保护动物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于RNA的治疗方法

本发明涉及抑制细菌中基因表达的方法，其在本文中称为抗菌基因沉默(antibacterialgenesilencing，ags)。在特定实施方案中，该方法用于通过小非编码rna以序列特异性的方式靶向致病性因子和/或必需基因来保护植物和动物防御病原细菌。该方法还可用于增强共生或共栖细菌的有益作用和/或生长。本发明涉及将小rna实体以rna提取物的形式、或包埋在植物细胞外小泡(ev)的形式外源递送到细菌上，用于减少细菌生长、存活和/或致病性。本发明还描述一种以快速、可靠和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性并且具有进步一开发为抗感染剂潜力的小rna的方法。此外，后一种方法有助于快速表征来自任何细菌物种的任何基因。

背景技术：

现有技术描述

植物免疫系统概述

转录后基因沉默(ptgs)控制宿主-病原体的相互作用

ptgs是一种保守的转录后基因调控机制，其已被广泛表征为通过靶向和降解病毒转录本而在植物中的天然抗病毒防御反应(8)。植物中rna沉默或rna干扰(rnai)的核心机制涉及rnaseiii酶dicer-like(dcl)蛋白对双链rna(dsrna)的识别和加工，从而导致产生20-25nt长的短干扰rna(sirna)双链体。这些sirna双链体与argonaute(ago)蛋白结合，后者是rna诱导的沉默复合物(risc)的主要组分。随后，在ago蛋白上的链分离形成一个成熟的risc，其由ago和单链rna(引导链)组成，而乘客链(passengerstrand)则被降解。引导小rna将ago-risc指导到序列互补的mrna靶标上，导致它们的内切核酸裂解和/或翻译抑制。在过去十年中，还发现几种内源性短干扰rna(sirna)和微小rna(mirna)来协调针对非病毒病原体的pti和eti反应(9)，这暗示ptgs在调节植物免疫系统中的关键作用。

在植物中，可移动的小rna可以触发邻近细胞以及远端组织中的非细胞自主沉默(10)。它们对于在感染之前启动抗病毒防御尤为重要(10)。非细胞自主沉默对于在植物细胞及与其相互作用的非病毒病原体、寄生性或共生性生物之间的沉默信号的转位也很关键，细菌除外，该方法尚未证明对细菌是靶向性的(11)。这种天然的跨界(cross-kingdom)调控机制最近在植物与真菌的相互作用中已经显著表征(12-17)。例如，发现特定植物mirna被输出到真菌病原体黄萎病菌(verticilliumdahliae)的菌丝中以触发毒力因子的沉默(14、17)。另一方面，内源性灰霉病菌(b.cinerea)小rna可以输出到植物细胞中，使植物防御基因沉默(16)，突出了植物和真菌病原体之间的双向跨界(bi-directionalcross-kingdom)的rnai。虽然对宿主细胞和真菌细胞之间小rna/dsrna转运的机制知之甚少，但在吸器外间质(extrahaustorialmatrix)中大量小泡的存在表明它们可能在两种生物之间传递沉默信号(18)。与此假说相一致的是，两项最新研究提供证据，证明植物细胞外小泡(ev)对于将抗真菌小rna递送到灰霉病菌细胞中以及将抗卵菌(anti-oomycete)小rna递送到辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)细胞中是必不可少的(17，19)。

可以利用跨界rnai提供对具有典型rna沉默机制的真核病原体的防御

higs/sigs技术的当前限制

一些作者推测，通过使细菌细胞与长dsrna接触，有可能影响细菌的生长。例如，wo2006/046148提出控制可摄取长dsrna片段(＞80个碱基对)的害虫(据推测其中包括细菌)的增殖。然而，wo2006/046148的发明人没有提供任何细菌对如此长的rna片段敏感的实验证据(他们的实施例仅公开dsrna对线虫的作用)。相反，本文的发明人证明细菌对长的dsrna不敏感，这表明wo2006/046148的发明人提出的假设在靶向原核细胞时无效。

技术实现要素：

发明目的

在本发明中，作者在此首次表明植物小rna可以通过序列特异性方式有效抑制细菌性植物病原体的基因表达，这种现象在本文中称为“抗菌基因沉默”(ags)。该调节机制特别显示在两种不同的革兰氏阴性致植物病细菌种中起作用，表明尽管存在包含复杂的双层膜结构(细菌内膜和外膜)的细胞壁，细菌细胞仍可以摄取植物的小rna。这是出人意料的结果，因为过去从未显示过植物小rna可以穿透细菌磷脂双层或在病原细菌细胞内被动或主动转运。此外，该现象不限于植物病原细菌，因为发明人还证明植物小rna可以在典型的革兰氏阴性人病原细菌中触发ags，点明本发明的广泛潜力。

然而，尽管存在所有这些偏见，发明人的发现表明，通过使细菌细胞与携带与一个或多个细菌靶基因具有序列同源性的小rna接触，实际上有可能直接沉默任何细菌基因，例如，毒力因子、必需基因或人工报告子基因。这些小rna可以由所述植物细胞稳定表达，以保护它们抵御一种或多种细菌病原体的侵害。或者，可以在将它们外源施用至将要遇到靶向的病原细菌的植物或动物组织表面或内部，从而减弱所述病原细菌的致病性和生长。因此，与迄今为止所认为的相反，小rna的定向沉默可用于有效地敲除植物和动物细菌病原体的基因表达，所述植物和动物细菌病原体不具有真核样rna沉默机制并且甚至具有双层膜。

细菌细胞对这种外源递送的小rna的出人意料的敏感性，可以有目的地用于抗菌应用，并且可以设想采用多种治疗来减少植物和动物细菌病原体的存活、致病性和/或生长。

最后，发明人采用一种基于体外的测定方法，以快速、可靠、和具有成本效益的方式鉴定具有抗菌活性的小rna。因此，预期本发明将被广泛用于(i)保护植物和动物防御细菌病原体，(ii)增强共生或共栖细菌的有益作用和/或生长，和(iii)表征在任何细菌物种中任何基因的功能。

发明的详细描述

概述

其还表明，在表达抗cfa6和抗hrplsirna的拟南芥转基因植物中观察到的毒力降低与ptodc3000中两个靶向毒力因子表达的特异性降低有关。发现这种体内抗菌基因沉默现象不仅对这些内源性胁迫反应性毒力基因有效，而且对在ptodc3000基因组中组成性表达的异源报告基因也有效。因此，这些发现突出表明，细菌细胞尽管缺乏典型的真核生物样rna沉默机制，但其实际上对植物编码的小rna的作用敏感。其还提供证据，证明植物中产生的人工小rna可以诱导细胞外细菌病原体中的基因沉默，表明这些小rna必需通过牵涉细胞外植物小rna的不同种群的机制从宿主细胞输出至细菌细胞(见下文)。

令人惊讶的是，不仅在遗传修饰的植物上观察到这种沉默效果，以便稳定表达与cfa6和hrpl基因具有同源性的小rna，而且在用含有抗cfa6和抗hrplsirna的总rna预处理、然后接种ptodc3000的wt植物上也观察到这种沉默效果。有趣的是，发明人还发现，针对ptodc3000或革兰氏阴性人病原细菌铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)的基因的体外合成的双链小rna也胜任ags。这些发现进一步支持这样的事实，即尽管存在双层膜，小rna仍可到达细菌的细胞质，并且尽管缺乏典型的真核样rnai机制，小rna仍可以在各种原核细胞中触发基因沉默。

另外，通过产生表达小rna的hrpl抗性版本的重组细菌，其在小rna靶向的区域中包含尽可能多的沉默突变(这些突变旨在改变小rna与hrplmrna的结合，但产生相同的蛋白质序列)，发明人表明沉默hrpl不再有效。此外，他们观察到，在外源应用含有有效抗hrpl小rna的总rna时，这种重组细菌的毒力不变。因此，这些发现提供令人信服的实验证据，表明针对hrpl基因的小rna对ags和细菌致病性的抑制均具有因果关系。

发明人继续进一步研究在响应外源性携带抗菌rna的总rna时，哪些rna实体负责观察到的ags现象。有趣的是，通过从表达靶向cfa6和hrpl基因的嵌合发夹的转基因植物中提取的总rna中分离出小rna和长rna物种，他们表明向植物外源递送小rna级分触发抗菌作用，而用长的rna级分处理是无效的。此外，发明人表明，来自ir-cfa6/hrpl参考品系的总rna提取物对触发ags或降低发病不够有效，该参考品系在dcl2、dcl3和dcl4基因中发生突变，因此抗cfa6和抗hrplsirna的生物合成受到损害。总的来说，这些发现提供令人信服的证据，即小rna而不是其长dsrna前体(除非它们在植物原位被加工成小rna)，是造成ags的rna实体。这与之前在秀丽隐杆线虫和植物食草动物中报告的专门依赖于长dsrna(30-36)、或与在真核丝状病原体灰霉病菌和禾谷镰刀菌中报告的由dsrna或sirna触发(15、21)的环境rnai有很大区别。

在以下结果中，发明人还研究在植物小rna向细菌细胞的运输中ev的可能作用。他们发现至少有两个具有抗菌活性的ev群体，其中一个是大尺寸，在抑制细菌发病机理中具有充分的活性，另一个是较小的ev，具有中等较少的活性。此外，他们表明，将这些抗菌小rna包埋在这些ev中保护抗菌小rna免于微球菌核酸酶(mnase)的消化，从而突出植物ev在田间条件下和基于rna的治疗学中未来疾病管理策略中的潜力。有趣的是，发明人还发现，不与蛋白质结合的非原质体ev游离的抗菌小rna，在抑制发病机理中也具有充分的活性。这些新颖的小rna种类在这里被称为细胞外游离小rna或“efsrna”，并且对mnase消化敏感。因此，发明人得出结论，ir-cfa6/hrpl转基因植物的非原质体由至少三个功能性抗菌小rna群体组成，其是包埋在大ev中、包埋在较小ev中或以游离形式存在。

基于所有这些发现，本发明人提出一种抑制细菌中至少一个基因表达的方法，所述方法包括：

i)向至少一个植物细胞引入至少一个特异性靶向至少一个细菌基因的功能性干扰rna分子(irna)，所述irna能够在携带一个或多个所述基因的细菌中诱导一个或多个所述基因的序列特异性沉默，或者

ii)在细菌感染之前和/或之后在植物或动物组织上递送小rna，例如，含有其的细胞外小泡或非原质体流体、或细胞外游离rna，或

iii)直接向细菌细胞上递送小rna，例如，含有其的细胞外小泡或非原质体流体、或细胞外游离rna。

在一个实施方案中，该方法允许通过在植物细胞中表达irna分子(sirna和mirna的前体)、ii)回收所述植物细胞的非原质体流体(apf)、iii)在动物组织上、动物(例如，器官、体液)内或细菌细胞上递送在所述apf中存在的小rna，来靶向一个或多个细菌基因。这种方法将在公共卫生、特别是在细菌感染管理中具有主要作用。

更准确地说，该技术将提供一种控制植物和动物中的细菌感染的方法，由于该方法基于序列的高选择性，因此其减少抗生素处理，而不会对有益细菌或环境产生负面影响。

此外，该策略将提供更加持久的抗病性，而一些常规处理并非如此。

最后，可以预期的是，本文描述的技术也将可用于控制来自有益细菌的基因的表达，以增强它们的增殖和/或对宿主动物的有益作用。

除这些优点之外，所提出的方法还具有成本效益并且相对易于工业化。实际上，设计和生产针对细菌基因的有效人工irna(例如，sirna)的方法，当从本氏烟草叶子中瞬时表达时仅需要几周，而在体外合成时甚至只需一天。此外，在出现抗sirna的细菌时，从头重新设计和生产人工irna相对容易。最后，有可能产生针对特定细菌种类、或针对广泛的病原细菌菌株的irna，从而根据所需的基于rna的治疗，提供靶向的或广谱的处理方法。

本方法/用途可以在体内或体外进行。“体外”在本文中是指要求保护的方法或用途的步骤是使用生物组分(例如，细菌细胞)来进行，所述生物组分已经从其通常的宿主生物(皮肤、粘膜、粪便等)中分离、或直接生长在体外介质中(在没有宿主生物的情况下)。当本发明的小rna直接与细菌细胞接触时就是这种情况。

“体内”或“植物原位(inplanta)”在本文中是指所要求保护的方法或用途的步骤是使用完整的生物(例如，完整的个体)进行。当本发明的小rna直接与含有在其周围的组织的细菌细胞接触，特别是触发细菌细胞内的毒力因子的沉默时，认为本发明的方法/用途在“半体内”测定中进行。

本发明小rna的有用前体

本发明涉及至少一种功能性干扰rna(irna)用于抑制细菌细胞中至少一个基因表达的用途。

如本文所用，术语“功能性干扰rna”(功能性irna)是指，能够诱导特别是细菌细胞中至少一个细菌基因序列特异性沉默过程的rna分子。特别地，所述功能性干扰rna分子可以是：i)小干扰rna，其在本领域中公知为小或短干扰rna(sirna)分子(单链体或双链体)、或其前体，或ii)微rna(mirna)分子(单链体或双链体)、或其前体。

本文中的术语“sirna的前体”或“sirna前体”是指可以在植物(或植物提取物)中直接或间接加工成sirna双链体的rna分子。可以直接加工的sirna前体的实例包括长双链rna(长dsrna)，而可以间接加工的sirna前体的实例包括长单链rna(长ssrna)，可以将其用作生产可加工的长dsrna的模板。

本文中的术语“mirna的前体”或“mirna前体”是指可在植物(或植物提取物)中加工成mirna双链体的rna分子。mirna前体的实例包括主要的mirna前体(pri-mirna)和pre-mirna，包含发夹环。

值得注意的是，编码所述前体分子的质粒、或载体、和其他dna构建体或病毒载体也包括在“功能性干扰irna”的定义中。

为靶向细菌中的多个基因，本发明的方法可以使用i)同时靶向多个目的细菌基因的几种不同irna的混合物，或者ii)靶向几种不同目的细菌基因的嵌合irna，或者iii)这些嵌合irna中的任意的混合物。

在一个特定的实施方案中，本发明的方法/用途包括将一个或几个功能性irna作为前体引入真核细胞(例如，植物细胞)中，以在植物原位产生小rna(例如，sirna或mirna)，所述小rna可以被进一步配制并用于防止细菌感染。

在一个更特定的实施方案中，本发明的功能性irna是长单链rna分子(此后称为“长ssrna”)。这样的长ssrna可以通过植物转基因产生，通过植物的rna依赖性rna聚合酶转化为长dsrna分子，并通过植物dcl蛋白进一步加工为sirna。或者，长ssrna可由植物rna病毒产生，并在病毒复制期间(作为复制中间体)和/或通过植物rna依赖性rna聚合酶的作用进一步转化为长dsrna分子。产生的病毒dsrna随后通过植物dcl蛋白加工成sirna，其随后通过称为病毒诱导的基因沉默(vigs)的方法触发序列特异性沉默(11)。

如本文所用，术语“长ssrna”表示包含至少50个碱基，更优选80至7000个碱基的单链的单链结构。当由植物转基因产生时，长ssrna可包含80至7000个碱基，但是当由植物重组rna病毒产生时，优选包含80至2000个碱基。

在一个更特定的实施方案中，本发明的功能性irna是长双链rna分子(以下称为“长dsrna”)，其作为sirna前体，并且可在植物原位由dcl蛋白和植物基因组编码的其他小rna生物发生因子加工成sirna。

如本文所用，术语“长dsrna”表示包含至少50个碱基对、更优选80-7000个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构。

在植物或植物细胞中，长dsrna可以加工成小的rna双链体。这样的长dsrna有利地是嵌合dsrna，即它们具有与多个细菌基因具有同源性的序列(参见下文)。

在一个实施方案中，本发明的功能性irna是长dsrna，其可被植物细胞中的dcl蛋白切割以产生sirna。

本发明的长dsrna可以由发夹结构通过以下产生：通过正义反义转录构建体、通过进一步由植物rna依赖性rna聚合酶用作底物的人工正义转录本构建体、或通过vigs产生。更精确地，它们可以包含凸起、环或摆动碱基对以调节dsrna分子的活性，从而介导细菌细胞中有效的rna干扰。本发明的长dsrna分子的互补正义和反义区可以借助于基于核酸或基于非核酸的接头连接。本发明的长dsrna还可包含一个双链体结构和一个环结构以形成对称或不对称的发夹二级结构。

因此，在一个实施方案中，本发明的功能性irna是包含发夹(例如，mirna前体)的、长的(至少50个碱基对、更优选80至400个碱基对、100至200个碱基对、125至175个碱基对、特别是约150个碱基对)dsrna。

如本申请的实施例所示，将dsrna引入植物真核细胞，通过小rna而不是长dsrna的作用，在细菌细胞中诱导细菌基因的序列特异性沉默(实施例6和图7)。这意味着细菌细胞仅在其与小rna实体直接接触时才对ags敏感。使细菌直接与小rna的前体(长dsrna)接触将不会有沉默作用，因为这些原核细胞不具有将其正确加工成功能性抗菌irna的典型的真核样rnai机制。

本发明的小rna

事实上，通过使其与尺寸小于50个碱基对的小rna种类接触，有可能在细菌细胞中直接抑制细菌基因的表达(图8和图10)。

因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的功能性irna是小rna，例如，sirna或mirna。这些小rna具有短的尺寸，其小于50个碱基对，优选地在15至30个碱基对之间，更优选地在19至27个碱基对之间，甚至更优选地在20至25个碱基对之间。

这些小rna可以配制成药物或美容组合物，例如，配制成局部组合物(topiccomposition)或可喷洒的液体组合物(见下文)。在这种情况下，可以将含有所述小rna的所述组合物直接施用于组织或细菌。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的功能性irna是“sirna”，其指“sirna双链体”或“sirna单链体”。

更具体地，术语“sirna双链体”指包含至少15个碱基对、优选至少19个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构或双链体分子；优选地，所述反义链包含与靶基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。这些sirna双链体可以由长dsrna前体通过植物dcl蛋白加工产生。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。它们具有小于50个碱基对的短尺寸，优选地在15至30个碱基对之间，更优选地在19至27个碱基对之间，甚至更优选地在20至25个碱基对之间。

以下实验部分(实施例9和图10)显示，当本发明的小rna在双链结构中时，它们是有效的。用体外从头合成的sirna双链体已经证明这一点，据认为，用植物提取物观察到的生物学作用至少部分是由于植物分泌的这些sirna双链体。

如本文所用，术语“sirna单链体”或“成熟sirna”指这样的单链体分子(也称为“单链”分子)：源自sirna双链体、但已在植物细胞的risc机制中成熟、并被装载进ago蛋白中和/或与其他rna结合蛋白结合。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。它们具有小于50个碱基的短的尺寸，优选地在15至30个碱基之间、更优选地在19至27个碱基之间、甚至更优选地在20至25个碱基之间。

在另一个实施方案中，本发明的功能性irna是“mirna”，其表示“mirna双链体”或“mirna单链体”。

更具体地，术语“mirna双链体”指包含至少15个碱基对、优选至少19个碱基对的第一(正义链)和第二(反义)链的双链结构或双链体分子；优选地，所述反义链包含与靶基因的转录本互补的至少15个连续核苷酸的区域。这些mirna双链体也可能含有凸起。这些mirna双链体可以由mirna前体通过植物dcl蛋白加工产生。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。至于双链体sirna，其具有小于50个碱基对的短的尺寸，优选地在15至30个碱基对之间、更优选地在19至27个碱基对之间、甚至更优选地在20至25个碱基对之间。

如本文所用，术语“mirna单链体”或“成熟mirna”指这样的单链体分子(也称为“单链”分子)：源自mirna双链体、但已在植物细胞的risc机制中成熟、并被装载进ago蛋白中和/或与其他rna结合蛋白结合。如以下所公开的，他们也可以从头化学合成。如单链体sirna，其具有小于50个碱基的短的尺寸，优选地在15和30个碱基之间、更优选地在19和27个碱基之间、甚至更优选地在20和25个碱基之间。

设计irna(例如，长dsrna/sirna/mirna)的方法在本领域中是可获得的，并且可用于获得具有这些性质的长dsrna、sirna和mirna的序列。

本发明人在本文中显示(实施例9，图10)，可能使用人工体外合成的双链sirna，以(i)抑制细菌基因表达，(ii)抑制细菌致病性，和(iii)在体外触发杀菌作用(参见图10)。

本发明包括合成、半合成或重组irna的用途，所述irna仅含有核糖核苷酸或既含有脱氧核糖核苷酸又含有核糖核苷酸。本发明还包括包含一个或多个修饰的修饰的irna分子的用途，所述修饰增加体内对核酸酶降解的抗性和/或改善细胞稳定性(例如，小rna3'末端甲基化、锁核酸(lna))、被细菌细胞摄取(例如，肽载体)或细菌细胞内的沉默效率。本发明的irna可以包括在糖、磷酸和/或碱基部分修饰的核苷酸，和/或5'或3'末端、或核苷酸间键的修饰。

本发明中定义的化学合成的dsrna分子可以由分别合成的两个不同的寡核苷酸组装而成。或者，可以使用可裂解的接头(例如，基于琥珀酰基的接头)串联合成rna双链体或rna前体分子的两条链。可选择的，可以从插入到本领域技术人员已知的和商业上可获得的dna或rna载体中的转录单元(体外或在植物原位)表达本发明的rna前体分子。值得注意的是，后一种方法可以包括转录表达长双链折回结构的转基因、通过位于转基因的每个部分且方向相反的启动子的正义反义转录本、mirna前体、初级mirna转录本、或正义转录本，其可在某些情况下(例如，被内源性或外源性22nt长mirna靶向)被植物rna依赖性rna聚合酶用作底物以生成dsrna。

本发明的irna分子，特别是本发明的小rna，在携带一个或多个所述基因的细菌中优选使一个或多个靶细菌基因的表达水平降低至少30％、优选降低至少60％、更优选降低至少80％。可以通过本领域熟知的方法在rna或蛋白质水平上评估一个或多个细菌基因的沉默，例如，通过实时定量rt-pcr(rt-qpcr)、northern印迹、facs、免疫组织学分析或western印迹分析。

在本发明的上下文中，通过人工irna分子对一个或多个细菌基因的沉默(可能是部分的或全部的)，应足以对细菌产生所想要的作用，例如，在生物中降低所述细菌的细菌致病性或传染性。

在优选的实施方案中，本发明的小rna具有15至30个碱基对的尺寸，并特异性抑制至少一个选自以下的细菌基因：pscc、pscj、pscn、virb1、vird4、tssm、tssj、tssb/tssc、tsse、vgrg、hcp、dotc、dotd、dotf、dotg和doth、luxs、luxl/luxr、aroa、lysc、cysh、galu、pbpa、pbpb、pbpc、pigma70、sigma54、arc、ptr、nor、mep、cme、tem、shv、ges、vim、ndm、ampc、vim-1、vim-2、vim-3、vim-5、case、oxa-28、oxa-14、oxa-19、oxa-145、per-1、tem-116、ges-9、ftsz、ftsa、ftsn、ftsk、ftsi、ftsw、zipa、zapa、tola、tolb、tolq、tolr、pal、mincd、mreb和mld。

靶细菌

在优选的实施方案中，所述靶细菌是人病原细菌。

可以使用本发明的用途/方法靶向的病原细菌的非限制性实例包括：

在一个特定的实施方案中，本发明的方法使用靶向有益细菌(例如，共生或共栖细菌)的一个或多个基因的功能性irna。该特定实施方案的目的是促进所述细菌的有益作用。在该特定实施方案中，靶细菌基因是这样的因子：其在沉默时促进靶细菌细胞的复制或促进对宿主有益以及正性调节有益化合物(例如，anhormone)、次级代谢产物的产生的途径，所述次级代谢产物(i)改变周围病原体或竞争者的存活/致病性，(ii)激活宿主防御反应(例如，抗微生物肽产生)，(iii)促进从环境中摄取养分(4)增强宿主生物对非生物胁迫条件等的耐受性等。因此，此类细菌靶基因的沉默将导致宿主生物的生长速率增加和/或宿主生物的若干其他可能的有益效果。

在这样的实施方案中，本发明的irna应当具有与有益细菌基因的序列同源性，但是与致病细菌基因组、宿主基因组、或宿主定植者和/或与以宿主生物为食的哺乳动物的其他基因组没有序列同源性。

可以用本发明的方法靶向的有益(共生或共栖)细菌的非限制性实例包括：

靶细菌基因

本发明的irna应与至少一个细菌基因具有足够的序列同源性，以诱导所述至少一个基因的序列特异性沉默。另外，为防止不希望的脱靶效应，本发明的dsrna、mirna或小rna种类与真核宿主基因组或有益细菌，宿主定植者和\或以宿主生物为食的哺乳动物的其他基因组的序列同源性应该几乎不存在(如果不是不存在)。

本发明的irna能够抑制至少一个细菌基因的表达。

在一个优选的实施方案中，所述至少一个细菌基因是细菌毒力因子或细菌的必需基因或抗生素抗性基因。

如本文所用，术语“细菌的必需基因”是指对于细菌细胞生存力必不可少的任何细菌基因。当前提是所有营养素均可获得时，这些基因是维持细菌存活绝对必需的。据认为，细菌必需基因的绝对需要的数量为约250-500。现在，通过使用转座子测序方法，从无关细菌中鉴定出这些必需基因变得相对容易。这些必需基因编码蛋白质以维持中央代谢、复制dna、确保适当的细胞分裂，将基因翻译成蛋白质维持基本的细胞结构、并介导进出细胞的转运过程(42)。gyrb、dnan或sece基因就是这种情况，发现它们的沉默损害体外铜绿假单胞菌的生长(图12)。

如本文所用，术语“毒力基因”是指已显示出对以下至少一种活性起关键作用的任何细菌基因：致病性、疾病发展、特定宿主组织或宿主细胞环境的定植等。尽管这些活性对于细菌在体外的存活不是必需的，所有这些活性有助于细菌在宿主中生长和/或促进宿主的疾病症状。

本发明的irna还可抑制抗生素抗性基因的表达，以使得细菌对所述抗生素处理敏感。

这些抗生素抗性基因是，例如：细菌外排泵基因(arc、ptr、nor、mep、cme型)、β内酰胺酶的四个分子类别的基因：a类(例如，tem、shv、ges型)、b类(例如，金属β内酰胺酶vim、ndm)、c类(例如，ampc型)、d类(oxa型)。抗生素抗性基因的非限制性实例包括：vim-1、vim-2、vim-3、vim-5、case、oxa-28、oxa-14、oxa-19、oxa-145、per-1、tem-116和ges-9，以及其他至关重要的基因，当这些基因在微生物中缺失或失活时导致细菌的死亡，这些列举在全面的抗生素抗性数据库2017(或card2017)(67)。这些靶基因还可编码细菌病原体的主要毒力决定因素，例如用于细菌分泌系统组装所需要的组分、细菌效应子/毒素的转录激活子、群体感应受体和来自其他所靶向的细菌病原体的特征明确的致病性因子。

在一个优选的实施方案中，所述毒力因子基因或细菌生存力基因或抗生素抗性基因因此选自：pscc、pscj、pscn、virb1、vird4、tssm、tssj、tssb/tssc、tsse、vgrg、hcp、dotc、dotd、dotf、dotg和doth、luxs、luxl/luxr、aroa、lysc、cysh、galu、pbpa、pbpb、pbpc、pigma70、sigma54、arc、ptr、nor、mep、cme、tem、shv、ges、vim、ndm、ampc、vim-1、vim-2、vim-3、vim-5、case、oxa-28、oxa-14、oxa-19、oxa-145、per-1、tem-116、ges-9、ftsz、ftsa、ftsn、ftsk、ftsi、ftsw、zipa、zapa、tola、tolb、tolq、tolr、pal、mincd、mreb、和mld。

在这些实施方案中，irna与细菌病原体种类的生存力或毒力基因的必需基因具有有利地序列同源性、但与共生细菌基因组没有序列同源性。该方法的这种有利的实施方案避免了对宿主中存在的共生细菌的附带作用。

本发明的irna有利地与来自靶细菌病原体种类的任何这些必需基因或毒力基因或抗生素抗性基因具有序列同源性。

如本文所用，术语“序列同源性”是指具有序列相似性，即核酸序列之间具有足够程度的同一性或对应性的序列。在本发明的上下文中，当至少约80％、或者至少约81％、或者至少约82％、或者至少约83％、或者至少约84％、或者至少约85％、或者至少约86％、或者至少约87％、或者至少约88％、或者至少约89％、或者至少约90％、或者至少约91％、或者至少约92％、或者至少约93％、或者至少约94％、或者至少约95％、或者至少约96％、或者至少约97％、或者至少约98％、或者至少约99％的核苷酸是相似时，两个核苷酸序列具有“序列同源性”。

相反，具有“无序列同源性”的核苷酸序列是具有小于约10％、或者小于约5％、或者小于2％的同一性程度的核苷酸序列。

优选地，通过使用needleman和wunsch的算法鉴定相似或同源的核苷酸序列。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用以下参数使用gap版本10获得的值：使用50的gap权重和3的长度权重以及nwsgapdna.cmp评分矩阵得出的核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用8的gap权重和2的长度权重以及blosum62评分矩阵得出的氨基酸序列的％同一性和％相似性；或其任何等效程序。“等效程序”意指任何序列比较程序，当与由gap10版本产生的相应比对进行比较时，该序列比较程序针对所讨论的任何两个序列产生具有相同核苷酸残基匹配和相同序列百分比同一性的比对。

值得注意的是，本发明的irna不抑制在真核细胞、或真菌、昆虫、害虫或其他感染植物的病原体中表达的基因。具体而言，本发明的irna不抑制具有细菌起源并插入其他基因组的致癌基因的表达。更精确地，本发明的irna不抑制根瘤农杆菌细菌的致癌基因iiam和ipt的表达。

嵌合沉默元件

为保护植物抵御由几种细菌病原体引起的疾病的侵害，本发明的方法有利地使用与多于一个细菌基因具有序列同源性的功能性irna(以下称为“嵌合irna”)。这些嵌合irna优选与至少两个、三个、四个或更多个细菌必需基因和/或毒力因子(例如，上述那些)具有同源性。

在一个优选的实施方案中，本发明的irna是嵌合irna，其抑制至少一个编码如上所定义的细菌细胞的毒力因子或必需基因的基因，以及至少一个编码已知对higs敏感的其他病原体或寄生物的毒力因子或必需基因的其他基因。它也可以是来自非细菌性病原体或植物寄生物的毒性次级代谢产物的生物合成所需的基因。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法使用：(i)一个或多个靶向在大量细菌病原体中保守的必需基因或毒力基因的广泛序列区域的irna，或(ii)一个或多个靶向来自无关细菌病原体的必需的基因或毒力因子的irna。该方法的这种特定实施方案赋予针对多种细菌病原体的广谱保护。本发明的irna有利地是如上所述的长dsrna、mirna和/或sirna。

在一个特定的实施方案中，本发明的方法还包括向植物引入一个或多个dsrna；其靶向非细菌的寄生物(诸如病毒、真菌、卵菌、昆虫或线虫)的一个或多个基因。在该实施方案中，irna针对寄生物的必需基因或毒力基因。靶向寄生物的基因的一个或多个irna有利地与靶向细菌基因的irna同时递送或共表达。在另一特定实施方案中，本发明的方法包括使细菌和靶向与细菌不同的寄生物(例如，病毒、真菌、卵菌、昆虫或线虫)的一个或多个基因的小rna接触。在该实施方案中，小rna针对寄生物的必需基因或毒力基因。有利地，将一个或多个靶向寄生物基因的小rna与靶向细菌基因的小rna同时递送或共表达。

这种方法对于同时预防或治疗由细菌病原体和其他寄生物导致的疾病有用。可以使用如上所述的与细菌以及其他病原体/寄生物基因具有序列同源性的嵌合irna、或irna分子的混合物(其中一些与细菌基因具有同源性、而另一些与来自其他病原体/寄生物的基因具有同源性)进行该方法。

用于产生本发明的小rna的载体

在一个优选的实施方案中，本发明的长rna和小rna是作为细胞外游离rna分子分离的，其分别直接用于生产植物细胞和靶细菌细胞上。

也可以使用无毒且可降解的层状双氢氧化物(ldh)粘土纳米片携带抗菌dsrna。它们已经被成功地用于递送抗病毒dsrna，并且发现可以提供至少20天的病毒防御(43)。

在另一个优选的实施方案中，本发明的长rna由重组dna构建体编码，所述重组dna构建体促进导入植物细胞和/或促进长rna在所述植物细胞中的表达。所述重组构建体可以是可商业上可获得的质粒或载体。优选地，其是如下所述的植物表达载体。

因此，在另一方面本发明还涉及植物重组dna载体(或“dna构建体”)或植物病毒载体，其包含编码至少一个抑制至少一个细菌基因表达的功能性干扰rna(irna)的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可在真核细胞中表达。

所述功能性irna如上文所定义，为短或长的dsrna、长的ssrna、sirna或mirna，优选地，所述功能性irna为长的dsrna、长的ssrna、sirna或mirna。

所述至少一个细菌基因优选是如上定义的必需或毒力细菌基因、或抗生素抗性基因。

在一个实施方案中，载体是dna载体。所述dna载体有利地包含转录单元，所述转录单元包含：转录起始区、转录终止区、和编码本发明的irna的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列以允许irna分子在真核细胞中表达的方式可操作地连接至所述起始和终止区。

在一个优选的实施方案中，所述真核细胞是能够表达大量irna的植物细胞，例如，非常适合农杆菌介导的瞬时转化的本氏烟草叶子。

本发明的dna载体可以编码本发明的irna分子的一条或两条链，或编码自身杂交成dsrna双链体的单个自身互补链。转录起始区域可能来自针对真核rna聚合酶ii或iii(polii或iii)的启动子，包括在植物细胞中有活性的病毒启动子，例如，camv35s启动子，因为这些启动子的转录本在植物生物的所有细胞中都高水平表达。适用于在植物细胞中表达异源基因的多种启动子是本领域可获得的。它们可以例如从植物病毒获得。它们包括组成型启动子，即，大多数环境条件下在大多数组织和细胞中均具有活性的启动子，以及仅在或主要在某些组织或某些细胞类型中具有活性的组织特异性或细胞特异性启动子，以及响应化学刺激而活化的可诱导启动子。另外，可在本发明中使用用于从细菌病原体保护植物的器官或组织特异性启动子包括，特别是，在与细菌病原体的进入和增殖有关的组织/细胞类型(例如，在hydathodes、防御细胞、木质部薄壁组织细胞、和毛状体基部周围的细胞)中有活性的启动子。

所述转录终止区优选被真核rna聚合酶识别，更优选被polii或poliii识别。例如，所述转录终止子可以是ttttt序列。

适于dsrna分子表达的大量dna载体是本领域技术人员已知的并且是商业上可获得的。合适载体的选择和在其中插入dna构建体的方法是众所周知的。能够稳定表达dsrna分子的重组载体可以转化进入植物原位，并在靶细胞中持续存在。载体的选择取决于预期的宿主和所述宿主的预期转化方法。

在一个实施方案中，载体是病毒载体，优选植物病毒载体。所述病毒载体优选选自各种植物rna病毒(例如，烟草花叶病毒、烟草拨浪鼓病毒、土豆x病毒、大麦条纹花叶病毒、番茄丛矮病毒)，其可用于植物细胞通过vigs产生大量小rna(11)。在此，病毒载体的选择还取决于预期的宿主和所述宿主的预期感染方法。

本发明还包含含有一个或多个标记基因的重组dna载体或病毒载体，其允许选择转化的宿主细胞。

在一个优选的实施方案中，本发明的dna或病毒载体包含编码如上所定义的两个、三个、或四个功能性干扰rna(irna)基因的多核苷酸序列，因此能够抑制两个、三个、或四个不同的细菌基因。技术人员可以通过常规方法鉴定irna的最佳组合。超过四个靶基因的组合也包括在本发明内。

本发明的dna载体可以通过本领域已知的常规方法制备。例如，它可以通过pcr或rt-pcr扩增核酸序列，通过与同源探针杂交筛选基因组dna文库，或通过全部或部分化学合成来产生。可以通过本领域已知的常规技术将重组载体引入宿主细胞。

本发明的体外抗菌方法和用途

在另一方面，本发明涉及抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的体外方法，所述方法包括使所述靶细菌细胞与本发明的一个或多个小rna或者包含其的组合物接触的步骤。对于在宿主细胞接触中被转录活化的毒力因子，将使用特定的培养基(例如，基本培养基)。

换句话说，本发明涉及小rna或包含小rna的组合物在体外用于抑制靶细菌细胞中至少一个基因表达的用途，其中所述靶细菌细胞与所述小rna或所述组合物直接接触。

优选地，所述小rna是单链或双链sirna、或单链或双链mirna双链体。更优选地，如果所述细菌细胞是致病性的，则所述小或长rna抑制至少一个编码毒力因子的基因或必需基因或抗生素抗性基因的表达，如果所述细菌细胞是有益的，或抑制至少一个编码生长抑制因子的基因或对于宿主有用的途径的负调节子的基因的表达。

优选地，所述组合物包含从生产者植物细胞获得的植物提取物，所述生产者植物细胞与对所述细菌细胞的至少一个基因具有特异性的至少一个长dsrna接触。更优选地，所述组合物包含从所述植物提取物回收的细胞外小泡、或所述植物提取物分泌的细胞外游离rna、来自所述植物提取物的非原质体流体、或与所述小rna复合的纳米颗粒。所述生产者植物细胞例如选自：烟草(例如，本氏烟草、红花烟草(nicotianatobaccum))；芋头(槟榔芋(colocasiaesculenta))；姜(zingiberofficinale)，拟南芥(例如，arabidopsisthaliana)；番茄(例如，栽培番茄(lycopersiconesculentum)或solanumlycopersicum)；土豆(solanumtuberosum)；水稻(oryzasativa)；玉米(zeamays)；大麦(hordeumvulgare)；小麦(例如，普通小麦(triticumaestivum)、硬质小麦(triticumdurum))、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橙树、苹果树、柑橘树、橄榄树等。

“抑制至少一个基因的表达”，在本文中是指所述基因的表达降低，即，靶序列的mrna或蛋白质水平在统计学上低于在暴露于靶向无关基因(例如真菌基因)的对照小rna的合适对照细菌中相同靶序列的mrna或蛋白质水平。特别地，降低根据本发明的细菌中靶基因的mrna多核苷酸水平和/或多肽水平，导致实现相较于合适的对照细菌中相同靶序列的mrna多核苷酸水平或由其编码的多肽水平，小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％的mrna多核苷酸水平或由其编码的多肽水平。测定rna转录本的表达水平、由靶基因编码的多肽的表达水平、或所述多核苷酸或多肽的活性的方法是本领域众所周知的。

在这方面，可以靶向任何类型的细菌。如上所述，可以靶向感染动物(包括人类)宿主的病原细菌、或为动物(包括人类)宿主提供有益作用的有益(例如，共栖的或共生的)细菌。

在一个实施方案中，该方法对于抑制或限制样本中的致病细菌的致病性和生长特别有意义。它也可用于杀死样本中的病原细菌细胞。

在另一个实施方案中，如上所述，该方法还可用于通过抑制直接或间接地负调节细菌生长的基因，来促进有益细菌的复制。

在另一个实施方案中，还可以通过靶向参与对所述抗生素化合物的细菌抗性的基因，来使用该方法来恢复细菌细胞对抗生素化合物的敏感性。

本发明的植物治疗方法和用途

根据本发明，通过使用上述用于表达核酸的标准方法将本发明的一个或多个irna引入植物细胞。在本领域中可获得的用于真核细胞遗传转化的多种方法可用于许多植物物种。作为非限制性实例，可以进行弹丸轰击、病毒介导的转化、农杆菌介导的转化等。不包括电穿孔。

在将核酸插入细胞中的上下文中的术语“引入”，指“转染”、或“转化”、或“转导”以及包括提及将核酸掺入到真核细胞中，其中所述核酸可以稳定的掺入到细胞基因组(例如，染色体、质粒)中、或瞬时表达(例如，通过根瘤农杆菌瞬时递送基因构建体)。

本发明的irna在宿主植物细胞中的表达可以是瞬时的或稳定的。稳定表达特别指使用常规技术制备转基因植物。

通过使用植物dicer-样酶和其他小rna加工因子将所述irna加工成sirna或mirna双链体。然后，将所述小rna双链体和/或成熟的小rna向导(即，载入ago中)转位至细胞外培养基中或植物细胞表面，在此它们可能会遇到细菌细胞。

如以下实施例(实施例4、和5和图4-6)所示，当在本发明的成熟irna分泌的条件下，当放置细菌细胞与本发明的植物细胞接触时，细菌细胞的生长和毒力降低。

在一个方面，本发明涉及一种用于处理靶植物抵抗细菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：向所述靶植物的至少一个细胞中引入特异性靶向毒力细菌基因、或必需细菌基因、或抗菌抗性基因的长dsrna分子。

该方法对于人和动物避免食用植物的污染特别有用。通过用本发明的处理来阻断存在于植物上的细菌的生长或存活，这将避免由于摄入污染的、受感染的植物而污染动物和人。

该方法对于预防植物被诸如志贺氏菌、沙门氏菌、李斯特菌、布鲁氏菌、大肠杆菌等病原性动物细菌感染特别有用，因此对于预防其消费者随后被感染也特别有用。

优选地，所述组合物包含从植物细胞获得的植物提取物，所述植物细胞表达对所述病原细菌的所述至少一个毒力或必需或抗生素抗性细菌基因具有特异性的至少一个长dsrna、或已经与至少一个该长dsrna接触。更优选地，所述组合物包含从所述植物提取物中回收的细胞外小泡，或由所述植物细胞分泌的细胞外游离小rna，或与小rna偶联的纳米颗粒。甚至更优选地，所述组合物是液体可喷洒组合物。

在这方面，细菌细胞最终直接与小rna(即，sirna或mirna)接触，在革兰氏阴性细菌的情况下，小rna能够穿过细菌的双层膜并到达细菌细胞的胞浆中，在这里将以序列特异性的方式沉默靶基因，从而导致细菌致病性的减弱(参见实施例5-7和图4-图6以及图9-图10)。

如本文所用，术语“小rna”指具有本发明的irna的抑制活性的小rna。具体而言，它们是与至少一个细菌基因，优选地与至少一个细菌毒力或必需基因，更优选地与至少一个以上引用的基因具有至少80％的序列同源性的sirna或mirna(双链体或单链体)。这些小rna通常包含不超过40个碱基对。优选地，它们包含18至30个碱基对，更优选地18至25个碱基对。更优选地，所述小rna特异性抑制以上定义的细菌必需或毒力基因中的至少一个。

优选地，如上所述，这些小rna是双链sirna。

本发明的另一方面涉及如上定义的至少一个irna或包含该irna的载体作为植物治疗剂的用途。优选地，所述irna或载体用于治疗由植物中致病细菌引起的疾病、或用于预防植物中的细菌感染。

在一个实施方案中，该植物治疗性irna是短或长的dsrna、sirna双链体、或mirna双链体、sirna单链体或mirna单链体，如上文所定义。在又一个实施方案中，irna靶向细菌基因和如上所定义的其他非细菌病原体或寄生物的基因，用于同时预防或治疗植物中细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的疾病。本文涵盖针对irna、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。

在由动物病原细菌引起的植物检疫技术问题的情况下，可以通过各种方式(例如通过喷洒)将所述小rna递送至植物组织。它们可以包埋在微球、纳米颗粒、脂质体、或天然外泌体中。优选的制剂在下面公开。

产生本发明的小rna的转基因植物

在下文中，将用本发明的irna转化并能够产生本发明的小rna的植物细胞称为“本发明的植物细胞”或“本发明的宿主细胞”。它们含有至少一个irna(优选长rna)或如上所定义的dna构建体或载体，所述irna含有至少一个特异性靶向细菌基因(例如，毒力、或必需细菌基因)的序列。

用编码长rna的转基因稳定转化的植物可以作为种子、生殖材料、增殖材料、或细胞培养材料提供，其不主动表达长rna但具有这样做的能力。

如果它们仅用于产生本发明的小rna，则可以将它们称为“生产者植物细胞”。如果它们将从产生的小rna赋予的抗菌作用中受益，它们也可以称为“靶植物”。两种类型的植物(生产者和靶植物)都是表达和产生本发明小rna的重组细胞。生产者植物可以是靶植物，如分泌本发明的小rna的植物可用于装饰/食物目的。

本文中的术语“植物”涵盖植物细胞、植物组织、植物部分、整株植物、其祖先及其后代。植物部分可以是植物的任何部分或器官，并且包括例如种子、果实、茎、叶子、枝、花、花药、根、块茎和叶柄。术语“植物”还涵盖悬浮培养物、胚胎、分生组织、区域、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。其指所有植物，包括蕨类和树木。

在另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达至少一个本发明的功能性irna的分离的植物细胞或转基因植物。其还涉及含有本发明的dna、或病毒载体的分离的植物细胞。所述植物细胞可以是通过用所述dna载体转化而获得的遗传修饰的细胞。

转化方法的实例是农杆菌介导的转化或鸟枪介导的转化。

本文涵盖以上针对植物细胞、irna、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。

在下面的实施例部分中公开产生这种转基因植物的方法。其包括以下步骤：

i)用表达本发明的至少一个功能性干扰rna的dna载体转化植物细胞，或

ii)用表达本发明的至少一个功能性干扰rna的植物病毒，优选植物rna病毒感染植物细胞，

“显著量”在本文中是指在如上所述的测试中已显示具有抗菌作用的量。该显著量优选可以包含10到30ng/μl的表达有效小rna的总rna。

特别地，所述转基因植物能够宿主诱导细菌的基因沉默，并且包含能够下调或抑制细菌的至少一个基因表达的可表达的irna，其中，所述植物表达成熟的小rna。如发明人所证明，所述小rna能够跨越或跨过靶细菌的双层膜传播。

在另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达本发明的成熟小rna的靶转基因植物。在一个实施方案中，所述靶转基因植物包含本发明的dna载体。在一个优选的实施方案中，所述靶植物是水稻、玉米、大麦、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、土豆、番茄、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芋头、烟草、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橙树、苹果树、柑橘树和橄榄树。本文涵盖针对irna、载体和转化技术提出的所有实施方案，并且不需要重复。

另一方面，本发明涉及稳定或瞬时表达本发明的irna的转基因植物。在一个实施方案中，所述转基因生产者植物包含本发明的dna载体。在一个优选的实施方案中，所述生产者植物是：烟草(例如本氏烟草(nicotianabenthamiana)、红花烟草(nicotianatobaccum))；芋头(槟榔芋(colocasiaesculenta))；姜(zingiberofficinale)、拟南芥(例如，arabidopsisthaliana)；番茄(例如，栽培番茄(lycopersiconesculentum)或solanumlycopersicum)；土豆(solanumtuberosum)；水稻(oryzasativa)；玉米(zeamays)；大麦(hordeumvulgare)；小麦(例如，普通小麦(triticumaestivum)、硬质小麦(triticumdurum))、棉籽、棉花、豆、香蕉/车前草、高粱、豌豆、甘薯、大豆、卷心菜、木薯、洋葱、甜瓜、燕麦、花生、向日葵、棕榈油、黑麦、柑橘、小麦、胡椒、山药、橄榄、葡萄、芝麻、甘蔗、甜菜、豌豆和咖啡、橙树、苹果树、柑橘树、橄榄树等。优选的生产者植物是烟草、芋头和姜。

本发明的益生菌方法和用途

在另一个方面，如上所述，该方法还可用于通过抑制直接或间接地负调节细菌生长的基因，来促进有益(共生)细菌的复制。

因此，本发明涉及小rna，其具有15至30碱基对的长度并且特异性抑制至少一个细菌基因的表达，以用于促进有益共生的或共栖的细菌在需要其的受试者中的有益效果，其中所述小rna通过口服、局部或全身地施用至受试者。

优选地，所述有益共生的或共栖的细菌选自以下：奈氏放线菌、殊异韦荣菌、普氏栖粪杆菌、肠杆菌、多形拟杆菌、大肠杆菌k12、双歧杆菌(长、双歧、青春、齿、短、嗜热)、迟缓埃格瑟拉菌、拟杆菌属(解木聚糖、多型、脆弱、普通、盐藻)、狄氏副拟杆菌、普氏栖粪杆菌、瘤胃球菌(布鲁米、champanellensis、sr1/5)、链球菌属(副血、嗜酸、嗜热、猪、化脓、咽峡炎)、乳球菌属(乳酸、格氏)、肠球菌(粪、屎、卡塞尔、durans、海氏)、蜂房蜜蜂球菌、嗜盐四球菌、乳杆菌属(干酪、鲁米尼、德尔布吕克、布氏、罗伊特氏、发酵、戊糖、淀粉、唾液)、片球菌(戊糖、克劳森氏)、明串珠菌(肠膜、乳酸、肉质、明胶、柠檬)、魏斯氏菌(泰国、朝鲜)、酒类酒球菌、类芽孢杆菌属(土地、多粘、胶质、y412mc10)、堆肥嗜热芽孢杆菌、短芽孢杆菌、芽孢杆菌(解淀粉、枯草，地衣、萎缩、韦氏、蜡样、苏云金、凝结、巨大、硒化)、热脱氮芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、盐芽孢杆菌、李斯特菌属、链霉菌属、真细菌(直肠、挑剔、惰性)、化糖梭状芽胞杆菌、和产丁酸的细菌(ss3/4和ssc/2)。

使用本发明的irna恢复抗生素敏感性

在另一方面，发明人建议使用该方法，通过靶向参与细菌对抗生素化合物抗性的基因，用于恢复细菌细胞对所述抗生素化合物的敏感性。

优选地，然后靶细菌选自以下：

以色列放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、包柔氏菌属(伯氏、伽氏、埃氏、回归热、麝鼩、达氏、赫氏等)、布鲁氏菌属(牛、犬、马耳他、猪)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎、沙眼)、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌属(肉毒杆菌、艰难、产气荚膜、破伤风杆菌)、白喉杆菌、埃立克体菌属(犬、查菲)、肠球菌(粪、屎)、大肠杆菌o157：h7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯军团菌、钩端螺旋体属、单细胞李斯特菌、分枝杆菌属(麻风、结核)、肺炎支原体、奈瑟氏菌(淋病、脑膜炎)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星状诺卡菌、立克次氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒、鼠伤寒)、志贺氏菌属(猪痢疾、痢疾)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮、腐生)、链球菌属(龙舌兰、变形、肺炎、化脓、绿色)、福赛斯坦纳菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌等。

待用的植物小rna的量通常取决于所靶向细菌的数量和所靶向细菌的类型。该量可以为10至30ng/μl含有有效小rna的总rna。

本发明的治疗方法

在另一方面，本发明涉及用于治疗动物抵御细菌感染的基于rna的治疗方法，所述方法包括在细菌感染之前和/或之后，在动物组织之上(或之内)递送小rna(从头合成或从植物提取物纯化)、或植物提取物的步骤，所述植物提取物包含这种小rna或含有这些小rna的组合物(例如，从稳定或瞬时表达这些小rna实体的植物细胞或组织提取的总rna、来自所述植物细胞的细胞外小泡、来自所述植物细胞的非原质体流体、来自所述植物的细胞外游离小rna、或与所述小rna偶联的纳米颗粒)。

优选地，所述动物是以下属：智人(homosapiens)、家犬(canislupus)、家猫(feliscatus)、家马(equuscaballus)、普通牛(bostaurus)、绵羊(ovisaries)、家山羊(caprahircus)、野猪(susscrofa)、原鸡(gallusgallus)、火鸡(meleagrisgallopavo)、灰雁(anseranser)、绿头鸭(anasplatyrhynchos)、穴兔(oryctolaguscuniculus)。其可以是有益细菌寄宿的健康动物，或已经感染病原细菌的患病动物。

更优选地，所述动物是人类。

其可以是有益细菌寄宿的健康人，或已经感染病原细菌的患病人。

在这方面，细菌细胞直接与小rna(即，sirna或mirna)接触，在革兰氏-阴性细菌的情况下，小rna能够穿过细菌的双层膜并到达细菌细胞的胞质中，在这里将以序列特异性的方式沉默靶基因，从而导致细菌致病性的减弱。

如本文所用，术语“小rna”指携带本发明的irna的抑制活性的小rna。具体而言，它们是与至少一个细菌基因，优选地与至少一个细菌毒力或必需基因，更优选地与至少一个以上引用的基因具有至少80％的序列同源性的sirna或mirna(双链体或单链体)。这些小rna通常包含不超过40个碱基对。优选地，它们包含18至25个碱基对。更优选地，所述小rna特异性抑制以上定义的细菌必需或毒力基因中的至少一个。

本发明的处理方法包括口服、局部和全身施用本发明的小rna。也可考虑鼻内和静脉施用。

本发明的另一方面涉及如上定义的至少一个小rna作为美容或治疗剂的用途。优选地，所述小rna用于治疗由病原细菌引起的疾病、或用于预防细菌感染。

在一个实施方案中，该小rna靶向细菌基因和如上所定义的其他非细菌病原体或寄生物的基因，用于同时预防或治疗细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的疾病。本文上涵盖以上针对irna、载体和转化方法提出的所有实施方案，并且不需要重复。

本发明的另一方面涉及如上定义的至少一个小rna、或含有其的治疗组合物(如上公开)，用于制备旨在治疗由病原细菌引起的疾病、或预防细菌感染的药物的用途。

在一个实施方案中，当小rna靶向细菌基因和如上所定义的其他非细菌病原体或寄生物的基因时，所述药物可同时治疗或预防细菌病原体和其他病原体/寄生物引起的疾病。

本发明还包含治疗或美容方法，其包括使用如上定义的有效量的小rna。

在这些治疗/美容方法中，本发明的小rna可以配制成液体溶液、喷雾剂、丸剂、霜剂、或粉末。

本发明的小rna还可以有利地偶联/结合/融合至已知在体内有效地传递小rna的纳米颗粒。任何纳米颗粒介导的sirna全身递送都可用于治疗动物(包括人)，只要其毒性是受控的或不存在毒性。如(44)中所述，已经提出了许多系统，并已用于临床试验。

如(44)中所公开的，为了将本发明的小rna全身递送到动物中，还可以将其与纳米颗粒系统偶联。如(44)中的表3所示，这些可以是尺寸在50nm至500nm之间的基于硅或基于金属或基于碳的纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、环糊精、基于脂质的纳米颗粒、脂质体、水凝胶或半导体纳米晶体。如该综述所述，所有这些递送系统已被证明可以在体内有效转移sirna。

在本文中优选脂质纳米颗粒，因为脂质纳米颗粒最近已被fda批准用于人类治疗。

本发明的治疗组合物

在公共卫生的情况下，本发明的小rna或包含其的组合物可以通过各种方式(口服、局部、全身等)递送至动物组织。在一个特定的实施方案中，它们可以被包埋在微球、脂质体或天然ev中，以从有害试剂中对其进行保护。它们也可以与纳米颗粒偶联。它们也可以作为裸露的irna分子直接掺入组合物中。

因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的小rna作为活性组分的治疗组合物。特别地，本发明涉及包含显著量的sirna或mirna的治疗组合物，所述sirna或mirna抑制至少一个细菌基因的表达，优选抑制一个必需基因或一个毒力细菌基因或一个抗生素抗性细菌基因的表达。

如上述充分公开，本发明的治疗组合物中包含的小rna可以是合成的、或者是可以从稳定或瞬时表达所述小rna的植物、植物组织或植物细胞中获得的。

特别地，被本发明的dna载体稳定或瞬时转化、或被本发明的病毒载体感染的植物、植物组织或植物细胞将产生小rna。

因此，本发明的治疗组合物可以包含稳定或瞬时表达目的小rna的植物、植物组织或植物细胞的总rna、或包含总rna的纯化的小rna级分、或从头合成的小rna。

“显著量”在本文中是指，如以下实施例中所述的，在测试中已显示具有抗菌效果的量。该量优选地为10至30ng/μl表达有效小rna的总rna。

本发明的沉默元件可以被添加在外部组合物(例如，喷雾剂、或霜剂或丸剂)中。

优选地，如下文所公开的，其包埋在微球、脂质体或天然外泌体中，以从有害试剂中对其进行保护或与纳米颗粒偶联。

本发明的治疗组合物还可包含含有活性抗菌小rna的细胞(例如，粗植物细胞提取物)。还涵盖包含细胞提取物的混合物的组合物，一些细胞提取物来自表达至少一个本发明的irna的植物细胞的。在其他实施方案中，本发明的治疗组合物不包含任何细胞。

在一个实施方案中，将本发明的组合物外部施用于动物组织(即，通过将组合物喷雾在所述组织上或通过在所述组织上施加洗剂、凝胶剂、霜剂)，以保护个体防御细菌感染。

本发明的组合物可以施加在可以与细菌接触的任何组织上。该组织优选地选自：皮肤、毛发、粘膜、指甲、肠、伤口、眼睛等。

可以将本发明的治疗组合物配制在合适的和/或环境可接受的载体中。这样的载体可以是待处理个体可以耐受的任何材料。此外，载体必须是在控制细菌感染时仍然使组合物有效的材料。这样的载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、右旋葡萄糖或其他糖溶液、汉克氏溶液和其他水性生理平衡的盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和tris缓冲液。

这些组合物还可包含表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、进料刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线保护剂、缓冲剂、流动剂等。它也可包含其他活性成分，例如杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或杀螨剂。这些试剂可以与制剂领域中惯用的载体、表面活性剂或佐剂或其他组分组合，以促进产物的处理和应用。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如，天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、或粘合剂。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物是液体可喷雾的组合物。然后，可以很容易地将其施用到纸巾或衣服上、或者可以与病原细菌接触的任何材料上，作为预防措施或摆脱细菌感染的处理方法。它也可以很容易地被吸入，以预防鼻腔获得性感染。

在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物被配制成易于被动物和人类吞咽的丸剂。

在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物被配制成霜剂、洗剂或凝胶剂，可以方便地施加在皮肤或毛发组织上。

更一般地，可以在美容产品中添加本发明的小rna(或包含其的ev)以防止细菌感染的发生。

在另一优选的实施方案中，将本发明的组合物配制成丸剂，例如，缓慢释放的丸剂，其可以方便地被吞咽以作用于肠粘膜或其他内部组织。

包含本发明小rna的细胞外小泡

在一个优选的实施方案中，本发明的小rna或其前体被包含在其将得到保护以抵御rna酶作用的天然细胞外小泡(ev)中或人工小泡中。事实上，这些小泡对于处理的动物(特别是人)是非毒性的并且有效保护其中所含的小rna。

现在已经发表许多研究，强调ev在将小rna递送到植物真核病原体中重要的保护作用(17、19)。

本文的本发明人表明，从植物向细菌递送小rna，也至少部分地通过转基因植物分泌的ev发生(图9b)。

因此，本发明的组合物优选包含已经由本发明的转基因植物分泌的ev，其包含本发明的成熟小rna。

ev具有不同的尺寸直径(45、46)。它们包含源自亲本细胞的胞质和膜蛋白(45-48)。它们还包含功能性mrna、长非编码rna、mirna前体以及成熟的mirna和sirna(17、19、49、50)。

ev的纯化可通过多种方法进行，最常见和最优选的方法是差速超速离心(45、46)。

更特别地，有可能通过如先前所述的过滤和差速离心步骤从植物细胞中获得ev(45，46)。简而言之，将用于收集非原质体洗涤流体的经典缓冲液(例如，ph6mes缓冲液)对叶子进行真空浸润，然后进一步低速离心(46)。如最近所述(46)，进一步成功收集、过滤和离心非原质体洗涤流体。可以从非原质体流体中以40,000g的离心速度从拟南芥中回收大约50到300nm尺寸的植物ev群体(中位数在150nm)(46)。拟南芥中约10-20nm尺寸范围的较小ev也可以通过以下方法回收：通过以40,000g的离心速度从非原质体流体中进行差速超速离心，然后在上一步获得的上清液中以100,000g的速度进行另一次离心(46)。也可以使用专用柱(例如，amiconultra-15centrifugalfiltersultracel30k)浓缩植物ev，并将其重新悬浮在专用缓冲液中，以便随后将其用于细菌细胞孵育(体外测定)或在细菌感染之前或之后进行外源施用于植物表面(植物原位测定)。

含有ev游离小rna的非原质体流体

本发明的组合物还可包含由本发明的转基因植物分泌的、与蛋白质不结合的非原质体ev游离小rna。这些小rna种类在此处称为细胞外游离小rna或“efsrna”。

这些小rna种类可通过从以下回收获得：从涉及以100,000g的离心速度进行的非原质体流体的差速超速离心所得的上清液，或从以40,000g、接着以100,000g离心速度进行的非原质体流体的差速超速离心的上清液。

所得上清液可在专用缓冲液中混合，或直接用于与细菌细胞孵育(体外测定)，或在细菌感染之前或之后外源施用于植物表面(在植物原位测定中)。

这些ev级分有利地以冷冻形式、或以冷冻干燥、或冻干粉末形式保存或提供，在这些形式中它们保持其高功能性。

本发明的组合产品

本发明的组合物可以与其他化合物同时或连续施用。

特别地，本发明的组合物可以与抗生素化合物一起施用，特别是当它们携带的irna靶向抗生素抗性基因时。

在这种情况下，本发明的组合物可以作为“组分试剂盒”提供，其在分开的容器中包含本发明的沉默元件(上文定义的小rna)和相应的杀菌化合物。

因此，在另一方面，本发明涉及一种药物试剂盒，其包含：

a)小干扰rna(sirna)，其具有15至30个碱基对的长度、并且特异性抑制抗生素抗性基因，或含有其的治疗组合物，如上所公开的，以及

b)抗生素化合物。

本发明还涉及这种药物试剂盒在需要其的受试者中治疗和/或预防细菌感染的用途以及使用该药物试剂盒的治疗方法。

在另一方面，本发明涉及组合产品，其包含：

a)小干扰rna(sirna或mirna)，其具有15至30个碱基对的长度、并且特异性抑制抗生素抗性基因，或含有其的治疗组合物，如上所公开的，以及

b)抗生素化合物，

同时、分开或交错用于在需要其的受试者中预防和/或治疗细菌感染的用途。

在一个优选的实施方案中，所述sirna或mirna在所述抗生素化合物之前施用，优选在一周之前，更优选在一天之前。

在这些试剂盒和产物中，所述抗生素抗性基因优选选自：vim-1、vim-2、vim-3、vim-5、case、oxa-28、oxa-14、oxa-19、oxa-145、per-1、tem-116和ges-9。

优选地，所述受试者是以下属的动物：智人、家犬、家猫、家马、普通牛、绵羊、家山羊、野猪、原鸡、火鸡、灰雁、绿头鸭、穴兔。其可以是有益细菌宿主的健康动物，或已经感染病原细菌的患病动物。

本发明的筛选系统

在一个特定的实施方案中，本发明的方法还可以用作实验研究的工具，特别是在功能基因组学领域。事实上，使用小分子rna下调细菌基因可以用于以类似于线虫类蠕虫秀丽隐杆线虫(c.elegans)以及黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)领域中描述的类似方法来研究基因功能。这种方法对于不能在体外培养的细菌特别有用。

基于靶向特定细菌基因的下调或上调(导致可测量的表型)的测定，为鉴定抗菌剂提供了新的工具。

发明人确实已经进一步开发了在植物原位测定之前鉴定具有抗菌活性的候选小rna的测定法(对于实验者而言，植物原位测定更为耗时)。如图8c/d所示，该系统可依赖于使用成熟的农杆菌介导的烟草叶子瞬时转化的小rna的瞬时表达。随后可以将相应的候选sirna与细菌细胞一起孵育(在细菌细胞附近存在植物组织/提取物的情况下，或在体外培养基中，例如，模拟宿主环境的基本培养基，已知其触发毒力因子的表达)。

在另一方面，本发明涉及允许快速、可靠和成本有效地鉴定具有抗菌活性的功能性irna的体外筛选方法，所述方法包括以下步骤：

a)在植物细胞中表达至少一个长dsrna，其同源sirna抑制至少一个细菌基因，

b)使所述植物细胞与裂解缓冲液接触，

c)将所述植物细胞裂解物或其rna提取物与细菌细胞一起孵育，以及

d)评估所述细菌细胞的生存力、生长、代谢活性。

通过评估所述细菌细胞的报告子(例如，细菌复制、一般胁迫反应、细胞分裂等的报告子)的表达/活性、代谢活性(例如，常用于监测细菌呼吸活性、氧化还原平衡指标和生存力的荧光标记刃天青的外源递送)、生长(例如，染色体整合的或由质粒编码的组成型启动子驱动的荧光报告子的表达)、小rna靶向的基因的表达(例如，rt-qpcr分析、蛋白质印迹分析，与小rna靶向的靶向基因或基因区域融合的报告基因的表达)进行步骤d)。

如上所述，可以使用抗菌小rna的稳定或瞬时表达。对于瞬时表达，所述植物细胞优选是烟草叶子细胞，其可以通过农杆菌介导的瞬时转化用外源构建体容易且有效地转化。上文提出的用于产生irna、载体、宿主细胞、靶向基因、细菌的所有实施方案和转化技术均包含在本文中，并且不需要重复。

在步骤b)中，也可能使用含有分泌的分子和ev(与有效小rna结合)的植物细胞的非原质体流体来接触细菌细胞。可以通过本领域技术人员通常使用的任何常规方式，例如真空渗透和离心来回收非原质体流体。根据制造商的说明，也可以使用专用色谱柱(例如，amiconultra-15centrifugalfiltersultracel30k)进一步进行ev的浓缩。

预期将来将使用该筛选系统选择、并最终产生有效的抗菌小rna，其可以掺入治疗组合物或试剂中。

本发明人还开发了系统，其与植物产生小rna无关而是使用靶向细菌基因的双链小rna的快速体外合成(图10)。作为概念验证实验，发明人已经证明，体外合成的抗cfa6和抗hrplsirna触发细菌基因沉默以及抑制ptodc3000诱导的气孔重新打开，其程度与源自ir-cfa6/hrpl转基因植物的总rna相同(图10b/c，图6a)。此外，他们已经表明，体外合成的针对ptodc3000fusa和gyrb基因的sirna具有强的杀菌作用，从而在体外条件下阻止ptodc3000的生长(图10d/e)。此外，使用相同方法，他们显示体外合成的针对铜绿假单孢菌sece、gyrb和dnan基因的sirna也触发铜绿假单孢菌在体外条件下生长的降低(图12)。

因此，他们推荐一种鉴定影响人病原细菌细胞增殖的候选基因的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)生成抑制至少一个细菌基因表达的小rna，

b)将所述小rna与细菌细胞一起孵育，以及

c)如上所公开，评估所述细菌细胞的生存力、生长、代谢活性。

特别地，本发明涉及一种鉴定参与细菌抗生素抗性的候选基因的体外方法，所述方法包括以下步骤：

a)将细菌细胞与小rna一起孵育的，所述小rna具有15至30个碱基对的长度并且特异性抑制至少一个细菌基因，b)将所述小rna处理的细菌细胞与抗生素化合物一起孵育，

c)评估在所述抗生素化合物存在时，所述小rna处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性，并且将其与所述抗生素化合物不存在时所述小rna处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性进行比较。

在优选的实施方案中，在抗生素化合物存在时，如果所述小rna处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性低于在抗生素化合物不存在时所述小rna处理的细菌细胞的生存力、生长、代谢活性时，则认为所述候选基因参与细菌抗生素抗性。

除上述布置之外，本发明还包括其他布置，其将从以下参照本发明主题的示例性实施方案的描述中、并参考附图和序列表而出现，其中：

表1：在实施例中使用的工具的序列详情

附图说明

图1.在未经处理和细菌攻击条件下表达反向重复序列ir-cfa6/hrpl的拟南芥转基因植物的表型和分子表征

a.ptodc3000基因cfa6和hrpl的示意图。cfa6(1-250nt)和hrpl(99-348nt)基因的250bp区域用于在组成型35s启动子的控制下产生嵌合发夹结构。

b.五周龄的col-0植物和表达35spro:ir-cyp51(对照载体：cv)或35spro:ir-cfa6/hrpl构建体的独立纯合转基因植物的代表性图片。

c.通过b中描绘拟南芥植物的低分子量northern印迹分析检测到的抗cfa6和抗hrplsirna的积累水平。u6用作上样对照。

d.与col-0和cv感染的植物相比，在ir-cfa6/hrpl感染的植物上，ptodc3000hrplmrna的积累显著降低。用ptodc3000wt菌株浸入接种(dip-inoculate)图b中描述的拟南芥植物，并在感染后(dpi)3天，通过定量rt-pcr分析监测proc、cfa6和hrpl的细菌转录水平。相对于细菌gyra转录本的水平，定量这些mrna水平。误差棒表示在三个独立实验中获得的mrna值的标准偏差。使用anova检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01，***：p值<0.001)。

图2.在未经处理和细菌攻击条件下表达反向重复序列ir-luxa/luxb的拟南芥转基因植物的表型和分子表征

a.插入ptodc3000wt基因组的luxcdabe操纵子的示意图。luxa(1-250nt)和luxb(1-250nt)基因的250bp区域用于在组成型35s启动子的控制下产生嵌合发夹结构。

b.通过拟南芥转基因植物的低分子量northern印迹分析检测到的抗luxa/luxb的积累水平。u6用作上样对照。

c.与col-0相比，感染后在表达ir-luxa/luxb的转基因品系中观察到对ptodc3000荧光素酶(ptoluc)发光的显著影响。ir-luxa/luxb#18和#20的两个独立的转基因品系、以及col-0分别以106cfu/ml浓度的ptoluc进行注射浸润，并在浸润后24小时测量发光。

d.与col-0植物相比，ir-luxa/luxb转基因植物中ptodc3000的植物原位生长未改变。将来自图c使用的植物的叶盘研磨并以系列稀释液铺板，以计数感染后24小时每种条件的ptoluc。

图3.表达ir-cfa6/hrpl构建体的拟南芥转基因植物抑制ptodc3000诱导的气孔重新打开

a.ptoδcfa6和δhrpl菌株(而不是δhrcc菌株)的气孔重新打开能力受损，在添加外源cor后可以拯救这些表型。将col-0植物的未去皮叶子切片与模拟溶液(水)、或ptodc3000wt、δcfa6、δhrpl、或δhrcc菌株孵育3小时。通过使用imagej软件测量宽度和长度来评估气孔孔径。

b.ptodc3000wt不再诱导过表达ir-cfa6/hrpl发夹的拟南芥转基因品系中的气孔重新打开。如a中所述，在用ptowt菌株感染的col-0和35spro:ir-cfa6/hrpl#4、#5、#10转基因品系中进行气孔孔径测量。

c.与col-0植物相比，cv中ptodc3000诱导的气孔重新打开反应没有改变。如a中所述，在感染ptowt菌株的col-0和cv植物中进行气孔孔径测量。

注意：对于所有这些实验，n＝每个条件下分析的气孔数量，并使用anova检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。

图4.表达ir-cfa6/hrpl构建体的拟南芥转基因植物在成年叶子中表现出降低的ptodc3000的维管传播和生长

a.与col-0和cv感染的植物相比，ir-cfa6/hrpl#4、#5和#10感染的植物表现出ptowt的维管传播减少。将植物用ptowt-gfp通过伤口接种在中脉中，并将col-0用ptoδcfa6-gfp进行伤口接种。在紫外线下观察gfp荧光信号，并在感染后3天(dpi)拍摄照片。为指示细菌从接种部位的传播，在紫外光下观察gfp荧光。当细菌从三个接种位点的任何一个传播出去时，它被指示(index)为传播，其中4个对应于最高的传播指数。考虑来自三个生物学重复的图片。

b.描绘在a中所用条件的被感染叶子的代表性图片。白色圆圈指示叶子中脉中的伤口接种位点。

c.与col-0和cv感染的植物相比，ir-cfa6/hrpl#4、#5和#10转基因品系显示出显著降低的ptowt滴度。将col-0、cv和ir-cfa6/hrpl#4、#5和#10植物用ptowt浸入接种，并将col-0植物用ptoδcfa6-gfp菌株浸入接种。在感染后2天(dpi)监测细菌滴度。考虑来自每种条件下的三个植物和来自三个独立实验(n)的四个叶子，用于比较分析。

d.与col-0和cv植物相比，ir-cfa6/hrpl#4、#5和#10转基因植物的浸水症状减轻。浸入接种后24小时拍摄有代表性的浸水症状叶子照片。

注意：对于上述所有实验，使用双向anova检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；*：p值<0.05；**：p值<0.01；***：p值<0.001；****：p值<0.0001)。

图5.在未经处理和芸苔黄单孢菌芸苔致病变种攻击条件下表达反向重复序列ir-hrpg/hrpx/rsma的拟南芥转基因植物的表型表征

a.与col-0感染的植物相比，ir-hrpg/hrpx/rsma#1-和#6感染的植物表现出降低的毒力xccδxopac(gus/gfp)菌株的维管传播。将植物用xccδxopac(gus/gfp)在中脉中伤口接种，od＝0.01。在紫外线下观察到gfp荧光信号，并在感染后3天(dpi)拍摄照片。如4a中所述完成指示。

b.描绘在b中所用条件的被感染叶子的代表性图片。白色圆圈指示叶子中脉中的伤口接种位点。

图6.当将来自ir-cfa6/hrpl转基因植物的外源递送的总rna施加至野生型拟南芥和番茄叶子的表面时，降低ptodc3000的致病性。

b.与cv植物相比，外源施加ir-cfa6/hrpl植物的总rna提取物后，ptowt重新打开气孔的能力发生改变。将col-0叶子用水处理1小时，或用从cv或ir-cfa6/hrpl#4植物中提取的20ng/μl总rna处理1小时，然后与ptowt孵育3小时。如图3a所示，测量并分析气孔孔径。

c.用ir-cfa6/hrpl处理而不是cv处理，与用cv总rna预处理相比，总rna损害ptodc3000在叶子的非原质体中增殖的能力。将col-0叶子用来自cv或ir-cfa6/hrpl#4植物的20ng/μl的总rna处理1小时，然后用ptowt浸入接种。在2dpi监测细菌滴度。叶子数(n)对应于三个独立实验的集合值。

d.与用ir-cfa6/hrpl#4总rna处理的叶子相比，用cv总rna处理的叶子表现出更多的坏死症状。实验与在c中一样进行，但是使用5周龄的番茄(solanumlycopersicummoneymaker)植物。描绘在两个条件下被感染叶子的代表性图片。

e.与cv植物相比，用ir-cfa6/hrpl#4的总rna提取物处理的番茄叶子中观察到的ptodc3000-gfp基因座数量减少。在紫外线下在3dpi时观察感染的叶子，以估计gfp基因座的数量。在左边：点图代表使用imagej软件从每种条件的3-4张不同叶子中以及每片叶子至少有4张图片分析的gfp基因座数量。用于分析的值来自两个不同的独立实验。进行学生t检验以进行比较分析。在右边：在d中描述的番茄叶子的代表性图片。

f.与cv植物相比，用ir-cfa6/hrpl#4的总rna提取物处理的番茄叶子中ptowt-gfpdna含量降低。使用番茄泛素作为对照，通过qpcr分析细菌dna含量的水平。进行学生t检验以进行比较分析。

注意：对于a，b和c，使用anova检验评估统计学上显著差异(ns：p值>0.05；**：p值<0.01，***：p值<0.001)。

图7.负责ags和抑制气孔重新打开的rna实体是dcl依赖性抗菌sirna，而不是相应的未加工的dsrna前体。

a.上图：通过rt-qpcr进行col-0、dcl2-1dcl3-1dcl4-2(dcl234)、ir-cfa6/hrpl#4(#4)和dcl234突变体背景中(#4×dcl234)ir-cfa6/hrpl#4中的ir-cfa6/hrpl转录本的积累水平。泛素用作对照。该图代表三个独立实验的平均值和标准偏差。下图：抗cfa6和抗hrplsirna的积累水平通过相同基因型的低分子量的northern印迹分析进行。u6用作上样对照。

b.来自#4xdcl234植物的总rna提取物不会改变cfa6和hrpl的转录本积累水平。将ptowt细胞与从a中描述的相同基因型提取的20ng/μl总rna一起体外孵育8小时。使用gyra作为对照，通过rt-qpcr分析评估cfa6和hrpl转录本的积累水平。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。使用anova检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01)。

c.来自#4xdcl234植物的总rna提取物不能抑制ptodc3000诱导的气孔重新打开反应。将col-0叶子用水处理1小时或使用20ng/μl来与a.中使用的那些相同基因型的总rna提取物处理1小时，然后与ptowt孵育3小时。如图2a所示，测量并分析气孔孔径。补充图4b给出另外两个生物学复制。

d.上图：电泳图谱表示使用配备rnanano芯片的安捷伦bioanalyzer2100测定的来自ir-cfa6/hrpl#4植物的总rna、长rna和小rna的rna尺寸分布。每个样本均包括低分子量rna级分。突出显示18s和25s核糖体峰。下图：溴化乙锭染色的在a中使用的总rna、长rna和小rna的琼脂糖凝胶图片。

e.来自ir-cfa6/hrpl植物的小rna种类、而不是相应的长rna种类，抑制气孔重新打开的程度与总rna提取物相同。如在d中所述进行实验，但使用总rna级分、长(>200nt)rna级分、或小(<200nt)rna级分，其分离自ir-cfa6/hrpl#4植物的总rna。

注意：对于所有气孔实验，使用anova检验评估统计学显著性(ns：p值>0.05；****：p值<0.0001)。

图8.细菌表达的hrpl小rna弹性(resilient)形式对由抗hrplsirna指导的基因沉默是难治的，并且通过外源施加抗hrplsirna时表现出正常的气孔重新打开表型

a.分别在组成性启动子nptii的控制下，用编码wthrpl或突变hrpl的质粒转化后产生的ptoδhrpl菌株以及互补菌株的示意图。

b.体外ags分析显示，ptoδhrplwthrpl菌株对抗菌rna敏感，而ptoδhrpl突变体hrpl对这些rna实体是难治性的。将细菌ptoδhrplwthrpl和ptoδhrpl突变体hrpl菌株与来自cv或ir-cfa6/hrpl#4植物中提取的总rna孵育8小时。通过rt-qpcr分析wthrpl和突变体hrpl转录本的积累水平(mrna水平相对于gyra转录本水平)。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。使用anova检验评估统计学上的显著差异(ns：p值>0.05；*：p值<0.05，**：p值<0.01)。

c.通过使用瞬时表达35spro：ir-hrpl、35spro：ir-cfa6/hrpl的本氏烟草植物和未转化的本氏烟草叶子(nb)的总rna提取物通过低分子量northern分析评估抗cfa6和抗hrplsirna的积累。u6用作上样对照。

d.ptoδhrpl突变体hrpl菌株对抗hrplsirna作用是难治性的。用仅仅从本氏烟草中提取的总rna、或从表达反向重复序列ir-hrpl的本氏烟草提取的总rna处理col-0叶子。如前所述评估气孔重新打开反应。

图9.ir-cfa6/hrpl植物的非原质体流体由功能性抗菌sirna组成，这些功能性抗菌sirna可以包埋在ev中以抵御微球菌核酸酶的作用、或呈对微球菌核酸酶消化敏感的游离形式

a.与源自ir-cfa6/hrpl植物中的总rna相比，外源施加非原质体流体(apf)提取物后，ptowt重新打开气孔的能力也以相似的水平被改变。从cv植物中提取的总rna和apf用作阴性对照。将col-0叶子用水处理1小时(模拟)，或使用从cv或ir-cfa6/hrpl#4植物中提取的20ng/μl总rna或500μl的apf处理1小时，然后与ptowt孵育3小时。如之前实验所述，测量并分析气孔孔径。

b.两种不同的小泡级分p40和p100，以及上清液(sn)中存在的游离rna群体携带抗菌sirna，因此参与ags中。从cv和ir-cfa6/hrpl#4植物中提取的非原质体流体在40,000g下进行超速离心以沉淀较大的ev(p40)群体，余下的上清液在100,000g下进一步超速离心以沉淀较小的ev(p100)。sn也已恢复。将col-0叶子用水(模拟)、或从cv或ir-cfa6/hrpl#4植物中提取的p40、p100和sn处理1小时，然后与ptowt孵育3小时。#4的p40、p100和sn用20单位的mnase处理，#4的sn也用20单位的蛋白酶k处理。如先前实验所述，对气孔孔径进行测量和分析。

图10.外源递送体外合成的抗菌sirna降低ptodc3000的致病性和活力

a.描绘了体外合成的长dsrna和rnaseiii消化的sirna(对应于ir-cyp51和ir-cfa6/hrpl)的溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶。

b.外源施加体外合成的对应于ir-cfa6/hrpl的sirna而不是长dsrna改变ptowt重新打开气孔的能力。来自ir-cyp51的长dsrna和sirna被用作阴性对照。将col-0叶子用水(模拟)处理1小时，或用a中所述的rna处理1小时，然后与ptowt孵育3小时。如之前实验所述，测量并分析气孔孔径。

c.在体外ags测定中，使用体外合成的来自ir-cfa6/hrpl的sirna触发cfa6和hrpl基因的沉默。将ptowt细胞与来自ir-cyp51或ir-cfa6/hrpl#4植物的2ng/μl体外合成的sirna体外孵育8小时。通过rt-qpcr观察到细菌转录本cfa6和hrpl的显著减少，而proc和rpob转录本的积累未受影响。gyra用作内部对照来量化细菌转录本的积累。误差棒指示来自三个独立实验值的标准偏差。

d.和e.体外合成的针对ptodc3000的fusa或gyrb的sirna对ptodc3000-gfp菌株的生长具有显著影响。通过体外转录，然后rnaseiii消化合成针对ptodc3000的sece、gyrb和fusa基因的sirna。将ptodc3000-gfp菌株与指定浓度的体外合成sirna孵育。将96孔板放置在机器上，以通过基于液滴的微流体系统(millidrop)将样本分级成液滴。对于每个孔，形成各约500nl的10个液滴，并在仪器内部孵育。对于每个液滴，每约30分钟获取生物质和gfp荧光的测量值。

c.与a中相同，但区别在于将带有lux标签的pak菌株与水(模拟)或者浓度为20ng/μl的特异性总rna一起孵育，所述总rna提取自本氏烟草未转化的叶子(nb)或瞬时表达ir-gf/fg的本氏烟草叶子(阴性对照)、瞬时表达ir-dnaa/dnan/gyrb(it13)的本氏烟草叶子、或瞬时表达ir-rpoc/sece/sodb(it14)的本氏烟草叶子。

d.与b相同，但样品为c中描绘的样品。

注意：使用anova检验评估b和c的统计学显著性(ns：p值>0.05；**：p值<0.001)。

图12.体外合成的针对sece的sirna触发了铜绿假单孢菌pao1菌株在体外条件下的生长降低

具体实施方式

实施例

实施例1：材料和方法

携带反向重复序列构建体的转基因品系的产生

植物材料和生长条件

细菌菌株

表达gfp的ptodc3000-gfp和ptodc3000δcfa6-gfp(ptodc3118)菌株是s.y.he博士的礼物。而ptodc3000δhrpl菌株是cayoramos博士的礼物。ptodc3000荧光素酶菌株是chrislamb博士的礼物。通过电穿孔使用与ptodc3000-gfp中相同的质粒转化ptodc3000δhrpl和ptodc3000δhrcc菌株，来产生表达gfp报告基因的ptodc3000δhrpl和ptodc3000δhrcc菌株，然后在28℃接种于nygb培养基(5g/l细菌蛋白胨、3g/l酵母提取物、20ml/l甘油)，其中含有庆大霉素(1μg/ml)用于选择。使用质粒nptiipro:wt-hrpl和nptiipro:mut-hrpl通过电穿孔分别转化ptodc3000δhrpl菌株，以产生ptodc3000-wt-hrpl和-mut-hrpl菌株，然后将其接种在含有庆大霉素的nygb培养基中。铜绿假单孢菌的pak和pao1菌株是来自其他合作实验室。

rna凝胶印迹分析

为进行低分子量rna的northern印迹分析，使用trizol试剂提取总rna，并用50％甲酰胺稳定。如前所述(51)，使用特定条件下约30μg的总rna进行northern印迹分析。使用基因特异性引物从质粒中扩增出150bp至300bp的区域，并将扩增子进一步用于生成通过随机引物合成的特异性32p放射性标记的探针。u6探针用作小rna同等上样的对照。

分离长rna和小rna级分

植物中的细菌感染测定

(a)细菌生长测定：用于该实验的植物特别用于在生长区室中夜间周期开始三个小时后。在每种条件下，用5x107cfu/ml的细菌使用0.02％silwetl-77(lehle种子)将三个植物进行浸入接种。将经过细菌浸入的植物立即置于高湿度的区室内，以促进适当的感染。在感染后24小时观察到浸入接种后的浸水症状，对每种条件下来自三个植物的叶子进行拍照。接种后两天，按照(51)所述的方法对每种感染叶子的每种条件下的细菌滴度进行测量。为量化感染植物中的细菌转录本，在接种后三天收集合并的感染的叶子样本。

(b)伤口接种测定：为监测细菌在中脉中的增殖，用浸入5x106cfu/ml浓度带gfp标签的细菌的牙签手动接种来自每种条件的三个植物的约15片叶子，然后将植物置于高湿度的区室中3天。然后，通过使用olympusmv10×宏观变焦在紫外光下监测gfp信号来分析细菌增殖，并使用带有gfp滤片的ccd相机axiocammrczeiss拍摄照片。

(c)植物保护测定：在细菌感染之前，通过反复用模拟溶液或浓度为20ng/μl的特定总rna的rna溶液(二者均补充有silwettl-77(0.02％))反复浸泡，单独处理每种条件下三种拟南芥植物的四片莲座叶。预处理一小时后，以与rna相似的方式，将叶子浸润接种到5x107cfu/ml浓度的ptodc3000wt或ptodc3000δcfa6。如前所述，接种后两天监测细菌滴度。在番茄中，每种条件下三个植物的两片叶子用含有20ng/μl的特定总rna的悬浮液(补充有silwettl-77(0.02％))预处理，然后在1个小时后浸入到5x107cfu/ml的带有gfp标签的ptodc3000中。然后，将植物置于24℃/19℃(白天/夜晚)具有16小时光照周期中无盖情况下持续3天的可控条件中。然后，通过使用olympusmv10x宏观变焦在紫外光下监测gfp信号来分析细菌感染，并拍摄照片。收集单个叶子样本以使用imagej软件定量每种条件下的细菌数量。

体外合成dsrna和srna

按照rnai试剂盒(lifetechnologies,carlsbad,ca)的指导进行rna的体外合成。通过pcr扩增类似的模板，在序列的5'和3'端引入t7启动子。在两个不同的退火温度下分两步进行pcr扩增，以提高引物退火的特异性。扩增步骤后，借助凝胶和pcrclean-up试剂盒(macherey-nagel)，通过凝胶提取纯化pcr产物，以消除任何干扰(parasite)扩增。然后，将这些纯化的pcr产物用作体外转录的模板：2μg与2μl的t7聚合酶(t7酶mix)、2μl的10xt7反应缓冲液和75mmatp、ctp、gtp和utp各2μl一起在37℃下孵育五小时。用无核酸酶的水将总体积调节至20μl。转录反应后，用2μl的dnasei、2μlrnase、5μl10x反应缓冲液处理dsrna，以去除dna模板和单链rna。然后，用试剂盒提供的滤芯纯化dsrna。在此步骤中获得的长dsrna可用于以下实验。通过rnaseiii(neb,ipswich,ma)获得sirna。dsrna用rnaseiii消化20分钟，然后借助mirvanatmmirna分离试剂盒(lifetechnologies,carlsbad,ca)进行纯化。纯化后，将sirna用于以下实验。在该方法的每个步骤之后，进行凝胶电泳(tae1x，1％琼脂糖凝胶用于dna扩增以及2％琼脂糖凝胶用于rna)以检查rna的质量。

细菌发光定量

番茄感染定量

(a)gfp基因座定量：通过使用olympusmv10x宏观变焦在紫外光下对ptodc3000-gfp菌株感染的番茄叶子进行gfp定量，并使用带有gfp滤片的ccd相机axiocammrczeiss拍摄照片。使用imagej软件对每种条件下至少10张图片定量gfp基因座的数量。

(b)细菌基因组dna定量

为量化在感染的番茄植物中的细菌感染(ross等人，2006)，相对于植物gdna，测量细菌基因组dna(gdna)的量。根据制造商的说明，使用dneasyplantmini试剂盒(qiagen，德国)从感染ptodc3000-gfp的番茄叶子样本中分离基因组dna。使用1ng的gdna，使用takyonsybrgreensupermix和gfp基因特异性引物进行qpcr。使用泛素特异性引物将细菌gdna的量相对于番茄进行标准化。

本氏烟草中农杆菌介导的反向重复序列的瞬时表达

为产生单个发夹(ir-cfa6和ir-hrpl)以及嵌合发夹(ir-cfa6/hrpl)，将携带质粒的根瘤农杆菌菌株在lb培养基中于28℃过夜生长。通过离心收集细胞，并以0.5od600的最终密度将其重悬于含有10mmmes、ph5.6、10mmmgcl2和200μm乙酰丁香酮的溶液中。将培养物在室温下于黑暗中孵育5-6小时，然后在四周龄的本氏烟草中进行农杆菌介导的浸润。浸润3天后，收获叶组织并进行northern印迹分析以确认抗cfa6和hrplsirna的产生。然后，将叶子样本用于总rna提取。

体外抗菌基因沉默测定

为评估细菌转录本cfa6和hrpl是否可以直接被发夹ir-cfa6/hrpl所生成的dsrna和/或sirna靶向，使用在六孔板中的cv或ir-cfa6/hrpl#4转基因植物提取的20ng/μl的特定总rna分别处理107cfu/ml的ptodc3000wt、ptodc3000-wt-hrpl和ptodc3000-mut-hrpl的2ml培养物4小时和/或8小时。同样地，为定量细菌基因经体外合成的sirna处理的沉默，在6孔板中，分别使用2ng/μl的体外合成的ir-cyp51sirna或ir-cfa6/hrplsirna处理2ml的107cfu/ml的ptodc3000-gfp6小时。针对每种情况收集细菌，然后进一步处理以进行分子分析。

非原质体流体(af)和细胞外小泡(ev)提取

如先前所述(46)进行提取。用无针头的注射器用小泡分离缓冲液(vesicleisolationbuffer)(vib；20mmmes，2mm324cacl2、0.01mnacl，ph6.0)浸润5周龄cv或ir-cfa6/hrpl植物的60片叶子。然后将叶子置于20ml无针头的注射器中。然后将注射器置于50mlfalcon中，并以900g离心15分钟。收集非原质体流体(apf)，然后分别以2,000g和10,000g离心30分钟以除去任何细胞碎片，然后通过0.45μm的过滤器。将apf进一步以40,000g进行超速离心步骤以沉淀ev级分(p40)。将沉淀重悬于2ml的ph＝7.5的20μmtris缓冲液中。然后，将上清液以100,000g进行超速离心步骤以沉淀ev级分(p100)。恢复来自该步骤的上清液(sn)。

气孔孔径测量

在进行任何处理之前，将植物在光照下(100μe/m2/s)保持至少3小时以确保气孔完全膨胀。切片来自三四周龄植物的完整叶子切片，并将其浸入浓度为108cfu/ml的水(模拟)或细菌悬浮液中。处理3小时后，在sp5激光扫描共聚焦显微镜下观察未剥皮的叶子远轴表面，并从不同区域拍摄照片。使用imagej软件测量在每种情况下的30-70个气孔的气孔孔径(宽度/长度)。在进行rna预处理的情况下，将叶子切片与从特定基因型提取的总rna一起孵育一小时，然后再与细菌孵育。在特定实验中需要时，向细菌悬浮液中补充1μm的外源性冠菌素(cor)(sigma)(52)。

实时rt-pcr分析

为监测植物编码的转录本，使用rneasyplantmini试剂盒(qiagen)从植物样本中提取总rna。使用qscriptcdnasupermix(quantabiosciences)反转录0.5μg的无dna的rna。然后，使用takyonsybrgreensupermix和转录本特异性引物通过实时pcr反应扩增cdna。将表达针对泛素进行标准化。为监测细菌转录本，如前所述，从细菌感染的植物样本或体外处理的细菌中提取总rna。在dnase处理之后，使用随机六聚体引物和qscriptflexcdna试剂盒(quantabiosciences)反转录250ng的总rna。然后，使用takyonsybrgreensupermix和转录本特异性引物通过实时pcr反应扩增cdna。将表达针对gyra进行标准化。在384孔光学反应板中进行pcr，该板在95℃加热10分钟，然后在95℃变性15s，在60℃退火20s，并在72℃延伸40s，45循环。在扩增结束时以1℃的梯级(从95℃至50℃)进行熔解曲线。

基于液滴的微流体测定法，用于监测体外ptodc3000-gfp或铜绿假单孢菌pao的生长

实施例2.针对ptodc3000的内源毒力因子或人工报告基因的拟南芥编码sirna在细菌感染的情况下触发其沉默

由于已知hrpl和cfa6毒力因子的表达受多种环境因素的调节(54、55)，因此我们还测试ags是否可以有效地针对在ptodc3000中在组成型卡那霉素启动子下以染色体表达的发光杆菌(photorhabdusluminescens)luxcdabe操纵子(56)。这种带lux标签的ptodc3000菌株自发发射光，因为它共表达萤光素酶催化组分luxa和luxb基因以及底物生产所需的基因(即，luxc、luxd和luxe)(57)。选择两个独立的过表达抗-luxa和抗-luxbsirna的拟南芥转基因品系，ir-luxa/luxb品系，并用带有lux-标签的ptodc3000菌株进行注射浸润(图2a/b)。在接种后24小时(hpi)进一步监测luxa和luxbmrna的水平以及发光活性。通过这样做，我们发现与col-0感染的植物相比，luxa和luxbmrna的丰度以及发光活性在ir-luxa/luxb-中均显著降低(图2c)。相比之下，在那些条件下，与col-0植物相比，ir-luxa/luxb品系中细菌报告菌株的生长没有改变(图2d)，这表明上述作用并非由于这些转基因植物中细菌滴度的降低而引起的。总而言之，这些数据表明，ags有效针对ptodc3000感染过程中的内源性胁迫反应的细菌基因和外源性组成型细菌报告基因。

实施例3.针对cfa6和hrpl的宿主编码的sirna通过抑制冠菌素的生物合成来防止ptodc3000诱导的气孔重新打开

实施例4.表达针对来自ptodc3000或芸苔黄单孢菌芸苔变种的关键毒力因子的小rna的拟南芥稳定转基因植物受到保护免于细菌感染

接下来，我们研究针对cfa6和hrpl的sirna的稳定表达是否会在植物原位影响ptodc3000的生长，该表型已知既依赖于cor也依赖于功能性iii型分泌系统(54)。为此，我们用ptodc3000浸入接种ir-cfa6/hrpl、ir-cyp51和wt植物，并进一步在48hpi时监测细菌滴度。使用此测定法，我们发现与col-0感染植物相比，三个独立的ir-cfa6/hrpl转基因品系中ptodc3000滴度显著降低，并且该表型让人联想到在感染cfa6缺失菌株的wt植物中观察到的表型(图4c)。有趣的是，我们还观察到在24hpi时，与wt感染植物相比，三个独立的ir-cfa6/hrpl植物中ptodc3000诱导的水浸疾病症状减轻，类似于在用cfa6突变菌株浸入接种的wt叶子中观察到的表型(图4d)。相比之下，用ptodc3000浸入接种ir-cyp51转基因植物中细菌生长和水浸疾病症状没有改变(图4c/d)，这表明上述作用是针对cfa6和hrpl基因的sirna特异性的。总之，这些数据进一步支持在感染背景中，抗cfa6和抗hrplsirna在减弱ptodc3000的毒力活性方面的主要作用。他们还提供令人信服的证据，证明ags是可用于控制稳定转基因植物中细菌致病性的有效策略。

实施例6.小rna种类而不是其dsrna前体是外源施加源自ir-cfa6/hrpl发夹的总rna时观察到的气孔重新打开表型受损的原因

实施例7.细菌表达的hrpl的小rna弹性(resilient)形式对sirna定向沉默不敏感，并表现出正常的气孔重新打开表型，表明抗hrplsirna是ags和发病机理的降低的原因

实施例8.ir-cfa6/hrpl植物的非原质体流体由功能性抗菌sirna组成，这些功能性抗菌sirna可以包埋在ev中以抵御微球菌核酸酶的作用、或呈对微球菌核酸酶消化敏感的游离形式

实施例9.小rna的体外合成是一种简便、快速且可靠的方法以筛选具有抗菌活性的候选小rna。

实施例10植物小rna和体外合成的小rna可以在铜绿假单孢菌中触发ags，该调节方法用于通过靶向该细菌的一些必需基因来降低该细菌生长。

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序列表

<110>国家科学研究中心(cnrs)

国家健康科学研究所(inserm)

巴黎高等师范学院(ens)

<120>保护植物防御病原细菌和/或促进共生和共栖细菌的有益作用的基于rna的生物防治方法

<130>b376495d30812

<150>ep18306124.1

<151>2018-08-17

<160>249

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>500

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>用于同时靶向ptodc3000的hrpl和cfa6基因的hrpl/cfa6dsrna的第一臂的序列

<400>1

atgaacaagcgctacggcaacaacttgccgggatcctgttgcgcgctgagcaaccggatc60

gactggacgtcaccttcgcgcagcacgccatctggcaaaaaggccgccgttaatcgtttc120

caatatttctgcaggagtctgcccgtgaccaccttcaccgtgcccctgattctgtcggat180

gcaagccccacggcactcgccgctaccgcgcaacgtctgcgcgccgagcacgagacgcgc240

tccttcgccgctgatgactgacatcaccgtgcccttccagctcggaatgcacttcgtctt300

cccagctttcctgatacggctgacgatacattttgcggaagtgattgcggatcaggttca360

gcgcgatgccacacagccaggtctgcggtttgctggcatgttgaaacttgtgctcgttac420

gcagggcttcaagaaacacgcactggagaatgtcatccacatcatcagggttcatcaccc480

gcttttggataaacgccctg500

<210>2

<211>1410

<223>用于生成所有来自本发明的反向重复序列的chsa内含子的序列

<400>2

ggcgcgcccaatcgatgatttaaatgtgtaagaatttcttatgttacattattacattca60

acgttttatcttaattggctcttcatttgattgaaatttgacaattatttcttgtttttt120

tttttgtcacactctttttgggttggggtggccgacgaattgtgggaaggtagaaagagg180

ggaggacttttgttatactccattagtaattactgtttccgtttcaatttatgtgacaat240

atttcctttttagtcggttccaaaagaaaatgtcagcattataaacaatttaattttgaa300

attacaattttgccattaataaaatgatttacaaccacaaaagtatctatgagcctgttt360

gggtgggcttataagcagcttattttaagtggcttataagtcaaaaagtgacattttttg420

agaagttagaaaatcctaacttctcaaaaagtagcttttaagccacttatgacttataag480

tccaaaaatttttaagttaccaaacatatattaatgggtttataagcttataagccactt540

ttaagctcacccaaacgggttctatgtctcactttagactacaaattttaaaagtcttca600

tttatttcttaatctccgtggcgagtaaaactataacacataaagtgaaacggagggaat660

aagatggagtcataaactaatccaaatctatactctctccgttaatttgttttttagttt720

gatttggtacattaataaaacagatttttcgaaggttataaacacagacagatgtttccc780

agcgagctagcaaaattccaagatttctgtcgaaaattcgtgtgtttctagctagtactt840

gatgttatctttaaccttttagtaattttttgtccttttctttctatttttcatcttaca900

atgaattatgagcaagttccttaagtagcatcacacgtgagatgttttttatgatattga960

ctaaatccaatctttaccattccttaactagtaaaatacaacacatgttaattgatacat1020

tgcttaacactgaggttagaaaattttagaaattagttgtccaaatgctttgaaattaga1080

aatctttaatcccttatttttttttaaaatgttttttctcactccaaagaaagagaaact1140

gacatgaaagctcaaaagatcatgaatcttactaactttgtggaactaaatgtacatcag1200

aatgtttctgacatgtgaaaatgaaagctcttaattttcttcttttatttattgagggtt1260

tttgcatgctatgcattcaatttgagtactttaaagcacctataaacacttacttacact1320

tgccttggagtttatgttttagtgttttcttcacatcttttttggtcaatttgcaggtat1380

ttggatcctaggtgagtctagaggcgcgcc1410

<210>3

<223>用于同时靶向ptodc3000的hrpl和cfa6基因的hrpl/cfa6dsrna的第二臂的序列

<400>3

cagggcgtttatccaaaagcgggtgatgaaccctgatgatgtggatgacattctccagtg60

cgtgtttcttgaagccctgcgtaacgagcacaagtttcaacatgccagcaaaccgcagac120

ctggctgtgtggcatcgcgctgaacctgatccgcaatcacttccgcaaaatgtatcgtca180

gccgtatcaggaaagctgggaagacgaagtgcattccgagctggaagggcacggtgatgt240

cagtcatcagcggcgaaggagcgcgtctcgtgctcggcgcgcagacgttgcgcggtagcg300

gcgagtgccgtggggcttgcatccgacagaatcaggggcacggtgaaggtggtcacgggc360

agactcctgcagaaatattggaaacgattaacggcggcctttttgccagatggcgtgctg420

cgcgaaggtgacgtccagtcgatccggttgctcagcgcgcaacaggatcccggcaagttg480

ttgccgtagcgcttgttcat500

<210>4

<211>250

<223>用于靶向ptodc3000的cfa6基因的cfa6-adsrna的第一臂的序列

<400>4

tccttcgccg250

<210>5

<223>用于靶向ptodc3000的cfa6基因的cfa6-adsrna的第二臂的序列

<400>5

cggcgaaggagcgcgtctcgtgctcggcgcgcagacgttgcgcggtagcggcgagtgccg60

tggggcttgcatccgacagaatcaggggcacggtgaaggtggtcacgggcagactcctgc120

agaaatattggaaacgattaacggcggcctttttgccagatggcgtgctgcgcgaaggtg180

acgtccagtcgatccggttgctcagcgcgcaacaggatcccggcaagttgttgccgtagc240

gcttgttcat250

<210>6

<211>472

<223>用于靶向ptodc3000的cfa6基因的cfa6-bdsrna的第一臂的序列

<400>6

tccttcgccgaatggcaagtattctgccgacagcaactgacacgcgaccatgccgaatac300

cgcgcggccatcttagccaccgatcaagccagcctactcaaagggctggatatgctggcc360

cgcggccgagcctcgcgccatctggtgctgggccgcgccgaccagttgcgacagccggta420

ctggtgtttccaggccaaggaccgctatggccgcggatgactaccggactga472

<210>7

<223>用于靶向ptodc3000的cfa6基因的cfa6-bdsrna的第二臂的序列

<400>7

tcagtccggtagtcatccgcggccatagcggtccttggcctggaaacaccagtaccggct60

gtcgcaactggtcggcgcggcccagcaccagatggcgcgaggctcggccgcgggccagca120

tatccagccctttgagtaggctggcttgatcggtggctaagatggccgcgcggtattcgg180

catggtcgcgtgtcagttgctgtcggcagaatacttgccattcggcgaaggagcgcgtct240

cgtgctcggcgcgcagacgttgcgcggtagcggcgagtgccgtggggcttgcatccgaca300

gaatcaggggcacggtgaaggtggtcacgggcagactcctgcagaaatattggaaacgat360

taacggcggcctttttgccagatggcgtgctgcgcgaaggtgacgtccagtcgatccggt420

tgctcagcgcgcaacaggatcccggcaagttgttgccgtagcgcttgttcat472

<210>8

<223>用于靶向ptodc3000的hrpl基因的hrpl-adsrna的第一臂的序列

<400>8

ctgatgactgacatcaccgtgcccttccagctcggaatgcacttcgtcttcccagctttc60

ctgatacggctgacgatacattttgcggaagtgattgcggatcaggttcagcgcgatgcc120

acacagccaggtctgcggtttgctggcatgttgaaacttgtgctcgttacgcagggcttc180

aagaaacacgcactggagaatgtcatccacatcatcagggttcatcacccgcttttggat240

aaacgccctg250

<210>9

<223>用于靶向ptodc3000的hrpl基因的hrpl-adsrna的第二臂的序列

<400>9

cagtcatcag250

<210>10

<211>348

<223>用于靶向ptodc3000的hrpl基因的hrpl-bdsrna的第一臂的序列

<400>10

aaacgccctgagcatctgaatctgatcggccgtcatttggcgaataccggcggacgaaga300

tggctgacggggctgggttgagtcgaggatcacaatcttctgaaacat348

<210>11

<223>用于靶向ptodc3000的hrpl基因的hrpl-bdsrna的第二臂的序列

<400>11

atgtttcagaagattgtgatcctcgactcaacccagccccgtcagccatcttcgtccgcc60

ggtattcgccaaatgacggccgatcagattcagatgctcagggcgtttatccaaaagcgg120

gtgatgaaccctgatgatgtggatgacattctccagtgcgtgtttcttgaagccctgcgt180

aacgagcacaagtttcaacatgccagcaaaccgcagacctggctgtgtggcatcgcgctg240

aacctgatccgcaatcacttccgcaaaatgtatcgtcagccgtatcaggaaagctgggaa300

gacgaagtgcattccgagctggaagggcacggtgatgtcagtcatcag348

<210>12

<211>360

<223>用于靶向ptodc3000的hrcc基因的hrccdsrna的第一臂的序列

<400>12

gaaggcgtggttctggttcgtggtccggccaaatacgtggagtttgtgcgcgactacagc60

aagaaagtcgaaaagcccgacgagaaggccgacaagcaagatgttgtcgtgctgccactc120

aaatacgccaacgcggctgatcggactattcgctaccgtgaccagcagttagtggtggcc180

ggtgtcgccagtattcttcaagagctgctggaaagccgttcgcgtggcgaaagcattgac240

agcgtgaacctgttgccggggcagggcagcagtgttgccaacagcacaggtgtcgcggcc300

gccggcctgccttacaacctgggctccaatggtatcgatacgggagcactgcaacagggc360

<210>13

<223>用于靶向ptodc3000的hrcc基因的hrccdsrna的第二臂的序列

<400>13

gccctgttgcagtgctcccgtatcgataccattggagcccaggttgtaaggcaggccggc60

ggccgcgacacctgtgctgttggcaacactgctgccctgccccggcaacaggttcacgct120

gtcaatgctttcgccacgcgaacggctttccagcagctcttgaagaatactggcgacacc180

ggccaccactaactgctggtcacggtagcgaatagtccgatcagccgcgttggcgtattt240

gagtggcagcacgacaacatcttgcttgtcggccttctcgtcgggcttttcgactttctt300

gctgtagtcgcgcacaaactccacgtatttggccggaccacgaaccagaaccacgccttc360

<210>14

<211>400

<223>用于靶向ptodc3000的avrpto和avrptob基因的avrpto/avrptobdsrna的第一臂的序列

<400>14

atgggaaatatatgtgtcggcggatccaggatggcccatcaggtgaactccccagaccga60

gttagtaacaactcgggtgacgaagataacgtaacgtccagtcaactgctgagcgtcaga120

catcaacttgcggagtctgctggtgtaccaagagatcagcatgaatttgttagtaaccaa180

gcacctcaaagcctgagaaaatggcgggtatcaatagagcgggaccatcgggcgcttatt240

ttgttggccacacagaccccgagccagtatcggggcaagcacacggatccggcagcggcg300

ccagctcctcgaacagtccgcaggttcagccgcgaccctcgaatactcccccgtcgaacg360

cgcccgcaccgccgccaaccggacgtgagaggctttcacg400

<210>15

<223>用于靶向ptodc3000的avrpto和avrptob基因的avrpto/avrptobdsrna的第二臂的序列

<400>15

cgtgaaagcctctcacgtccggttggcggcggtgcgggcgcgttcgacgggggagtattc60

gagggtcgcggctgaacctgcggactgttcgaggagctggcgccgctgccggatccgtgt120

gcttgccccgatactggctcggggtctgtgtggccaacaaaataagcgcccgatggtccc180

gctctattgatacccgccattttctcaggctttgaggtgcttggttactaacaaattcat240

gctgatctcttggtacaccagcagactccgcaagttgatgtctgacgctcagcagttgac300

tggacgttacgttatcttcgtcacccgagttgttactaactcggtctggggagttcacct360

gatgggccatcctggatccgccgacacatatatttcccat400

<210>16

<211>752

<223>用于靶向禾谷镰刀菌（fusariumgraminearum）的fgcyp51a、fgcyp51b和fgcyp51c基因的cyp51dsrna的第一臂的序列

<400>16

cagcaagtttgacgagtccctggccgctctctaccacgacctcgatatgggcttcacccc60

catcaacttcatgcttcactgggcccctctcccctggaaccgtaagcgcgaccacgccca120

gcgcactgttgccaagatctacatggacactatcaaggagcgccgcgccaagggcaacaa180

cgaatccgagcatgacatgatgaagcaccttatgaactctcggtccattgacaatccccg240

tctttggtagcgatgtcgtatacgattgtcccaactcgaagctcatggaacaaaagaagt300

ttgtcaagtttggccttacgcaaaaagcactcgagtcacacgtccagttaatcgagcgag360

aggttcttgactacgtcgaaactgatccatccttttctggcagaactagcaccatcgatg420

tccccaaggcaatggctgagataacaatctttactgcctcacgttctttgcagggtgagg480

aagttcggagaaaactcactgccgagtttgctgcattggaagcaccgtacaatatggcat540

cgacccgtacgcttttttcttcgactgcagagataaatacggcgactgctttacctttat600

tctccttggcaaatcaacgactgtctttcttggtcccaagggcaatgactttatcctcaa660

cggcaaacacgccgatctcaacgccgaggacgtttatgggaaacttaccacgcccgtgtt720

tggtgaggaggttgtttatgactgctccaatg752

<210>17

<223>用于靶向禾谷镰刀菌（fusariumgraminearum）的fgcyp51a、fgcyp51b和fgcyp51c基因的cyp51dsrna的第二臂的序列

<400>17

cattggagcagtcataaacaacctcctcaccaaacacgggcgtggtaagtttcccataaa60

cgtcctcggcgttgagatcggcgtgtttgccgttgaggataaagtcattgcccttgggac120

caagaaagacagtcgttgatttgccaaggagaataaaggtaaagcagtcgccgtatttat180

ctctgcagtcgaagaaaaaagcgtacgggtcgatgccatattgtacggtgcttccaatgc240

agcaaactcggcagtgagttttctccgaacttcctcaccctgcaaagaacgtgaggcagt300

aaagattgttatctcagccattgccttggggacatcgatggtgctagttctgccagaaaa360

ggatggatcagtttcgacgtagtcaagaacctctcgctcgattaactggacgtgtgactc420

gagtgctttttgcgtaaggccaaacttgacaaacttcttttgttccatgagcttcgagtt480

gggacaatcgtatacgacatcgctaccaaagacggggattgtcaatggaccgagagttca540

taaggtgcttcatcatgtcatgctcggattcgttgttgcccttggcgcggcgctccttga600

tagtgtccatgtagatcttggcaacagtgcgctgggcgtggtcgcgcttacggttccagg660

ggagaggggcccagtgaagcatgaagttgatgggggtgaagcccatatcgaggtcgtggt720

agagagcggccagggactcgtcaaacttgctg752

<210>18

<211>667

<223>用于同时靶向雷尔氏菌属的hrpg、hrpb和hrcc基因的hrpg/hrpb/hrccdsrna的第一臂的序列

<400>18

cgcatgcctggccgtgcagaacgtggaatgtgtccggttcgacgatgccctgacgctgtt60

gcgtgcacggcgtaccgaggcattcagtctgctgctgatcgatgcccagcagttccgcag120

cgcgggacagctggtgctgtcctggcgcgagtgcaacgccgacatgtgctggccgacgct180

ggtgttcggccagttcgcagtgaagaagcggaagaaggcttccgcctggcgcagcgcctg240

atccgccattcggatgacgcgcgatcgctacgccgcggcggcgagctgcttctcgcgcat300

ggccgaagacgatggcgcgacctggacccagcaggtcgagggcctgatcggcccgcggct360

ggctggccaccatcgatctgatcatctacgttttcgccgtgcaggccggcatccgctgct420

ccaaccgcctgctcgagcatgcgttctggcaatcggccgaaatgggcatctcgacgcagg480

tcgagggcagcgtgacgggctcgttcaacgagacgccgcagaagtttctcgaccgcatgg540

ccggcacgttcggctttgcgtggtactacgacggcgcggtgctgcgcgtgaccagcgcca600

acgaagcgcagagcgccaccatcgcgctgacccgcgcctcgaccgcgcaggtcaagcggg660

cgctgac667

<210>19

<223>用于同时靶向雷尔氏菌属的hrpg、hrpb和hrcc基因的hrpg/hrpb/hrccdsrna的第二臂的序列

<400>19

gtcagcgcccgcttgacctgcgcggtcgaggcgcgggtcagcgcgatggtggcgctctgc60

gcttcgttggcgctggtcacgcgcagcaccgcgccgtcgtagtaccacgcaaagccgaac120

gtgccggccatgcggtcgagaaacttctgcggcgtctcgttgaacgagcccgtcacgctg180

ccctcgacctgcgtcgagatgcccatttcggccgattgccagaacgcatgctcgagcagg240

cggttggagcagcggatgccggcctgcacggcgaaaacgtagatgatcagatcgatggtg300

gccagccagccgcgggccgatcaggccctcgacctgctgggtccaggtcgcgccatcgtc360

ttcggccatgcgcgagaagcagctcgccgccgcggcgtagcgatcgcgcgtcatccgaat420

ggcggatcaggcgctgcgccaggcggaagccttcttccgcttcttcactgcgaactggcc480

gaacaccagcgtcggccagcacatgtcggcgttgcactcgcgccaggacagcaccagctg540

tcccgcgctgcggaactgctgggcatcgatcagcagcagactgaatgcctcggtacgccg600

tgcacgcaacagcgtcagggcatcgtcgaaccggacacattccacgttctgcacggccag660

gcatgcg667

<210>20

<211>705

<223>用于同时靶向雷尔氏菌属的hrpb、hrcc、xpsr和tssb基因的hrpb/hrcc/tssb/xpsrdsrna的第一臂的序列

<400>20

gcgcgatcgctacgccgcggcggcgagctgcttctcgcgcatggccgaagacgatggcgc60

gacctggacccagcaggtcgagggcctgatcggcccgcggctggctggccaccatcgatc120

tgatcatctacgttttcgccgtgcaggccggcatccgctgctccaaccgcctgctcgagc180

atgcgttctggcaatcggccgaaatgggcatctcgacgcaggtcgagggcagcgtgacgg240

gctcgttcaacgagacgccgcagaagtttctcgaccgcatggccggcacgttcggctttg300

cgtggtactacgacggcgcggtgctgcgcgtgaccagcgccaacgaagcgcagagcgcca360

ccatcgcgctgacccgcgccggccgcgcgtgcggagacccatcggcggccgcagagcgaa420

tgcgactggaagcattactttgcggacctgctctatgcgccgaacggcgccgagttcaag480

ctcagcctgtttccgctgcccgcgcagcagatcggcgacacgccctggtcgcgggcattc540

cgcgggcagccggcgatgcttgacaaccaatccgccgcgctcgcgcagagcgcaccggca600

gccgagtccgtcaacctgctcgacgagatcgtcgagcagagccgcgtcgccaagtcggac660

gccgagcacgcgcgcgccaaggacatcatcggcgagctggtcaac705

<210>21

<223>用于同时靶向雷尔氏菌属的hrpb、hrcc、xpsr和tssb基因的hrpb/hrcc/tssb/xpsrdsrna的第二臂的序列

<400>21

gttgaccagctcgccgatgatgtccttggcgcgcgcgtgctcggcgtccgacttggcgac60

gcggctctgctcgacgatctcgtcgagcaggttgacggactcggctgccggtgcgctctg120

cgcgagcgcggcggattggttgtcaagcatcgccggctgcccgcggaatgcccgcgacca180

gggcgtgtcgccgatctgctgcgcgggcagcggaaacaggctgagcttgaactcggcgcc240

gttcggcgcatagagcaggtccgcaaagtaatgcttccagtcgcattcgctctgcggccg300

ccgatgggtctccgcacgcgcggccggcgcgggtcagcgcgatggtggcgctctgcgctt360

cgttggcgctggtcacgcgcagcaccgcgccgtcgtagtaccacgcaaagccgaacgtgc420

cggccatgcggtcgagaaacttctgcggcgtctcgttgaacgagcccgtcacgctgccct480

cgacctgcgtcgagatgcccatttcggccgattgccagaacgcatgctcgagcaggcggt540

tggagcagcggatgccggcctgcacggcgaaaacgtagatgatcagatcgatggtggcca600

gccagccgcgggccgatcaggccctcgacctgctgggtccaggtcgcgccatcgtcttcg660

gccatgcgcgagaagcagctcgccgccgcggcgtagcgatcgcgc705

<210>22

<211>633

<223>用于同时靶向芸苔黄单孢杆菌芸苔致病变种的hrpg、hrpx和rsma基因的hrpg/hrpx/rsmadsrna的第一臂的序列

<400>22

gtgatggacgccgctgcgaatgaccgccaaggatcggcattcgtactgacgcaggacgcg60

cggctggcatcacagatcaacgccagcctggcgactctggtcccagaggtcaccatcttt120

tcagacgaactcgaattgctgcgctgcctgcgccactcgccgtgcgagcttctggttttc180

gatgcccattgcgtggcatcggacgacagtatgatcctttcgacctacttcgcagcgatc240

tctgcgttgtcttacgcagaccgtcttccgatctatacgagcaggatgcttgttggtgct300

tggccacagggtctgcagcacctccagcaacgtcgcgaggggcaggcagctccggatggc360

agcgacgacgaagtcgcattgctgggcgccagcgccgatgccttgttgattctggagtat420

atgttgatcctcactcgccgagtaggcgaaaccctgatgatcggcgacttggtcaccgtg480

accgtgctcggcgtcaagggaaatcaggtgcgcattggcattgacgcgcctaaggatgtt540

gccgtgcatcgcgaagaaatctatcagcgcatccagcgcggtgacgagccggttgcgtcc600

ggtgcgcatcacaacgacgattgttcggactga633

<210>23

<223>用于同时靶向芸苔黄单孢杆菌芸苔致病变种的hrpg、hrpx和rsma基因的hrpg/hrpx/rsmadsrna的第二臂的序列

<400>23

tcagtccgaacaatcgtcgttgtgatgcgcaccggacgcaaccggctcgtcaccgcgctg60

gatgcgctgatagatttcttcgcgatgcacggcaacatccttaggcgcgtcaatgccaat120

gcgcacctgatttcccttgacgccgagcacggtcacggtgaccaagtcgccgatcatcag180

ggtttcgcctactcggcgagtgaggatcaacatatactccagaatcaacaaggcatcggc240

gctggcgcccagcaatgcgacttcgtcgtcgctgccatccggagctgcctgcccctcgcg300

acgttgctggaggtgctgcagaccctgtggccaagcaccaacaagcatcctgctcgtata360

gatcggaagacggtctgcgtaagacaacgcagagatcgctgcgaagtaggtcgaaaggat420

catactgtcgtccgatgccacgcaatgggcatcgaaaaccagaagctcgcacggcgagtg480

gcgcaggcagcgcagcaattcgagttcgtctgaaaagatggtgacctctgggaccagagt540

cgccaggctggcgttgatctgtgatgccagccgcgcgtcctgcgtcagtacgaatgccga600

tccttggcggtcattcgcagcggcgtccatcac633

<210>24

<211>676

<223>用于同时靶向ptodc3000和丁香假单胞菌cc440的rpob、rpoc和fusa基因的rpob/rpoc/fusadsrna的第一臂的序列

<400>24

aacacgtatccgcaaggactttagcaagttgccggacgtaatggatgtgccgtatctctt60

ggccatccagctggattcgtatcgcgaattcctgcaggcgggagcgaccaaagatcagtt120

ccgcgacgtcggtctgcatgcagccttcaaatccgttttcccgatcatcagctactccgg180

caatgctgcgctggagtatgtaggttatcgcttgggcgagatcttgaaagacctactgaa240

tttgctgaaaaaccagggtcaagtcgaagagttcgacgcaatccgtatcggacttgcatc300

gcctgagatgatccgctcttggtcgttcggtgaagttaaaaagccggaaaccatcaacta360

ccgtacgttcaagcctgagcgtgacggtctgttctgcgccaagatctttggtccggtaaa420

agattacgagtgcctgtgcggtaagtacaaggcatatggctcgtactactccgattagcc480

gttaccgtaacatcggtatcgtcgctcacgtggatgctggtaaaaccaccaccaccgagc540

gcgtccttttttacaccggcaaaagccacaaaatgggcgaggtgcatgatggcgccgcga600

ccacggactggatggttcaggagcaggagcgtggtattaccattacttctgctgctatca660

ctgccttttggcggct676

<210>25

<223>用于同时靶向ptodc3000和丁香假单胞菌cc440的rpob、rpoc和fusa基因的rpob/rpoc/fusadsrna的第二臂的序列

<400>25

tcaggccaaaaggcagtgatagcagcagaagtaatggtaataccacgctcctgctcctga60

accatccagtccgtggtcgcggcgccatcatgcacctcgcccattttgtggcttttgccg120

gtgtaaaaaaggacgcgctcggtggtggtggttttaccagcatccacgtgagcgacgata180

ccgatgttacggtaacggctaatcggagtagtacgagccatatgccttgtacttaccgca240

caggcactcgtaatcttttaccggaccaaagatcttggcgcagaacagaccgtcacgctc300

aggcttgaacgtacggtagttgatggtttccggctttttaacttcaccgaacgaccaaga360

gcggatcatctcaggcgatgcaagtccgatacggattgcgtcgaactcttcgacttgacc420

ctggtttttcagcaaattcagtaggtctttcaagatctcgcccaagcgataacctacata480

ctccagcgcagcattgccggagtagctgatgatcgggaaaacggatttgaaggctgcatg540

cagaccgacgtcgcggaactgatctttggtcgctcccgcctgcaggaattcgcgatacga600

atccagctggatggccaagagatacggcacatccattacgtccggcaacttgctaaagtc660

cttgcggatacgctgc676

<210>26

<211>681

<223>用于同时靶向ptodc3000和丁香假单胞菌cc440的sece、rpoa和rplq基因的sece/rpoa/rplqdsrna的第一臂的序列

<400>26

aacatgaatcccaaggctgaagcatcagactctcgctttgatttgctgaaatggctcctg60

gtagtcattttggtagtcgtgggtgttgtcggtaatcagtattactctgctgagccgatc120

ctgtaccgtgttctcgctctccttgtgattgccgcagcagctgcatttgtagcgctgcag180

actggcaagggcaaagctttcttcgttttggcgaaagaagcgcgtgcagagatgatctgc240

agatttcggtaaatgagttcctgacaccccgccacattgatgtgcaggttgtcagtccaa300

cccgcgccaaaatcactctcgagcctctcgagcgtggtttcggccataccctgggcaacg360

cgcttcgccgcattttgttgtcctccatgcccggctgtgcagtagtcgaggccgagattg420

acggtgtactccatgagtacagcgccatcgaaggtgtagcatatgcgtcatcgtaaaagt480

ggacgtcacctgagccgtaccagctctcaccgtaaagccatgtttcaaaacatggcggtg540

tcgctgttcgagcacgagctgatcaaaactaccctgccgaaagccaaggaactgcgccgc600

gttgccgagccgctgatcaccctggccaaggaagacagtgttgctaaccgtcgtctggct660

ttcgaccgtactcgttcggct681

<210>27

<223>用于同时靶向ptodc3000和丁香假单胞菌cc440的sece、rpoa和rplq基因的sece/rpoa/rplqdsrna的第二臂的序列

<400>27

tcaggaacgagtacggtcgaaagccagacgacggttagcaacactgtcttccttggccag60

ggtgatcagcggctcggcaacgcggcgcagttccttggctttcggcagggtagttttgat120

cagctcgtgctcgaacagcgacaccgccatgttttgaaacatggctttacggtgagagct180

ggtacggctcaggtgacgtccacttttacgatgacgcatatgctacaccttcgatggcgc240

tgtactcatggagtacaccgtcaatctcggcctcgactactgcacagccgggcatggagg300

acaacaaaatgcggcgaagcgcgttgcccagggtatggccgaaaccacgctcgagaggct360

cgagagtgattttggcgcgggttggactgacaacctgcacatcaatgtggcggggtgtca420

ggaactcatttaccgaaatctgcagatcatctctgcacgcgcttctttcgccaaaacgaa480

gaaagctttgcccttgccagtctgcagcgctacaaatgcagctgctgcggcaatcacaag540

gagagcgagaacacggtacaggatcggctcagcagagtaatactgattaccgacaacacc600

cacgactaccaaaatgactaccaggagccatttcagcaaatcaaagcgagagtctgatgc660

ttcagccttgggattcactgc681

<210>28

<211>718

<223>用于同时靶向黄单孢菌属的nadhb、nadhd和nadhe基因的nadhb/nadhd/nadhedsrna的第一臂的序列

<400>28

aacagaagaagggagcgctggaatgggagtgattcagaccctggatcgtctgatgaccaa60

cccgatgccggaaggccgggtcgaagacatcctgcgcccggaaggcgaaaacccgttgct120

cgaaaagggctacgtgaccaccagcgtcgatgcgctgttgaactgggcgcgtacaggttc180

gatgtggccgatgacctttggtctggcctgctgtgcagtcgagatgatgcagatcgtgag240

tgagtaccgccaggcaaccgatgccttcgcgagcaatcctgtggaaagcaagcaggaaat300

ccgcaattacacgatgaacttcggcccgcagcatcctgcggcgcacggcgtattgcgcct360

gatcctggaaatggacggcgaaaccgtggtgcgtgccgacccgcatatcggcctgctgca420

ccgtggcaccgagaagctggccgagtccaagccgttcaaccagtcggttccgtacagcat480

cgacgggtaatttcgaagcggcgcgcgacgtcgatccgcaggtagtgctgagcgacaaga540

cgcgcgcgcacatcgatcattggctgagcaagttcccgcccgaccgcaagcgttcggccg600

tgttgcagggtctgcatgccgcgcaggaacagaaccagggttggttgaccgacgagctga660

tcgtgggcgtggccaagtatctggagctgccgccggtgtgggcctacgaagtggggct718

<210>29

<223>用于同时靶向黄单孢菌属的nadhb、nadhd和nadhe基因的nadhb/nadhd/nadhedsrna的第二臂的序列

<400>29

tcagccacttcgtaggcccacaccggcggcagctccagatacttggccacgcccacgatc60

agctcgtcggtcaaccaaccctggttctgttcctgcgcggcatgcagaccctgcaacacg120

gccgaacgcttgcggtcgggcgggaacttgctcagccaatgatcgatgtgcgcgcgcgtc180

ttgtcgctcagcactacctgcggatcgacgtcgcgcgccgcttcgaaattacccgtcgat240

gctgtacggaaccgactggttgaacggcttggactcggccagcttctcggtgccacggtg300

cagcaggccgatatgcgggtcggcacgcaccacggtttcgccgtccatttccaggatcag360

gcgcaatacgccgtgcgccgcaggatgctgcgggccgaagttcatcgtgtaattgcggat420

ttcctgcttgctttccacaggattgctcgcgaaggcatcggttgcctggcggtactcact480

cacgatctgcatcatctcgactgcacagcaggccagaccaaaggtcatcggccacatcga540

acctgtacgcgcccagttcaacagcgcatcgacgctggtggtcacgtagcccttttcgag600

caacgggttttcgccttccgggcgcaggatgtcttcgacccggccttccggcatcgggtt660

ggtcatcagacgatccagggtctgaatcactcccattccagcgctcccttcttcctgc718

<210>30

<211>677

<223>用于同时靶向黄单孢菌属的dnaa、dnae1和dnae2基因的dnaa/dnae1/dnae2dsrna的第一臂的序列

<400>30

aacaatgcttggccccgctgtctggaacgtctcgaagctgaattcccgcccgaggatgtc60

cacacctggttgaaacccctgcaggccgaagatcgcggcgacagcatcgtgctgtacgcg120

ccgaacgccttcattgttgagcaggtccgcgagcgatacctgccgcgcatccgcgagttg180

ctggcatatttcgccggcaatggcgaggtggcgctggcggtcggctcccgtcgatcgcgc240

gaagccttcctcaagccgttggcccaggtggtcaatgtcgtcgaacggcgtcagacattg300

ccggtactggcgaacttgctggtgcaggtgaacaacggccagctgtcgctgacggggacc360

gacctggaagtcgaaatgatctcgcgcaccatggtcgaggacgcccaggacggcgaaacc420

acgatcccggcgcgcaagctgttcgacatcctggcatatgtccacttcccgcttcgtcca480

tctgcacgtccacaccgagttctcgttggcggattccaccatccgcgtgcccgagaaacc540

ggatcaggctgacccgaaaaaagccaagcaggccaacctgctgagccgcgcggtcgaact600

cgacttgcccgcgctggcggtcaccgacctgaacaacctgttcgccctggtcaagttcta660

caaggccgccgaaggct677

<210>31

<223>用于同时靶向黄单孢菌属的dnaa、dnae1和dnae2基因的dnaa/dnae1/dnae2dsrna的第二臂的序列

<400>31

tcagttcggcggccttgtagaacttgaccagggcgaacaggttgttcaggtcggtgaccg60

ccagcgcgggcaagtcgagttcgaccgcgcggctcagcaggttggcctgcttggcttttt120

tcgggtcagcctgatccggtttctcgggcacgcggatggtggaatccgccaacgagaact180

cggtgtggacgtgcagatggacgaagcgggaagtggacatatgccaggatgtcgaacagc240

ttgcgcgccgggatcgtggtttcgccgtcctgggcgtcctcgaccatggtgcgcgagatc300

atttcgacttccaggtcggtccccgtcagcgacagctggccgttgttcacctgcaccagc360

aagttcgccagtaccggcaatgtctgacgccgttcgacgacattgaccacctgggccaac420

ggcttgaggaaggcttcgcgcgatcgacgggagccgaccgccagcgccacctcgccattg480

ccggcgaaatatgccagcaactcgcggatgcgcggcaggtatcgctcgcggacctgctca540

acaatgaaggcgttcggcgcgtacagcacgatgctgtcgccgcgatcttcggcctgcagg600

ggtttcaaccaggtgtggacatcctcgggcgggaattcagcttcgagacgttccagacag660

cggggccaagcatctgc677

<210>32

<211>717

<223>gfpppnpt质粒中包含的gfp报告子序列

<400>32

atgagtaagggggaggagctctttacaggggtggtacccatactcgtcgagctcgacggg60

gacgtgaacggtcagaagttttcggtaagcggggaaggggagggggacgcgacgtatggg120

aagctgacactcaagttcatatgtacaacaggaaaactgccggtcccttggcccacgctc180

gttacaacattaacatacggggtgcagtgtttctcgaggtatccggaccacatgaagcaa240

cacgatttctttaaaagcgcaatgccagaggggtacgttcaagagaggacgattttctat300

aaggacgatggtaattataaaacccgggcggaggttaaattcgagggggacacactggtg360

aacaggatagaattgaaggggatagacttcaaggaggacggcaacattcttggacacaaa420

atggaatacaactataactcacataatgtatacatcatggcagacaaaccaaagaatgga480

atcaaagttaacttcaaaattagacacaacattaaagatggaagcgttcaattagcagac540

cattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattac600

ctgtccacacaatctgccctttccaaagatcccaacgaaaagagagatcacatgatcctt660

cttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataa717

<210>33

<211>21

<223>用于lmwnorthern印迹的cfa6-正向的引物序列

<400>33

caacaacttgccgggatcctg21

<210>34

<211>22

<223>用于lmwnorthern印迹的cfa6-反向引物序列

<400>34

ggcttgcatccgacagaatcag22

<210>35

<223>用于lmwnorthern印迹的hrpl-正向的引物序列

<400>35

cacttcgtcttcccagctttc21

<210>36

<211>24

<400>36

tttatccaaaagcgggtgatgaac24

<210>37

<223>用于lmwnorthern印迹的mir159探针的引物序列

<400>37

aaacctaacttccctcgagat21

<210>38

<211>19

<223>用于rt-qpcr的gyra-fwd的引物序列

<400>38

aactgctgggtgagtacca19

<210>39

<223>用于rt-qpcr的gyra-rev的引物序列

<400>39

gagctcttcgcggatcact19

<210>40

<211>20

<223>用于rt-qpcr的cfa6-fwd的引物序列

<400>40

gtcttcatctttcccggtca20

<210>41

<223>用于rt-qpcr的cfa6-rev的引物序列

<400>41

gtctcgatctggtcgatggt20

<210>42

<223>用于rt-qpcr的hrpl-fwd的引物序列

<400>42

cgagtcattcaggccattgatt22

<210>43

<223>用于rt-qpcr的hrpl-rev的引物序列

<400>43

gtttcctgataattgccgtcca22

<210>44

<223>用于rt-qpcr的proc-fwd的引物序列

<400>44

cgcagatgatgaaaagcgtc20

<210>45

<223>用于rt-qpcr的proc-rev的引物序列

<400>45

agtcaggctggcacaggtg19

<210>46

<223>用于细菌转录本rpob的qpcr引物rpob-fwd

<400>46

gtaggtctggtccgtgttga20

<210>47

<223>用于rt-qpcr的rpob-rev的引物序列

<400>47

gcaagtaatctcggacagcg20

<210>48

<223>用于lmwnorthern印迹的cyp3-正向的引物序列

<400>48

atccgagcatgacatgatga20

<210>49

<223>用于lmwnorthern印迹的cyp3-反向的引物序列

<400>49

gtacgggtcgatgccatatt20

<210>50

<223>用于northern印迹分析的探针制备：u6

<400>50

aggggccatgctaatcttctc21

<210>51

<223>用于rt-qpcr的番茄ubi-fwd的引物序列

<400>51

ggacggacgtactctagctgat22

<210>52

<223>用于rt-qpcr的番茄ubi-rev的引物序列

<400>52

agctttcgacctcaagggta20

<210>53

<223>用于rt-qpcr的ptogfp-fwd的引物序列

<400>53

tggaagcgttcaactagcag20

<210>54

<223>用于rt-qpcr的ptogfp-rev的引物序列

<400>54

aaagggcagattgtgtggac20

<210>55

<223>用于rt-qpcr的ir-cfa6/hrpl-fwd的引物序列

<400>55

gttcatcacccgcttttgga20

<210>56

<223>用于rt-qpcr的ir-cfa6/hrpl-rev的引物序列

<400>56

cccctctttctaccttccca20

<210>57

<223>用于rt-qpcr的ath-ubi-fwd的引物序列

<400>57

tgaagtcgtgagacagcgttg21

<210>58

<223>用于rt-qpcr的ath-ubi-rev的引物序列

<400>58

gggctttctcattgttggtc20

<210>59

<211>35

<223>用于克隆pdon207-attb1/b2中的wthrpl和muthrpl的hrpl-pdon207-f

<400>59

aaaaagcaggcttcatgtttcagaagattgtgatc35

<210>60

<211>34

<223>用于克隆pdon207-attb1/b2中的wthrpl和muthrpl的hrpl-pdon207-rev

<400>60

agaaagctgggtcggcgaacgggtcgatttgctg34

<210>61

<223>对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-wt-fwd

<400>61

tgaatcatctggaagaggtgg21

<210>62

<223>对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-mut-fwd

<400>62

attttgccgatttcggaac19

<210>63

<223>对dcl2-1等位基因进行基因型分型的引物dcl2-1-wt-rev

<400>63

<210>64

<223>对dcl3-1等位基因进行基因型分型的引物dcl3-1-fwd

<400>64

acaggtaaccttgccatgttg21

<210>65

<223>对dcl3-1等位基因进行基因型分型的引物dcl3-1-rev

<400>65

tggaaaagtttgctacaacgg21

<210>66

<223>引物lba1

<400>66

tggttcacgtagtgggccatcg22

<210>67

<211>23

<223>对dcl4-2等位基因进行基因型分型的引物dcl4-2-g8605fwd

<400>67

ggctgcacagctgatgattacaa23

<210>68

<211>27

<223>对dcl4-2等位基因进行基因型分型的引物dcl4-2-g8605rev

<400>68

gccgctcgagatcatcagcaaaggaat27

<210>69

<211>28

<223>引物gabi-8474-lp

<400>69

ataataacgctgcggacatctacatttt28

<210>70

<223>northern印迹分析ir-hhrfwd引物

<400>70

ggcatcacagatcaacgcc19

<210>71

<211>18

<223>northern印迹分析ir-hhrrev引物

<400>71

actgtcgtccgatgccac18

<210>72

<223>rt-qpcrluxafwd

<400>72

cggagtttggtttgcttggt20

<210>73

<223>rt-qpcrluxarev

<400>73

caagttggcgtactggatgg20

<210>74

<223>rt-qpcrluxbfwd

<400>74

gcggaggaagcttgcttatt20

<210>75

<223>rt-qpcrluxbrev

<400>75

tgatattcaaccgggcgatt20

<210>76

<223>hrpl-pdon207-fwd

<400>76

<210>77

<223>hrpl-pdon207-rev

<400>77

<210>78

<211>37

<223>t7fwdcfa6/hrpl

<400>78

taatacgactcactatagggagatgaacaagcgctac37

<210>79

<223>t7revcfa6/hrpl

<400>79

taatacgactcactatagggagcagggcgtttatcca37

<210>80

<223>t7fwdcyp51

<400>80

taatacgactcactatagggagcagcaagtttgacga37

<210>81

<223>t7revcyp51

<400>81

taatacgactcactatagggaggcagcaaactcggca37

<210>82

<211>43

<223>t7fwddc3000_fusa

<400>82

taatacgactcactatagggagatggctcgtactactccgatt43

<210>83

<223>t7revdc3000_fusa

<400>83

taatacgactcactatagggaggccaaaaggcagtgatagcag43

<210>84

<211>42

<223>t7fwddc3000_sece

<400>84

taatacgactcactatagggagtgaatcccaaggctgaagca42

<210>85

<223>t7revdc3000_sece

<400>85

taatacgactcactatagggagatctctgcacgcgcttcttt42

<210>86

<223>t7fwddc3000_gyrb

<400>86

taatacgactcactatagggagatgagcgagaacaacacgtac43

<210>87

<223>t7revdc3000_gyrb

<400>87

taatacgactcactatagggagccgtatggatggtgatgctga43

<210>88

<211>213

<223>第一链xc_rs06155:xc_1225

<400>88

atgcatcgacatgttcatgagcccgaaatcctagcagacccggcagccttcgaagctgcc60

gaacattggcggcaacgcgatcttgcggtggtgtggcacccctgcacccagatgcgcgag120

cacccgcacacactacccctggtgccgatcgcacgtggcgacggcgcctggctgatcggc180

cacgatggccgccactatctggatgcggtcagc213

<210>89

<223>第二链xc_rs06155:xc_1225

<400>89

gctgaccgcatccagatagtggcggccatcgtggccgatcagccaggcgccgtcgccacg60

tgcgatcggcaccaggggtagtgtgtgcgggtgctcgcgcatctgggtgcaggggtgcca120

caccaccgcaagatcgcgttgccgccaatgttcggcagcttcgaaggctgccgggtctgc180

taggatttcgggctcatgaacatgtcgatgcat213

<210>90

<211>189

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atgagcgttgacgctgccgcgccgacttccgcctccactccgccgcaaccgcctgcgcct60

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ttctgggaacgctttgcgttctacggcattcgttgggcgctggtgctgtacatcgtggcg180

cagttcttc189

<210>91

<223>第二链xc_rs02265=xc_0447

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gaactggggaggcgcaggcggttgcggcggagtggaggcggaagtcggcgcggcagcgtc180

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<211>196

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ccatgaagcggtgctcttcgttggccaccacgatgggtgcgtgcgccgccaccggagcgg60

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gagccgtcgcatcattccctgcctggacgtgcgcgatggccgcgtggtcaagggcgtcaa60

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<210>96

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taatacgactcactatagggagatgagcgatgtccttccga41

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taatacgactcactatagggagccatgaagcggtgctctt40

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<400>104

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<400>105

taatacgactcactatagggagcacgcatagtccaccgaac41

<210>106

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<400>106

taatacgactcactatagggagatggcaaagactcatgaaatc43

<210>107

<223>t7revxc_rs17005=xc_3357

<400>107

taatacgactcactatagggagggtcgaggatcgacgagtag42

<210>108

<211>632

<223>第一链it13(铜绿假单胞菌)

<400>108

gtgtccgtggaactttggcagcagtgcgtggatcttctccgcgatgagctgccgtcccaa60

caattcaacacctggatccgtcccttgcaggtcgaagccgaaggcgacgaattgcgtgtg120

tatgcacccaaccgtttcgtcctcgattgggtgaacgagaaatacctcggtcggcttctg180

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caccacatggtgttcgaggtggtggataactccatcgacgaagcgctggccggttactgc600

agcgaaatcagcatcaccatccatacggggct632

<210>109

<223>第二链it13(铜绿假单胞菌)

<400>109

tcagccgtatggatggtgatgctgatttcgctgcagtaaccggccagcgcttcgtcgatg60

gagttatccaccacctcgaacaccatgtggtgcagaccggtgccatcgtcggtgtcgccg120

atgtacatgccggggcgcttgcgtacggcatccagccccttcagcaccttgatgctggaa180

gagtcgtacgtgttgttctcgctcatatgcggtgatctcgccgggttcggcggcatcttc240

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tccacgcactgctgccaaagttccacggacac632

<210>110

<211>803

<223>第一链it14(铜绿假单胞菌)

<400>110

tgaaagacttgcttaatctgttgaaaaaccagggtcaaatcgaagagttcgatgccatcc60

gtattggcctggcttcgcccgagatgattcgttcctggtctttcggcgaagttaaaaagc120

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gtacttttcggctcaaccaatcctgtatcgcgttctcggtattctcgttctggcggtgat420

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agcgcgcgtcgagattcgcaaggtcgtatggccgagtcgtcaagaaacaactcagaccac540

gctgatcggcatatggctttcgaattgccgccgctgccttacgaaaagaacgcccttgag600

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gtgaacctgaacaacctgatcccgggtaccgagttcgaaggcaagagcctcgaagagatc720

gtcaagagctcctccggcggcatcttcaacaacgccgcccaggtgtggaaccacaccttc780

tactggaactgcctgagccggct803

<210>111

<223>第二链it14(铜绿假单胞菌)

<400>111

tcagggctcaggcagttccagtagaaggtgtggttccacacctgggcggcgttgttgaag60

atgccgccggaggagctcttgacgatctcttcgaggctcttgccttcgaactcggtaccc120

gggatcaggttgttcaggttcaccacgtaggtgttgtggtgcttgtcgtggtggtattcc180

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caacagattaagcaagtctttca803

<210>112

<211>684

<223>第一链it16(铜绿假单胞菌)

<400>112

atgtcccagcctttgctccgcgccctgtttgccccttccagtcgttcgtacgttcccgcc60

gtccttctcagcctggccctcggcatccaggcggcgcacgccgaaaacagcggcgggaac120

gccttcgtcccggccggcaaccagcaggaggcgcactggacgatcaacctcaaggatgcc180

gacatccgcgaattcatcgaccagatttccgaaatcaccggcgagaccttgatcatggcg240

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aatgccgacaacccggcgctgctggccgagctgcaacacaagatcaacaagtggtcggtc420

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tcgacctggaaagcccgcagggct684

<210>113

<223>第二链it16(铜绿假单胞菌)

<400>113

tcagctgcgggctttccaggtcgaagcgaccgctgacctggtcgttgaccttgtcactga60

cgatcaccgaggcatcgtagttggcgccgaagttggccagcacgtcgcgcaggctttcgc120

cctgcgccacatagtcgtaaggcaggctgggccagtccagcggctgcgcgcgcaagaccg180

cgccaggcagcagcgccagcagtccgccgatcagcaggcggcgcatatgcgcgcacgggt240

caccgtcgagttgatgttgtagatgaccgaccacttgttgatcttgtgttgcagctcggc300

cagcagcgccgggttgtcggcattgtcggtcccctgcaaggccttgatcgcgtcgttgac360

gtccttgttcgctgcgttggcctgctccttcagggcattggccacggtatcgagggtatt420

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ggcgcggagcaaaggctgggacat684

<210>114

<211>643

<223>第一链it18(铜绿假单胞菌)

<400>114

gacatccgcgaattcatcgaccagattgatcatgcaaggagccaaatctcttggccgaaa240

gcagataacgtcttgtcattggaacattccaactttcgaatacagggtaaacaaggaaga300

gggcgtatatgttctgctcgagggcgaactgaccgtccaggacatcgattccactttttg360

cctggcgcctggcgagttgcttttcgtccgccgcggaagctatgtcgtaagtaccaaggg420

aaaggacagccgaatacgcatatgccacgttgtagtacccgttccgcccagcgcctgtct480

ccgctgttcctggtcctgtcgctggccgtcctcggcctggcgccgccggtccatccggca540

cctgccgagactgccgccgcgcaagaggaagagcagtggacgatcaacatgaaggatgcc600

gagatcggcgacttcatcgagcaggtatcgagcatcagcggct643

<210>115

<223>第二链it18(铜绿假单胞菌)

<400>115

tcaggctgatgctcgatacctgctcgatgaagtcgccgatctcggcatccttcatgttga60

tcgtccactgctcttcctcttgcgcggcggcagtctcggcaggtgccggatggaccggcg120

gcgccaggccgaggacggccagcgacaggaccaggaacagcggagacaggcgctgggcgg180

aacgggtactacaacgtggcatatgcgtattcggctgtcctttcccttggtacttacgac240

atagcttccgcggcggacgaaaagcaactcgccaggcgccaggcaaaaagtggaatcgat300

gtcctggacggtcagttcgccctcgagcagaacatatacgccctcttccttgtttaccct360

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ggctccttgcatgatcaatctggtcgatgaattcgcggatgtcggcatccttgaggttga480

tcgtccagtgcgcctcctgctggttgccggccgggacgaaggcgttcccgccgctgtttt540

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gactggaaggggcaaacagggcgcggagcaaaggctgggacat643

<210>116

<211>637

<223>第一链it21(福氏志贺氏菌)

<400>116

aatgatcaaggcgacggacagaaaactggtagtaggactggaaattggtaccgcgaaggt60

tgccgctttagtaggggaagttctgcccgacggtatggtcaatatcattggcgtgggcag120

ctgcccgtcacgtggtatggataaaggtggggtgaacgacctcgaatccgtggtcaagtg180

cgtacaacgcgccattgaccaggcagaattgatggcaggatctttgtggttggcgtgttt240

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gcatgatggattgcaaaaaagcactgactgaagctaacggcgacatcgagctggcaatcg540

aaaacatgcgtaagtccggtgctattaaagcagcgaaaaaagcaggcaacgttgctgctg600

acggcgtgatcaaaaccaaaatcgacggcaactggct637

<210>117

<211>636

<223>第二链it21(福氏志贺氏菌)

<400>117

tcagagttgccgtcgattttggttttgatcacgccgtcagcagcaacgttgcctgctttt60

ttcgctgctttaatagcaccggacttacgcatgttttcgattgccagctcgatgtcgccg120

ttagcttcagtcagtgcttttttgcaatccatcatgcctgcgccagtacgctcacgcagc180

tcttttaccagggatgcggtaatttcagccaatgcaggtgtataacctgggccactccac240

cattatgcaatcagcgtggaaacgcgggcagaaagttaccattcacggctgggcctacgg300

cattcacgacggcttgctgcgtgatctggatgttaccgccaccaaccgcgaaacccttga360

gcaacgttaccgtcacgggatttccaacctcaagctgaaacacgccaaccacaaagatcc420

tgccatcaattctgcctggtcaatggcgcgttgtacgcacttgaccacggattcgaggtc480

gttcaccccacctttatccataccacgtgacgggcagctgcccacgccaatgatattgac540

cataccgtcgggcagaacttcccctactaaagcggcaaccttcgcggtaccaatttccag600

tcctactaccagttttctgtccgtcgccttgatcat636

<210>118

<211>686

<223>第一链it26(福氏志贺氏菌)

<400>118

taccgggggtaccactacgccttcacgcggcgcttcaggattcggcgctggcagattcat60

caacttcgccagaatgctcgccagtttcaggcgcatttccggacgacggacgatcatgtc120

gatcgcgcctttctcgatcaggaattcactgcgctggaatctaggcggcagtttttcgcg180

aacggtctgttcgataacacgcggaccggcaaagccgattaacgcttgatctttcttgat240

gtgcttcatcagacgcttacgtttacgcatctgggttggcgtcagggtgttacgcttgtt300

cgcatacgggttttccccttctttgaactgaatacgaatcggcgatcccattacgtccag360

cgatttgcggaagtagttcatcaagtagcgcttgtaggaatcaggcaggtctttcacctg420

attaccgtgaatcaccacaatcggcggggcattttttatcgtcaaccaatgggctggcgt480

cgtgttctgcttcgatctcttcagcaggaagtggggcgggttcagcgtctggcgtaacaa540

aggtttcggtagatactgccagcggctggccaattttcgtgacagacaggctttccagtt600

gctcaaccagattcactttacccggtgcaaacaggttgataacggtggaaccgagtttaa660

agcgacccatttcctggcctttggct686

<210>119

<223>第二链it26(福氏志贺氏菌)

<400>119

tcagaaaggccaggaaatgggtcgctttaaactcggttccaccgttatcaacctgtttgc60

accgggtaaagtgaatctggttgagcaactggaaagcctgtctgtcacgaaaattggcca120

gccgctggcagtatctaccgaaacctttgttacgccagacgctgaacccgccccacttcc180

tgctgaagagatcgaagcagaacacgacgccagcccattggttgacgataaaaaatgccc240

cgccgattgtggtgattcacggtaatcaggtgaaagacctgcctgattcctacaagcgct300

acttgatgaactacttccgcaaatcgctggacgtaatgggatcgccgattcgtattcagt360

tcaaagaaggggaaaacccgtatgcgaacaagcgtaacaccctgacgccaacccagatgc420

gtaaacgtaagcgtctgatgaagcacatcaagaaagatcaagcgttaatcggctttgccg480

gtccgcgtgttatcgaacagaccgttcgcgaaaaactgccgcctagattccagcgcagtg540

aattcctgatcgagaaaggcgcgatcgacatgatcgtccgtcgtccggaaatgcgcctga600

aactggcgagcattctggcgaagttgatgaatctgccagcgccgaatcctgaagcgccgc660

gtgaaggcgtagtggtacccccggta686

<210>120

<211>687

<223>第一链it27(福氏志贺氏菌)

<400>120

aatgacggttagctcaggcaatgaaactttgactatcgatgaagggcaaattgcttttat60

agagcgaaatatacaaataaacgtctccataaaaaaatctgatagcattaatccatttga120

gattataagccttgacagaaatttattattaagcattattagaataatggaaccaattta180

ttcatttcaacactcctattctgaggagaaaagggggttagatcatggtggatttgtgca240

acgacttgttaagtataaaggaaggccaaaagaaagagtttacactccattctggtaata300

aagtttcctttatcaaagccaagattcctcataaaaggatccaagatttaaccttcgtca360

accaaaaaacgaatgtacgcgatcaagaatccctaacagaagaatcactagccgatatca420

taaaaactataaagctacaacaattcttccctggcatggtagcggtgctgaccataacgg480

tgatggtggtgaggctgttacaggagacaatctgtttataataaatggagaaattatttc540

aggtggacatggtggcgatagttatagtgatagtgatggggggaatggaggtgatgccgt600

cacaggagtcaatctacccataatcaacaaagggactatttccggtggtaatggaggtaa660

caattatggtgagggtgatggcgggct687

<210>121

<223>第二链it27(福氏志贺氏菌)

<400>121

tcagcgccatcaccctcaccataattgttacctccattaccaccggaaatagtccctttg60

ttgattatgggtagattgactcctgtgacggcatcacctccattccccccatcactatca120

ctataactatcgccaccatgtccacctgaaataatttctccatttattataaacagattg180

tctcctgtaacagcctcaccaccatcaccgttatggtcagcaccgctaccatgccaggga240

agaattgttgtagctttatagtttttatgatatcggctagtgattcttctgttagggatt300

cttgatcgcgtacattcgttttttggttgacgaaggttaaatcttggatccttttatgag360

gaatcttggctttgataaaggaaactttattaccagaatggagtgtaaactctttctttt420

ggccttcctttatacttaacaagtcgttgcacaaatccaccatgatctaacccccttttc480

tcctcagaataggagtgttgaaatgaataaattggttccattattctaataatgcttaat540

aataaatttctgtcaaggcttataatctcaaatggattaatgctatcagatttttttatg600

gagacgtttatttgtatatttcgctctataaaagcaatttgcccttcatcgatagtcaaa660

gtttcattgcctgagctaaccgtcatt687

<210>122

<211>217

<223>第一链fusa(福氏志贺氏菌)

<400>122

atgatcaaggcgacggacagaaaactggtagtaggactggaaattggtaccgcgaaggtt60

gccgctttagtaggggaagttctgcccgacggtatggtcaatatcattggcgtgggcagc120

tgcccgtcacgtggtatggataaaggtggggtgaacgacctcgaatccgtggtcaagtgc180

gtacaacgcgccattgaccaggcagaattgatggcag217

<210>123

<223>第二链fusa(福氏志贺氏菌)

<400>123

ctgccatcaattctgcctggtcaatggcgcgttgtacgcacttgaccacggattcgaggt60

cgttcaccccacctttatccataccacgtgacgggcagctgcccacgccaatgatattga120

ccataccgtcgggcagaacttcccctactaaagcggcaaccttcgcggtaccaatttcca180

gtcctactaccagttttctgtccgtcgccttgatcat217

<210>124

<211>200

<223>第一链can(福氏志贺氏菌)

<400>124

tttgtggttggcgtgtttcagcttgaggttggaaatcccgtgacggtaacgttgctcaag60

ggtttcgcggttggtggcggtaacatccagatcacgcagcaagccgtcgtgaatgccgta120

ggcccagccgtgaatggtaactttctgcccgcgtttccacgctgattgcataatggtgga180

gtggcccaggttatacacct200

<210>125

<223>第二链can(福氏志贺氏菌)

<400>125

aggtgtataacctgggccactccaccattatgcaatcagcgtggaaacgcgggcagaaag60

ttaccattcacggctgggcctacggcattcacgacggcttgctgcgtgatctggatgtta120

ccgccaccaaccgcgaaacccttgagcaacgttaccgtcacgggatttccaacctcaagc180

tgaaacacgccaaccacaaa200

<210>126

<211>207

<223>第一链tsf(福氏志贺氏菌)

<400>126

tggctgaaattaccgcatccctggtaaaagagctgcgtgagcgtactggcgcaggcatga60

tggattgcaaaaaagcactgactgaagctaacggcgacatcgagctggcaatcgaaaaca120

tgcgtaagtccggtgctattaaagcagcgaaaaaagcaggcaacgttgctgctgacggcg180

tgatcaaaaccaaaatcgacggcaact207

<210>127

<223>第二链tsf(福氏志贺氏菌)

<400>127

agttgccgtcgattttggttttgatcacgccgtcagcagcaacgttgcctgcttttttcg60

ctgctttaatagcaccggacttacgcatgttttcgattgccagctcgatgtcgccgttag120

cttcagtcagtgcttttttgcaatccatcatgcctgcgccagtacgctcacgcagctctt180

ttaccagggatgcggtaatttcagcca207

<210>128

<211>227

<223>第一链accd(福氏志贺氏菌)

<400>128

aacggtctgttcgataacacgcggaccggcaaagccgattaacgctt227

<210>129

<223>第二链accd(福氏志贺氏菌)

<400>129

aagcgttaatcggctttgccggtccgcgtgttatcgaacagaccgttcgcgaaaaactgc60

cgcctagattccagcgcagtgaattcctgatcgagaaaggcgcgatcgacatgatcgtcc120

gtcgtccggaaatgcgcctgaaactggcgagcattctggcgaagttgatgaatctgccag180

cgccgaatcctgaagcgccgcgtgaaggcgtagtggtacccccggta227

<210>130

<223>第一链der(福氏志贺氏菌)

<400>130

tttcttgatgtgcttcatcagacgcttacgtttacgcatctgggttggcgtcagggtgtt60

acgcttgttcgcatacgggttttccccttctttgaactgaatacgaatcggcgatcccat120

tacgtccagcgatttgcggaagtagttcatcaagtagcgcttgtaggaatcaggcaggtc180

tttcacctgattaccgtgaatcaccacaatcggcggg217

<210>131

<223>第二链der(福氏志贺氏菌)

<400>131

cccgccgattgtggtgattcacggtaatcaggtgaaagacctgcctgattcctacaagcg60

ctacttgatgaactacttccgcaaatcgctggacgtaatgggatcgccgattcgtattca120

gttcaaagaaggggaaaacccgtatgcgaacaagcgtaacaccctgacgccaacccagat180

gcgtaaacgtaagcgtctgatgaagcacatcaagaaa217

<210>132

<211>230

<223>第一链psd(福氏志贺氏菌)

<400>132

tttttatcgtcaaccaatgggctggcgtcgtgttctgcttcgatctcttcagcaggaagt60

ggggcgggttcagcgtctggcgtaacaaaggtttcggtagatactgccagcggctggcca120

attttcgtgacagacaggctttccagttgctcaaccagattcactttacccggtgcaaac180

aggttgataacggtggaaccgagtttaaagcgacccatttcctggccttt230

<210>133

<223>第二链psd(福氏志贺氏菌)

<400>133

aaaggccaggaaatgggtcgctttaaactcggttccaccgttatcaacctgtttgcaccg60

ggtaaagtgaatctggttgagcaactggaaagcctgtctgtcacgaaaattggccagccg120

ctggcagtatctaccgaaacctttgttacgccagacgctgaacccgccccacttcctgct180

gaagagatcgaagcagaacacgacgccagcccattggttgacgataaaaa230

<210>134

<211>229

<223>第一链virb(福氏志贺氏菌)

<400>134

atggtggatttgtgcaacgacttgttaagtataaaggaaggccaaaagaaagagtttaca60

ctccattctggtaataaagtttcctttatcaaagccaagattcctcataaaaggatccaa120

gatttaaccttcgtcaaccaaaaaacgaatgtacgcgatcaagaatccctaacagaagaa180

tcactagccgatatcataaaaactataaagctacaacaattcttccctg229

<210>135

<223>第二链virb(福氏志贺氏菌)

<400>135

cagggaagaattgttgtagctttatagtttttatgatatcggctagtgattcttctgtta60

gggattcttgatcgcgtacattcgttttttggttgacgaaggttaaatcttggatccttt120

tatgaggaatcttggctttgataaaggaaactttattaccagaatggagtgtaaactctt180

tcttttggccttcctttatacttaacaagtcgttgcacaaatccaccat229

<210>136

<211>220

<223>第一链virf(福氏志贺氏菌)

<400>136

ttcatttcaacactcctattctgaggagaaaagggggtta220

<210>137

<223>第二链virf(福氏志贺氏菌)

<400>137

taacccccttttctcctcagaataggagtgttgaaatgaataaattggttccattattct60

aataatgcttaataataaatttctgtcaaggcttataatctcaaatggattaatgctatc120

agatttttttatggagacgtttatttgtatatttcgctctataaaagcaatttgcccttc180

atcgatagtcaaagtttcattgcctgagctaaccgtcatt220

<210>138

<211>226

<223>第一链icsa(福氏志贺氏菌)

<400>138

ggtagcggtgctgaccataacggtgatggtggtgaggctgttacaggagacaatctgttt60

ataataaatggagaaattatttcaggtggacatggtggcgatagttatagtgatagtgat120

ggggggaatggaggtgatgccgtcacaggagtcaatctacccataatcaacaaagggact180

atttccggtggtaatggaggtaacaattatggtgagggtgatggcg226

<210>139

<223>第二链icsa(福氏志贺氏菌)

<400>139

cgccatcaccctcaccataattgttacctccattaccaccggaaatagtccctttgttga60

ttatgggtagattgactcctgtgacggcatcacctccattccccccatcactatcactat120

aactatcgccaccatgtccacctgaaataatttctccatttattataaacagattgtctc180

ctgtaacagcctcaccaccatcaccgttatggtcagcaccgctacc226

<210>140

<211>203

<223>第一链spa47(福氏志贺氏菌)

<400>140

gagctatacaaaattgctcactcaattatcttttcctaatagaatctcggggccaatctt60

ggaaacaagtcttagcgatgtttcgattggtgagatttgtaacattcaggctggaattga120

aagtaatgaaattgttgcaagagctcaggttgtaggatttcatgatgaaaaaacaatatt180

aagcttgattggaaattctcgtg203

<210>141

<223>第二链spa47(福氏志贺氏菌)

<400>141

cacgagaatttccaatcaagcttaatattgttttttcatcatgaaatcctacaacctgag60

ctcttgcaacaatttcattactttcaattccagcctgaatgttacaaatctcaccaatcg120

aaacatcgctaagacttgtttccaagattggccccgagattctattaggaaaagataatt180

gagtgagcaattttgtatagctc203

<210>142

<211>240

<223>第一链mukb(福氏志贺氏菌)

<400>142

attgaacgcggtaaatttcgctcactgacgctgattaactggaacggcttttttgcccga60

acttttgaccttgacgagctggtcacgacgctttccggcggtaacggggcgggtaaatcc120

accacgatggcggcgttcgttacggcgctgatccccgacctgaccctgctgcatttccgt180

aacactacggaagccggggccaccagcggttcgcgcgataaaggtctgcacggtaagctg240

<210>143

<223>第二链mukb(福氏志贺氏菌)

<400>143

cagcttaccgtgcagacctttatcgcgcgaaccgctggtggccccggcttccgtagtgtt60

acggaaatgcagcagggtcaggtcggggatcagcgccgtaacgaacgccgccatcgtggt120

ggatttacccgccccgttaccgccggaaagcgtcgtgaccagctcgtcaaggtcaaaagt180

tcgggcaaaaaagccgttccagttaatcagcgtcagtgagcgaaatttaccgcgttcaat240

<210>144

<223>第一链ybit(福氏志贺氏菌)

<400>144

gtttccagtaacgtcaccatgcagttcggcagtaagccgttgtttgaaaacatttccgtc60

aaattcggcggcggcaaccgttacggcctgattggcgcgaacggtagtggtaaatccacc120

tttatgaagattctcggcggcgaccttgagccgacgctgggtaacgtttccctcgatccc180

aacgagcgcattggtaagct200

<210>145

<223>第二链ybit(福氏志贺氏菌)

<400>145

agcttaccaatgcgctcgttgggatcgagggaaacgttacccagcgtcggctcaaggtcg60

ccgccgagaatcttcataaaggtggatttaccactaccgttcgcgccaatcaggccgtaa120

cggttgccgccgccgaatttgacggaaatgttttcaaacaacggcttactgccgaactgc180

atggtgacgttactggaaac200

<210>146

<211>33

<223>pak_dnaac_fw

<400>146

aggtctcaggctgtgtccgtggaactttggcag33

<210>147

<211>30

<223>pak_dnaac_rv

<400>147

aggtctcagatcaactgaccctcccgcgtt30

<210>148

<211>32

<223>pak_dnanc_fw

<400>148

aggtctcagatcatgcatttcaccattcaacg32

<210>149

<223>pak_dnanc_rv

<400>149

aggtctcaatgcggtgatctcgccgggt28

<210>150

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<400>150

aggtctcagcatatgagcgagaacaacacgtac33

<210>151

<223>pak_gyrbc_rv

<400>151

aggtctcactgaccgtatggatggtgatgctga33

<210>152

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aggtctcaaacagtgtccgtggaactttggcag33

<210>153

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aggtctcaagccccgtatggatggtgatgctga33

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aggtctcatcagccgtatggatggtgatgctga33

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aggtctcagatcatgaatgccaaggcagaagc32

<210>159

<223>pak_secec_rv

<400>159

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<210>160

<211>31

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aggtctcagcagtgaaagacttgcttaatctgttgaa37

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<400>166

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<400>174

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<210>178

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<223>sf_derb_rv

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<223>sf_virfb_rv

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<400>194

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<223>sf_virbb_rv

<400>195

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<400>202

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<211>38

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<400>206

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<400>207

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<400>208

taatacgactcactatagggagatgaatgccaaggcagaagc42

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<210>210

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<400>212

taatacgactcactatagggagatgatcaaggcgacggacag42

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<400>224

taatacgactcactatagggagaatgacggttagctcaggca42

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<223>t7聚合酶sf_virf_rev

<400>225

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taatacgactcactatagggagattgaacgcggtaaatttcg42

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<223>t7聚合酶sf_mukb_rev

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<400>234

taatacgactcactatagggaggtttccagtaacgtcaccatgc44

<210>235

<223>t7聚合酶sf_ybit_rev

<400>235

taatacgactcactatagggagagcttaccaatgcgctcgt41

<210>236

<223>pak-dnaa-qf

<400>236

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<210>237

<223>pak-dnaa-qr

<400>237

gtgggtctgcgatgggac18

<210>238

<223>pak-dnan-qf

<400>238

ggtcgcgtggtactggaa18

<210>239

<223>pak-dnan-qr

<400>239

ttctgctcttcgacacggat20

<210>240

<223>pak-gyrb-qf

<400>240

cagcatcaccatccatacgg20

<210>241

<223>pak-gyrb-qr

<400>241

ggaggacggtcatgatcact20

<210>242

<223>pak-rpoc-qf

<400>242

gtgtgatctgcgagaagtgc20

<210>243

<223>pak-rpoc-qr

<400>243

agcgacttcaggaaccagat20

<210>244

<223>pak-sece-qf

<400>244

tatggccgagtcgtcaagaa20

<210>245

<223>pak-sece-qr

<400>245

gaaaccaaccaacccagcag20

<210>246

<223>pak-sodb-qf

<400>246

ggaaccacaccttctactgga21

<210>247

<223>pak-sodb-qr

<400>247

cggaagtcttggtgaactct20

<210>248

<223>用于同时靶向ptodc3000的luxa和luxb基因的luxa/luxbdsrna的第一臂的序列

<400>248

atgaaatttggaaactttttgcttacataccaacctccccaattttctcaaacagaggta60

atgaaacgtttggttaaattaggtcgcatctctgaggagtgtggttttgataccgtatgg120

ttactggagcatcatttcacggagtttggtttgcttggtaacccttatgtcgctgctgca180

tatttacttggcgcgactaaaaaattgaatgtaggaactgccgctattgttcttcccaca240

gcccatccagatgaaatttggattgttcttccttaacttcatcaattcaacaactgttca300

agaacaaagtatagttcgcatgcaggaaataacggagtatgttgataagttgaattttga360

acagattttagtgtatgaaaatcatttttcagataatggtgttgtcggcgctcctctgac420

tgtttctggttttctgctcggtttaacagagaaaattaaaattggttcattaaatcacat480

cattacaactcatcatcctg500

<210>249

<223>用于同时靶向ptodc3000的luxa和luxb基因的luxa/luxbdsrna的第二臂的序列

<400>249

caggatgatgagttgtaatgatgtgatttaatgaaccaattttaattttctctgttaaac60

cgagcagaaaaccagaaacagtcagaggagcgccgacaacaccattatctgaaaaatgat120

tttcatacactaaaatctgttcaaaattcaacttatcaacatactccgttatttcctgca180

tgcgaactatactttgttcttgaacagttgttgaattgatgaagttaaggaagaacaatc240

caaatttcatctggatgggctgtgggaagaacaatagcggcagttcctacattcaatttt300

ttagtcgcgccaagtaaatatgcagcagcgacataagggttaccaagcaaaccaaactcc360

gtgaaatgatgctccagtaaccatacggtatcaaaaccacactcctcagagatgcgacct420

aatttaaccaaacgtttcattacctctgtttgagaaaattggggaggttggtatgtaagc480