清香型小曲酒又称“川法小曲酒”,是用高粱、玉米等粮谷类原料,以清香型小曲作糖化发酵剂酿制的白酒，具有风格独特,清香怡人的特点[1]。邛崃米曲是我国小曲中的著名曲种之一,传统邛崃米曲中添加了72味中药成分,使所酿小曲酒极具特色风味。黄酒是我国历史悠久的传统发酵酒,与啤酒和葡萄酒并称为世界3大发酵酒,其风味独特、营养丰富,酒精含量8%～15%[2]。
“曲乃酒之骨”,酒曲中的微生物决定酒曲品质。TANG等[6]利用高通量测序技术分析了小曲中微生物多样性,结果显示葡萄球菌属(Staphylococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、根霉属(Rhizopus)和假丝酵母属(Candida)为优势菌属。唐洁[7]利用变性梯度凝胶电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis,DGGE)技术分析了清香型小曲微生物群落结构,结果发现小曲中主要的细菌菌属为乳酸菌属、芽胞菌属和葡萄菌属,主要酵母为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),主要霉菌有米根霉(Rhizopusoryzae)和土曲霉(Aspergillusterreus)。目前有关国内曲酒的研究已有很多,但鲜有与日本酒曲的对比研究,而且国内酒曲研究较多集中于大曲[8-10]。本研究选取的8种酒曲具有中日酒曲的典型代表性,且均制曲发酵周期较短,类似于中国小曲类酒曲,因此很有必要对其进行一个全面的对比研究。
宏基因组学技术[11]是针对样品中全部微生物的总DNA,从基因组文库中筛选功能基因或直接进行高通量测序,来分析微生物多样性并挖掘功能基因。近年来,宏基因组测序已广泛应用于泡菜、奶酪、香醋、酒、发酵香肠等发酵食品的功能微生物研究[11-12]。本研究采用宏基因组学技术对8种酒曲中微生物群落结构进行研究,旨在解析中日酒曲微生物种群结构的差异,同时对8种酒曲进行了基因功能预测,为后续筛选特定功能微生物,并进行功能强化曲制作工艺优化,开发出功能型强化酒曲提供了理论基础。
酒曲样品：邛崃米曲MB,四川省邛崃市某酒厂制曲车间；清香型小曲QX,四川省泸州市某酒厂制曲车间；黄酒麦曲FHC,四川省南充市某黄酒厂制曲车间；黄酒麦曲TH,浙江省绍兴市某黄酒厂制曲车间；日本清酒米曲NP_MS、日本烧酒米曲NP_SJR、日本烧酒麦曲NP_SJW、日本泡盛酒曲NP_SY,均由日本合作高校采集并邮寄。
主要试剂：NaOH、无水乙酸钠、冰乙酸、KI、可溶性淀粉、CuSO4·5H2O、酒石酸钾钠、葡萄糖、甲醛溶液(37%～40%),均为分析纯,成都科龙化工试剂厂；E.Z.N.A.SoilDNAKit,美国Omega公司。
PHS-3C酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司；DYY-5琼脂糖凝胶电泳仪,北京六一仪器厂；LegendMicro17R高速冷冻离心机,美国赛默飞公司；GeneAmp9700型PCR仪,美国ABI公司；IlluminaHiseqPE150高通量测序平台,美国Illumina公司。
1.3.1中日酒曲制曲工艺
中国酒曲：邛崃米曲是以大米为原料,经浸泡、碾碎、加入曲母和72味中草药拌曲、制胚、进箱培菌、出箱烘干等流程,经约90h发酵而成的饼曲；清香型小曲是以麸皮、米糠和米粉为原料,经碾细、加入种曲拌和、踩曲、切曲、生火入房、保温、通气、关烧、烘曲等流程,经约90h发酵而成的散曲；黄酒麦曲是以小麦为原料,经过轧碎、拌水、踩曲、压制成型、入房堆积等流程,经7d左右发酵而成的块曲。
日本酒曲：清酒米曲[13]是以日本米为原料,经浸米、蒸米、干燥、冷却、入室堆置、加入种曲揉碎、搓拌翻转、重叠堆置、调换曲盘位置、出室放冷等流程,经约46h发酵而成的散曲；烧酒曲是以日本米或小麦为原料,经浸泡、蒸煮、冷却、配种、恒温恒湿堆积培养、摊开混匀、再堆积、翻曲、干燥等流程,经约40h发酵而成的散曲；泡盛酒曲是以泰国长粒米为原料,经浸泡、蒸米、配种、40℃恒温培养、干燥等流程,经约40h发酵而成的散曲。
1.3.2理化指标检测
参照QB/T4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[14]测定样品中水分、糖化力、液化力、发酵力和酸度。还原糖测定采用标准葡萄糖液反滴定的还原糖测定法[15]。
1.3.3DNA提取及测序
采用试剂盒提取酒曲微生物宏基因组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA完整性,用NanoDrop2000检测纯度,用QuantusFluorometer(Picogreen)检测浓度。建立宏基因组测序文库,送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序,测序平台为IlluminaHiseqPE150。
1.3.4测序数据分析
表1八种中日酒曲理化指标
Table1Physicochemicalindexesof8kindsofChineseJiuquandJapanesekoji
经Illumina平台测序后从8个样品中共得到50155557812bp的原始碱基数；在原始测序数据中存在着部分低质量数据,为提高后续分析结果的准确可靠,需对原始测序数据进行质控预处理。具体测序及质控结果情况如表2。
表2原始数据及质控结果
Table2Rawdataandqualitycontrolresults
注：RawReads,原始数据序列长度；RawBase,原始数据序列碱基总数,bp；CleanReads,过滤后的序列长度；Cleaned,过滤后的碱基数占原始序列碱基总数的百分比,%
由图1-a可知,在门水平上,MB和QX主要为子囊菌门(Ascomycota,分别为9.29%、8.86%)、厚壁菌门(Firmicutes,分别为3.27%、5.21%)和变形菌门(Proteobacteria,分别为0.22%、1.59%)。TH主要为放线菌门(Actinobacteria,82.66%)、厚壁菌门(2.57%)、担子菌门(Basidiomycota,2.51%)和变形菌门(1.58%)。FHC主要为变形菌门(35.17%)、厚壁菌门(23.58%)、子囊菌门(7.46%)和担子菌门(2.48%)。日本酒曲均主要为子囊菌门(均>93%),NP_SJR和NP_SJW还有少量厚壁菌门(分别为6.38%、0.89%)。
由图1-b可知,在属水平上,MB和QX主要为根霉属(分别为81.39%、78.70%)。TH主要为糖多孢菌属(Saccharopolyspora,59.70%)。陈青柳[12]研究发现,糖多孢菌属(54.77%)是绍兴黄酒麦曲和发酵中特有的优势菌属,与本研究结果一致,其在黄酒发酵过程中的具体作用值得进一步研究。FHC物种组成相对最为丰富,主要有横梗霉属(Lichtheimia,25.02%)、葡萄球菌属(11.33%)、肠杆菌属(Enterobacter,9.51%)、克雷伯氏菌属(Klebsiella,9.37%)和曲霉属(Aspergillus,7.14%)。4种日本酒曲均主要为曲霉属(均>91%),NP_SJR还有少量葡萄球菌属(6.30%)。这与“日本酒神”坂口谨一郎[20]指出的中国为中心的东亚大陆到东南亚的曲的主要菌为根霉属和毛霉属(Mucor),日本酒曲的主要菌为曲霉属一致。由于曲霉属等丝状真菌有利于糖化酶的产生,因此日本酒曲的糖化力总体高于中国酒曲(表1),与徐岩等[21]的研究结果一致。
a-门水平；b-属水平；c-种水平
图1八种中日酒曲在门、属和种水平上的微生物群落结构
Fig.1Microbialcommunitystructureof8kindsofChineseJiuquandJapanesekojibasedonphylum,genusandspecieslevel
图2八种中日酒曲微生物群落和理化因子的CCA分析
Fig.2TheCCAbetweenmicrobialcommunitiesandphysicochemicalfactorsof8kindsofChineseJiuquandJapanesekoji
如图3所示,在KEGG一级代谢中共发现微生物代谢功能6类：代谢、人类疾病、生物体系统、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程。8种中日酒曲均以代谢为绝对优势功能(均>27%),说明酒曲内部微生物代谢活动均较为活跃,为各自风味的形成提供了物质基础。
图3八种中日酒曲基因表达的KEGG一级代谢功能分析
Fig.3KEGGanalysisofgeneexpressiononfirstlevelof8kindsofChineseJiuquandJapanesekoji
图4八种中日酒曲代谢途径的基因表达KEGG二级代谢功能差异分析
Fig.4KEGGvarianceanalysisofgeneexpressiononsecondlevelbetweenmetabolismofChineseJiuquandJapanesekoji