或者，通过将细胞置于无血清培养基中来诱导成熟。优选地，在高细胞浓度下，例如高于5,000,000个细胞/毫升培养物，诱导祖细胞成熟。
根据一个实施方式，根据本发明的产生红细胞的方法还包括消除有核细胞的步骤。该步骤导致仅包含成熟红细胞的均质群体。
根据一个特定的实施方式，其中在根据本发明的产生红系祖细胞的方法中使用的hsc包括诱导性自杀基因，该消除有核细胞的步骤可以通过诱导该自杀基因的表达来进行。
用于产生红细胞的方法可以进一步包括回收所获得的红细胞的步骤。该步骤可以通过技术人员已知的任何技术来进行，特别是通过过滤、离心和去除培养基。
根据本发明的方法还可以包括洗涤获得/回收的红细胞的步骤。该步骤可以通过技术人员已知的任何技术进行，特别是通过一系列的过滤、离心和重悬步骤。
根据另一方面，本发明还涉及一种通过本发明的方法获得的红细胞群体。
根据另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含通过本发明的方法获得的红系祖细胞和药学上可接受的载体。
本发明还涉及根据本发明的红系祖细胞，或包含根据本发明的红系祖细胞的药物组合物，其用作造血移植物。如本文所用，术语“造血移植物”是指打算施用于受试者的骨髓并且能够产生红细胞的一组细胞。
本发明还涉及根据本发明的红系祖细胞，或包含根据本发明的红系祖细胞的药物组合物，其用于治疗贫血。
如本文所用，术语“贫血”是指异常血液计数，其特征在于健康的红细胞水平异常低并且循环血红蛋白下降到受试者年龄的正常值以下。举例说明，贫血的特征通常是男性的血红蛋白水平低于13g/dl，女性的血红蛋白水平低于12g/dl，儿童的血红蛋白水平低于11g/dl以及新生儿的血红蛋白水平低于14g/dl。
贫血可能具有多种多样的原因。贫血的实例包括但不限于与出血(例如外伤或手术引起的出血)有关的贫血，由药物治疗(例如化学疗法)或暴露于有毒物质(例如脂解剂、氧化剂、铅、毒液或毒物)引起的贫血，由遗传性红细胞膜病症(例如遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症或遗传性热变性异形红细胞增多症)引起的溶血性贫血，由获得性红细胞膜病症(例如阵发性夜间血红蛋白尿或棘形红细胞增多症)引起的溶血性贫血，自身免疫性溶血性贫血(例如输血事故)，由感染物(例如疟疾，巴贝虫(babesia)或巴尔通体(bartonella)感染，锥虫病，内脏利什曼病，败血病或cmv感染)引起的贫血，遗传性或获得性铁粒幼细胞性贫血，由骨髓衰竭(例如，骨髓抑制，维生素b12缺乏症，骨髓增生异常或由恶性血液病(白血病、淋巴瘤、转移瘤)导致的骨髓疾病侵袭))引起的贫血，或与镰状细胞病或地中海贫血综合征有关的贫血。优选地，贫血与镰状细胞病或地中海贫血综合征有关。
本发明还涉及一种用于治疗患有贫血的患者的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效量的通过本发明的方法获得的红系祖细胞，或包含根据本发明获得的红系祖细胞的药物组合物。
本发明还涉及根据本发明获得的红系祖细胞或包含所述祖细胞的药物组合物的用途，其用于制备用于治疗贫血的药物，特别是生物药物。
优选地，在这个方面，红系祖细胞获自非遗传修饰的hsc。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是等同的并且可以互换使用。这些术语优选是指动物，特别是哺乳动物，最特别优选是人类，特别是胎儿、新生儿、儿童、少年、成人或老年人。如本文所用，术语“胎儿”是指妊娠超过8周的宫内发育阶段，术语“新生儿”是指12月龄以下的人，术语“儿童”是指年龄为1至12岁的人，术语“成人”是指年龄为12至60岁的人，而术语“老年人”是指年龄为60岁或更高的人。
所述患者优选是输血失败，被多次输血或具有稀有血型的患者。根据一个优选的实施方式，该患者患有贫血，特别是与镰状细胞病或地中海贫血综合征有关的贫血。
如本文所用，术语“输血失败”是指无效和/或诱发患者的病理并发症的输血。
当输注红细胞浓缩物(rcc)24小时后，输血效率低于80％时，可认为红细胞输注无效。
红细胞输注效率(ete)由以下公式计算：
输注的hb的最小量为40g，所观测到的平均值为50g。tbv是指总血容量。
如本文所用，术语“多次输血”是指经历过几次输血的患者和/或已经进行过输血并且将要接受另一次输血的患者。
如本文所用，术语“稀有血型”是指在法国和/或欧洲和/或全球人口中频率小于1/250的血型和/或血型携带患者不能用o型血输血的血型。稀有血液存在供应困难。
在兽医应用领域中，本发明的主题可以是非人类动物，优选是宠物或农场动物，例如选自狗、猫、牛、绵羊、兔、猪、山羊、马、啮齿动物、非人类灵长类动物和家禽。
如本文所用，术语“治疗”是指旨在改善或消除症状，减慢疾病的发展，停止疾病的发展或消除疾病的任何作用。这个术语更具体地是指健康红细胞和循环血红蛋白水平的增加，优选达到受试者年龄的正常值。该术语包括预防和治疗性治疗。如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以对病症的至少一种症状产生作用，并且更具体而言，足以增加所治疗的受试者中的健康红细胞和循环血红蛋白的水平的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的承载物”是等同的，并且是指药物组合物中存在的除活性成分以外的任何物质。其添加特别地旨在促进细胞的保存和施用，而不改变其性质。用于配制根据本发明的含有红细胞或红细胞祖细胞的组合物的药学上可接受的载体可以例如选自盐水，添加有人血清白蛋白的pbs溶液及其混合物，或具有适合于保存红细胞和/或祖细胞的摩尔渗透压浓度并且优选可直接施用于受试者的任何其它盐水溶液。为了配制含有红细胞的组合物，也可以将盐水-腺嘌呤-葡萄糖-甘露糖醇(sagm)培养基单独或与上述其它药学上可接受的载体组合用作药学上可接受的载体。
优选地，祖细胞或移植物的施用在患者的骨髓处或通过静脉内注射进行。
根据一个优选的实施方式，用于产生红系祖细胞的造血干细胞来自捐献者样品或来自从捐献者获得的细胞，并且所述红系祖细胞旨在被移植到接受患者中。捐献者和接受者可以是同一个体(自体移植)或不同的个体(同种异体移植)。优选地，捐献者和接受者是同一个体。
根据另一方面，本发明涉及一种药物组合物或药物，特别是生物药物，其包含通过本发明的方法获得的红细胞和药学上可接受的载体。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的红细胞或包含根据本发明获得的红细胞的药物组合物，其用于向患有贫血即需要供应红细胞的患者输注。
本发明还涉及一种用于治疗患有贫血即需要供应红细胞的患者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的通过本发明的方法获得的红细胞，或包含根据本发明的红细胞的药物组合物。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的红细胞或包含根据本发明获得的红细胞的药物组合物，其用于治疗贫血。
优选地，贫血是与镰状细胞病或地中海贫血综合征有关的贫血。
优选地，患者输血失败，被多次输血或具有稀有血型。
在个性化医学的背景下，根据用于产生红细胞的体外方法获得待施用或被施用于患者的红细胞，所述方法包括：
-从所述患者的样品中获得hsc；
-根据本发明的方法从所述hsc获得红系祖细胞；和
-根据本发明的方法从所述红系祖细胞获得红细胞。
可以从患者血液或骨髓样品中获得hsc。或者，hsc可以从通过对获自患者的分化体细胞进行遗传重编程而获得的ipsc获得。
hsc可以任选地如上所述进行遗传修饰。
根据另一方面，本发明还涉及被遗传修饰成过表达以下的hsc：
(i)选自以下的一种或多种基因：编码htert、bmi1、c-myc、l-myc和myb及其组合，优选htert和/或bmi1并且更特别优选htert和bmi1的基因；和
(ii)一种或多种epo-r/jak2/stat5/bcl-xl通路基因，其优选选自编码epo-r、jak2、stat5p、bcl-xl和bcl-2及其组合并且更特别优选bcl-xl的基因；和/或
(iii)一种或多种cen通路基因，其优选选自编码gata1、tal1、klf1、ldb1、lmo2和scl及其组合并且更特别优选lmo2的基因。
在这方面，还考虑了涉及用于产生红系祖细胞的方法中使用的hsc的实施方式。
根据一个优选的实施方式，hsc被遗传修饰成在诱导型启动子的控制下过表达编码htert的基因以及在组成型启动子的控制下过表达编码bcl-xl的基因。
在另一个优选的实施方式中，hsc被遗传修饰成在一种或多种诱导型启动子的控制下过表达编码htert和bmi1的基因以及在组成型启动子的控制下过表达编码bcl-xl的基因。
遗传修饰的hsc也可以包含如上所述的自杀基因或被永生化。
本发明还涉及根据本发明的遗传修饰的hsc用于特别是根据上述本发明的方法优选在体外产生红系祖细胞和/或红细胞的用途。
根据另一方面，本发明涉及一种细胞培养基，其适应于hsc的营养需求，并且特别适应于造血系细胞的生长和/或分化，并且包含糖皮质激素和自噬诱导剂，以及任选地hif通路激活剂。
在这方面还考虑了涉及在产生红系祖细胞的方法中使用的包含糖皮质激素和自噬诱导剂以及任选地hif通路激活剂的培养基的实施方式。
糖皮质激素和自噬诱导剂如上文对于根据本发明的方法所定义。优选地，糖皮质激素是地塞米松和/或自噬诱导剂是smer28和/或hif通路激活剂是dmog。
适应于造血系细胞生长和/或分化的细胞培养基的基质可以是技术人员已知满足hsc和/或红系祖细胞需要的任何基质。
如本文所用，术语“生长”是指细胞的增殖。术语“分化”是指培养的细胞获得最初用于接种培养基的细胞中不存在的特征。在当前情况下，该术语是指获得红系祖细胞的特征。因此，适应于造血系细胞生长和/或分化的培养基是允许hsc分化为红系祖细胞以及hsc和红系祖细胞增殖的培养基。该术语不应与“成熟”相混淆，“成熟”在此定义了红系祖细胞变成红细胞的过程并且其特别涉及细胞的去核。因此，适应于造血系细胞生长和/或分化的培养基优选不包含任何诱导该成熟的化合物。
细胞培养基的基质可以包括iscove改良的dulbecco培养基(imdm)或适应于hsc营养需求的等效培养基(例如stemspansfem(stemcelltechnologies)或人类stemmacshsc扩增培养基xf(invitrogen))，其补充有胰岛素、转铁蛋白、干细胞因子(scf)、肝素、il-3、epo、生长因子和/或血清、血浆、血小板裂解物和/或血清合并物。添加到培养基中的化合物优选是通过重组或纯化技术获得的人类化合物。技术人员可以根据供应商的建议或本领域的常识容易地确定这些不同化合物的浓度。
如本文所用，术语“血清合并物”是指被减毒的人类ab血浆的混合物(最经常是超过100种不同血浆的混合物)。为此，将来自输血中心的ab血浆混合，减毒并最终等分。血清合并物然后可以新鲜使用或冷冻保存。
如本文所用，术语“血小板裂解物”是指由于血小板浓缩物的裂解而获得的富含生长因子的产物。为此，可以将来自输血中心的血小板浓缩物在裂解前混合。存在技术人员众所周知的不同裂解方法，特别是超声裂解，使用溶剂和/或去污剂，或冷冻裂解。血小板浓缩物优选通过冷冻裂解来裂解。冷冻裂解由冷冻/解冻循环、通常两个循环组成，这会导致血小板破裂，并将其中包含的生长因子释放到血浆中。任选地，可在裂解之后进行离心和/或过滤。血小板裂解物然后可以新鲜使用或冷冻保存。
优选地，根据本发明的培养基的基质是如上文所定义的imdm或等效培养基，其补充有：
-转铁蛋白，优选人类转铁蛋白，其浓度为约200μg/ml至约400μg/ml，优选约300μg/ml至约350μg/ml，更优选浓度为约330μg/ml；和/或
-胰岛素，优选人类胰岛素，其浓度为约1μg/ml至约50μg/ml，优选约5μg/ml至约20μg/ml，更优选浓度为约10μg/ml；和/或
-肝素，优选人类肝素，其浓度为约0.5u/ml至约10u/ml，优选约1u/ml至约5u/ml，更优选浓度为约3u/ml。
任选地，特别是对于适应于造血系细胞生长和/或分化的培养基，该培养基还可以补充有：
-il-3，优选人类il-3，其浓度为约1ng/ml至约20ng/ml，优选约3ng/ml至约7ng/ml，更优选浓度为约5ng/ml；
-scf，优选人类scf，其浓度为约10ng/ml至约200ng/ml，优选约50ng/ml至约150ng/ml，更优选浓度为约100ng/ml；和/或
-epo，优选人类epo，其浓度为约0.5iu/ml至约10iu/ml，优选约1iu/ml至约5iu/ml，更优选浓度为约2iu/ml。
在一个特定的实施方式中，根据本发明的培养基的基质优选是如上文所定义的imdm或等效培养基，并且包括转铁蛋白、胰岛素、肝素和血清、血浆、血清合并物或血小板裂解物，优选转铁蛋白、胰岛素、肝素和血清合并物或血小板裂解物，更特别优选转铁蛋白、胰岛素、肝素和血小板裂解物。这些化合物优选以如上所述的浓度使用。
在一个优选的实施方式中，该培养基还包含il-3、scf和epo，优选为如上所述的浓度。
或者，所述培养基可包含scf和epo，优选为如上所述的浓度。
根据一个特定的实施方式，根据本发明的培养基的基质包含：
-转铁蛋白，优选人类转铁蛋白，其浓度为300μg/ml至350μg/ml；
-胰岛素，优选人类胰岛素，其浓度为5μg/ml至20μg/ml；
-肝素，优选人类肝素，其浓度为1u/ml至5u/ml，
以及任选地，
-il-3，优选人类il-3，其浓度为3ng/ml至7ng/ml；
-scf，优选人类scf，其浓度为50ng/ml至150ng/ml；和/或
-epo，优选人类epo，其浓度为1iu/ml至5iu/ml。
根据本发明的培养基包含添加到该基质中的(i)自噬诱导剂，优选smer-28，(ii)糖皮质激素，优选地塞米松，和任选地(iii)hif通路激活剂，优选dmog。
根据一个特定的实施方式，根据本发明的培养基包含添加到该基质中的：
-糖皮质激素，优选地塞米松，其浓度为0.001mm至10mm，优选0.002mm至1mm，更优选0.005mm至0.5mm，并且特别优选0.01mm至0.1mm；和
-自噬诱导剂，优选smer-28，其浓度为0.1μm至100μm，优选0.5μm至50μm，更优选1μm至30μm，并且特别优选2μm至30μm；和
-任选地，hif通路激活剂，优选dmog，其浓度为1μm至1000μm，优选10μm至500μm，更优选50μm至400μm，并且特别优选75μm至350μm。
在一个特定的实施方式中，根据本发明的培养基包含0.005mm至0.5mm的糖皮质激素，优选地塞米松，0.5μm至50μm的自噬诱导剂，优选smer-28，以及任选地50μm至400μm的hif通路激活剂，优选dmog。
在另一个特定的实施方式中，根据本发明的培养基包含0.01mm至0.1mm的糖皮质激素，优选地塞米松，2μm至30μm的自噬诱导剂，优选smer-28，以及任选地75μm至350μm的hif通路激活剂，优选dmog。
本发明还涉及如上所述的根据本发明的细胞培养基用于产生和/或扩增红系祖细胞和/或产生红细胞的用途，特别是根据上述本发明的方法，并且更尤其是用于刺激hsc分化为红系祖细胞和/或扩增红系祖细胞。
在另一方面，本发明进一步涉及一种试剂盒，其包括：
-根据本发明的细胞培养基；和/或
-根据本发明的遗传修饰的hsc或基因构建体，以获得根据本发明的遗传修饰的hsc；和
本发明还涉及根据本发明的试剂盒用于产生红系祖细胞和/或红细胞的用途，特别是根据上述本发明的方法。
尽管具有不同的含义，但是在本发明的整个说明书中，术语“包含”、“具有”、“含有”和“由……组成”可以彼此替换。
通过阅读以下说明性和非限制性实施例，本发明的其它特征和优点将更加清楚呈现。
实施例
实施例1：由源自脐带血和细胞单采术的hsc扩增红系祖细胞
材料和方法
使用的培养基：imdm(biochrom)，补充有转铁蛋白(330μg/ml)、胰岛素(10μg/ml)、5％ab血清合并物(efs)和肝素(3u/ml)。从第0天到第7天，向培养基中补充il-3(5ng/ml)、scf(100ng/ml)和epo(2iu/ml)。从第7天到成红细胞祖细胞扩增结束，向培养基中补充scf(100ng/ml)和epo(2iu/ml)。
hsc：
根据milenyi提供的方案(参见人类cd34microbeadkit，来自miltenyibiotec)，在使用cd34+珠的磁性分离后获得hsc。
细胞维持：
在第0天以10,000个细胞/毫升的浓度接种细胞，在第4天将细胞在新培养基中1/5稀释，在第7天洗涤细胞并在新培养基中以100,000个细胞/毫升培养。在第11天将细胞稀释至100,000个细胞/毫升并接种在新培养基中。在第14天将细胞以300,000个细胞/毫升重新接种在新培养基中。在第18天将细胞稀释至50万/毫升。从第21天起，在每个维持日(即每周两次)将细胞系统性地恢复至1百万/毫升。
培养方案：
方案1：从第0天到第11天，在基质培养基中培养细胞。在第11天向所用的培养基中补充253.9μmdmog。在第14天将333μmdmog、0.02mm地塞米松(dex)和30μmsmer28添加到所用的培养基中。在第18天向所用的培养基中补充0.09mmdex和20.1μmsmer28。在第21天，向所用的培养基中添加0.10mmdex和24.5μmsmer28，而在第25天向其中添加0.10mmdex和17.4μmsmer28。最后，从第28天起，向培养基中系统性地补充0.10mmdex和13.8μmsmer28。
方案2：从第0天到培养结束，向培养基中补充0.1mmdex和2.27μmsmer28。
方案3：从第0天到培养结束，向培养基中补充0.1mmdex。
方案4：该方案是对照方案；它是用不添加任何因子的基质培养基进行的。
流式细胞术：
根据供应商的说明，收集100,000个细胞样品，洗涤，然后使其暴露于cd235a和cd117抗体。在室温下和黑暗中30分钟后，将细胞用pbs洗涤两次。细胞然后准备用于细胞计数分析。
cd235a抗体特异性识别糖蛋白a，这表明成熟的红系细胞参与。
cd117抗体特异性识别受体c-kit(即干细胞因子受体)，该受体指示细胞的不成熟、株系和自我更新能力。
细胞计数：
在锥虫蓝溶液中将细胞稀释至十分之一，必要时可以评估细胞死亡率。
结果
表1：根据不同方案培养后的细胞计数
方案1和2允许成红细胞的指数扩增。用方案1和2获得的扩增也充分高于仅用地塞米松获得的扩增(参见表1)。此外有趣的是注意到，方案1和2允许从源自细胞单采术或脐带血的cd34+细胞扩增红系祖细胞。
这项研究表明，在根据本发明的培养基中培养人类造血干细胞可以获得：
-具有总红系参与的细胞；
-红系祖细胞的指数富集和扩增。
特别是，扩增可能持续长达78天。
实施例2：从源自细胞单采术的诱导型过表达htert、bmi1和组成型过表达bcl-xl或诱导型过表达htert、bmi1和lmo2的工程化hsc扩增红系祖细胞
hsc是在使用miltenyicd34+珠进行磁性分离后从细胞单采术获得的。
在第0天以100,000个细胞/毫升的浓度接种细胞，用于连续两次感染htertbmi1慢病毒上清液和bcl-xl逆转录病毒上清液或htertbmi1慢病毒上清液和lmo2慢病毒上清液；在第3天将细胞洗涤3次并以10,000个细胞/毫升的浓度重新接种，在第4天将细胞在新培养基中稀释至1/5。在第7天洗涤细胞并在新培养基中以100,000个细胞/毫升培养。在第11天将细胞稀释至100,000个细胞/毫升，并接种在新培养基中。在第14天将细胞在新培养基中重新接种至300,000个细胞/毫升。在第18天将细胞稀释至50万/毫升。从第21天起，每个维持日(即每周两次)将细胞系统性地重置为1百万/毫升。
方案1：从第0天到第11天，在基质培养基中培养细胞。在第11天向所用的培养基中补充253.9μmdmog。在第14天将333μmdmog、0.02mm地塞米松(dex)和30μmsmer28添加到所用的培养基中。在第18天向所用的培养基中补充0.09mmdex和20.1μmsmer28。在第21天向所用的培养基中添加0.10mmdex和24.5μmsmer28，而在第25天添加0.10mmdex和17.4μmsmer28。最后，从第28天起，向培养基中系统性地补充0.10mmdex和13.8μmsmer28。
表2：根据不同方案培养后第65天的细胞计数
方案1和2允许使用两种工程化hsc模型对成红细胞进行指数扩增(参见表2)。用方案1和2获得的扩增也显著高于单独使用地塞米松获得的扩增。
由于工程化细胞是从细胞单采法获得的cd34+，其以低扩增率而著称(与来自脐带血的cd34+相比)，因此这些扩增非常显著。
利用这些工程化细胞方案，与从脐带血获得的cd34+细胞相比，从细胞单采法获得的cd34+细胞获得更大的扩增能力。