升。进行两轮PCR的一个优势在于：有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。
在Taq酶的选择上，常规TaqDNA聚合酶（货号：10342053）便能够完成，如果需要更好
的性能和更便捷的操作，也可以选择DreamTaq热启动DNA聚合酶（货号：EP1701）或
PlatinumIITaq热启动DNA聚合酶（货号：14966001）。
图6.3巢式PCR
6.4快速PCR
效率。快速循环条件尤其适用于具有高扩增能力的DNA聚合酶，这类聚合酶在每个结合
DNA聚合酶（货号：14966001），其扩增速率可以达到15sec/kb，同时耐受各种常见抑制
剂，有很高的特异性，灵敏度及产量。此外，如果引物的退火和延伸温度相差无几，则可
当使用低合成能力的Taq聚合酶时，如Taq聚合酶，快速循环条件可能适用于<500bp左
减的方式优化PCR。每个目的片段和引物对都可能会产生变化结果，所以需要在特定条
件下对快速PCR进行优化。
应注意，非高度热稳定的酶在这种高温环境下易于变性。
48|聚合酶链式反应
仅供科学研究使用
图6.4使用低合成能力和高合成能力DNA聚合酶扩增来自人类gDNA3.8kb片段的结果对比
6.5直接PCR
直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR中，在高温
变性阶段，诸如细胞、组织等样本在特殊的缓冲液中被裂解，释放出DNA。因此这种方法
图6.5常规PCR和直接PCR对比
推荐使用具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖
聚合酶链式反应|49仅供科学研究使用
也随DNA一起被释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。而具有高合成能力的DNA聚合
酶能够耐受这类抑制剂，使直接PCR扩增成为可能。具有高合成能力的酶通常具有更高
的灵敏度，因此可从未纯化的样品中成功扩增微量DNA。
直接PCR可以选择PlatinumIITaq热启动DNA聚合酶（货号：14966001）配合自己
的反应体系完成扩增，也可以选择优化好的预混液：Platinum直接PCR通用预混液（货
号：A44647100），该预混液由InvitrogenPlatinumIITaq热启动DNA聚合酶配制而成，具
有高抑制剂耐受性、快速DNA合成能力和高灵敏度扩增能力。
6.6高GC含量PCR
具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富
含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增
时“卡顿”并干扰DNA合成。
为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶
能够读取到序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加剂或
辅助溶剂来帮助DNA变性（图6.6）。然而，这些试剂通常会降低引物的Tm，所以退火温
度也需进行相应的调整。
高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR（
图6.6）。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（
如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增。例如：PlatinumSuperFi
IIDNA聚合酶（货号：12361010）非常适用于高难度靶标扩增，包括高GC含量的片
段。PlatinumSuperFiIIPCR预混液（货号：12368010）其酶的强扩增能力和使用特殊
的缓冲液，可以高特异性地扩增高GC含量的靶标而无需添加DNA解链添加剂。
图6.6不同GC含量人类gDNA区域的扩增。（A）使用低合成能力DNA聚合酶扩增GC含量为76%的~0.8kb
靶标。增加DMSO添加剂的用量，可提高特异性。（B）使用高合成能力DNA聚合酶扩增GC含量不同的七个片
段。只有GC含量为70%和76%的片段使用GC增强剂
50|聚合酶链式反应
6.7多重PCR
多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多重PCR不仅意味着节省时
间、试剂和样品，还能够同时对比多个扩增子（图6.7.1）。
图6.7.1单个PCR和多重PCR的比较。在单个PCR中，每个反应使用一个引物对扩增一个目的片段。而在多重
PCR中，每个反应使用多个引物对扩增多个目的片段
当一个PCR管中有多个引物对时，如在多重PCR中，因无法仅针对一个引物对或目的片
段进行反应优化，而是要考虑到所有引物和靶标，所以可能会出现非特异性扩增和效率
降低。因此，为尽量减少由非特异性扩增导致的错配，应对引物进行精心设计。首先，引
物序列应尽可能与其目的序列一一对应，并且所有引物的Tm相差不应超过5°C。在多重
PCR开始前，应利用单个PCR反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。此外，扩增子
应具有不同的大小，从而能够通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。除了引物设计和扩增子
大小，使用热启动DNA聚合酶和专为多重PCR设计的缓冲液也将有助于获得成功的PCR
结果和提高反应特异性（图6.7.2）。如：PlatinumSuperFiIIDNA聚合酶（货号：12361010
）和PlatinumIITaq热启动DNA聚合酶就是两款非常适合多重PCR的酶。其中Platinum
多重PCR预混液（货号：4464270），是针对多重PCR优化好的预混液，无需更多优化，一
次可以扩增多达20个扩增子，有效减少引物二聚体和非特异性结合的概率。
聚合酶链式反应|51仅供科学研究使用
图6.7.2通过凝胶电泳对比单个和多重PCR结果
尽管多重PCR常作为终点法PCR，但由于其在多重标记和检测中的能力，将其用于实时
荧光定量PCR也变得越来越流行。另外，多重实时荧光定量PCR也常被用于遗传标志物
的检测，用于人类身份鉴定。
6.8长片段PCR
长片段PCR通常是指扩增大于5kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用TaqDNA聚合酶
（用于快速延伸）和高保真酶（用于提高准确性）的混合物。
准确的长片段PCR。通过在DNA聚合酶中设计一个较强的DNA结合结构域，从而使其能
的保真度（如，>100倍的Taq聚合酶保真度）还有助于确保长片段扩增的低错误率。
PlatinumSuperFiIIDNA聚合酶（货号：12361010），对大于20kb的长片段也有很强的
扩增能力，是目前解决长片段扩增的最佳选择。PlatinumSuperFiIIPCR预混液（货
号：12368010），为优化好的含有PlatinumSuperFiIIDNA聚合酶的预混液，能够更加便
捷的进行长片段的扩增，效果更好。
52|聚合酶链式反应
6.9反向PCR
反向PCR起初设计用于确定邻近未知区域的序列。它有助于研究基因的启动子序列；致
癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合。该方法之所以被称为反
向PCR，是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延伸。如今，反向
PCR常被用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。
在研究基因组DNA未知序列的传统工作流程中，首先进行限制性酶切消化和连接，再进
行反向PCR，随后对PCR扩增子进行测序。对于gDNA消化，需选用一种限制性内切酶进
行酶切，以获得长度合适且能够自我连接的片段。同时，选定的限制性内切酶不可剪切已
知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接步
骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接（即形成连环体）。
完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部
分已知DNA序列。随后，可从末端开始对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相
邻区域（图6.9）。
常规TaqDNA聚合酶（货号：10342053）已经足够，如果需要更高的保真度和更快的反应
速度，也可以选择DreamTaq热启动DNA聚合酶（货号：EP1701）或PlatinumIITaq热
启动DNA聚合酶（货号：14966001）。
图6.9用于扩增和鉴定邻近未知序列的反向PCR
聚合酶链式反应|53仅供科学研究使用
6.10定量PCR
序列的扩增程度（得率）取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其
中，最常见的应用是基因表达定量。终点PCR方法虽然可行，但它存在一个重大缺点，即
需要通过凝胶电泳确定得率，从而限制了检测灵敏度。此外，定量是在PCR末期进行的，
而此时的扩增已达到平台期（图6.10），因此，DNA凝胶染色强度无法与DNA起始量呈线
用连续稀释的DNA样品作为起始物，或收集指定PCR循环的扩增子，并根据凝胶染色强
度估计基因表达量。
PlatinumIITaq热启动DNA聚合酶（货号：14966001），扩增速率可以达到15sec/kb，
同时耐受各种常见抑制剂，有很高的特异性，灵敏度及产量，使得定量PCR的结果更加准
确。
图6.10PCR的扩增曲线或反应动力学。在终点PCR中，在扩增到达平台期时对扩增子进行检测。而在实时荧
光定量PCR中，是在指数增长期对扩增子进行定量
直到1993年，Higuchi等报道称使用荧光信号对PCR扩增进行实时监测，才克服了终点
PCR定量的局限性。这一技术为我们今天所熟知的定量PCR奠定了基础。1997年，第一
款qPCR仪进入市场，使PCR能够准确定量基因表达和拷贝数。qPCR依靠对指数期目的
片段扩增荧光信号的实时监测，克服了终点PCR定量的缺点。尽管qPCR能够定量检测相
对和绝对基因表达，但是其检测能力限制了定量性能。
54|聚合酶链式反应
7应用
7.1基因表达和分型
首先，从目标样品分离出RNA并将信使RNA（mRNA）逆转录成互补DNA（cDNA）。随
后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录
PCR，RT-PCR（图7.1.1）。
图7.1.1RT-PCR。RNA被逆转录成cDNA，随后通过PCR扩增cDNA（RT：逆转录，RTase：逆转录酶）
终点PCR可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量。例如，对起始
cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化，然后
聚合酶链式反应|55仅供科学研究使用
对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行归一化，预估扩增靶点的相对表达水平。
如今，终点PCR已基本被实时PCR或qPCR取代了，因为它们可获得更可靠和更准确的基
因表达定量结果。
PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠
等转基因生物的基因分型。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及
扩增子长度来检测遗传变异（图7.1.2）。
图7.1.2PCR用于转基因生物的等位基因分型。(A)可用针对目标区域的特异性PCR引物来检测基因位点是野
生型序列（深灰色）还是转基因序列（黄色）。(B)如该凝胶照片所示，PCR产物可用于确定基因型。在这些实
验中，使用了野生型（+/+）和转基因（+/-和-/-）鼠的基因组DNA
但是如果为了检测特定核苷酸突变，则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如，PCR
扩增子测序就是研究单核苷酸变异（SNVs）和单核苷酸多态性（SNP）的方法之一。强烈
推荐使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR过程中引入多余的突变。
通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的突变进行遗传分析的一个基本方式。
适用于基因表达和分型的高保真DNA聚合酶可以选择：PlatinumSuperFiIIDNA聚合酶（
货号：12361010）或PhusionPlusDNA聚合酶（货号：F630S）。前者具有超强性能，300
倍Taq酶的保真度，可适用于大于20kb长片段扩增，更好的抗抑制效果，更强的特异性和
扩增效率；后者性能更加均衡，100倍Taq酶的保真度，最大20kb的片段扩增。两者都属
于最新的二代酶，有独特的通用退火温度设计，避免了PCR反应繁琐的优化过程。适用于
基因表达和分型的常规DNA聚合酶可以选择：TaqDNA聚合酶（货号：10342053），适用
于50kb或更小片段的扩增。能够满足普通的基因表达和分型实验的扩增需求。
56|聚合酶链式反应
7.2克隆
PCR被广泛应用于目标DNA片段的克隆，该技术被称为PCR克隆。在直接PCR克隆
中，DNA（如，gDNA、cDNA、质粒DNA）的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载
体中。或者，在设计引物时，在引物的5′末端添加核苷酸，从而可在插入前作进一步操作
处理。这种附加序列包括通过酶切和连接进行克隆的限制性酶切位点、用于不依赖连接
酶克隆的载体兼容序列以及用于多片段组装的重组序列（图7.2）。
图7.2PCR克隆：通过PCR制备的插入片段被克隆到兼容载体中。（A）直接PCR克隆技术包括TA和平端克
隆。（B）间接PCR克隆，扩增子可在插入到兼容载体之前被修饰，如进行限制性酶切。
由于引物是以从3′到5′的方向合成的，这些DNA寡核苷酸若合成失败或不充分，将会导致
5′序列被截断。因此，建议通过纯化去除多余的合成试剂和非全长DNA寡核苷酸，确保目
标PCR片段的成功克隆。
除了制备插入片段，PCR也是一种在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方
法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。
运用于克隆的DNA聚合酶推荐使用性价比更高的PhusionPlusDNA聚合酶（货
号：F630S），能够达到高达100倍Taq酶的保真度，扩增子大小最高可达20kb。如果有更
高保真度的需求，可以选择PlatinumSuperFiIIDNA聚合酶（货号：12361010），300倍
Taq酶的保真度，可适用于大于20kb长片段扩增，拥有卓越的灵敏度和特异性，是一款强
大的多功能酶。
聚合酶链式反应|57仅供科学研究使用
7.3甲基化分析
PCR可用于研究位点特异性甲基化。在甲基化特异性PCR（MSP）方法中，设计了两个引
物对，以区分目标位点的甲基化状态。
首先使用重亚硫酸盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫
酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶m5C。为了检测甲基化位点，一对引物经设计带有鸟
嘌呤（G），可与目标序列中的m5C配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤
（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后与后续PCR循环中的胸腺嘧啶（T）配
对）。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态（图7.3）。
图7.3甲基化特异性PCR第一步，使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。分别
设计两个引物对（甲基化和未甲基化），从而根据重亚硫酸盐处理DNA的扩增结果来区分目标位点的甲基化
状态，重亚硫酸盐处理后，未甲基化DNA因G-U错配而呈单链状态，此处只有一条DNA链被扩增
MSP很大程度上取决于引物对重亚硫酸盐转化序列的特异性，引物设计对于实验成功至
关重要。第一，引物结合位点必须包含甲基化敏感残基，以便检测出甲基化和未甲基化序
列。第二，未甲基化引物通常富含AT碱基，因此需要较长的引物且Tm≥60°C，以确保实现
特异性退火。此外，富含AT的序列通常易于形成引物二聚体、错配杂交、DNA聚合酶脱落
以及扩增偏倚。因此，所选的DNA聚合酶必须能够扩增宽范围AT/GC含量的模板。第三，
必须使用具有已知和未知甲基化状态的对照DNA对引物特异性进行经验性验证，以评估
假阳性结果。为了利用碱基对错配来区分甲基化状态，建议设计甲基化和未甲基化引物
时，在其3′末端含一对G-A或T-C。
除了能够扩增富含AT的序列，DNA聚合酶还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后DNA中
的U残基。而保真度最高的DNA聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域，所以不
适用于MSP（除非经过特殊修饰）。同样，为防止PCR残余污染，不能对含有U的模板序
列进行UDG处理。
58|聚合酶链式反应
实时PCR代替了终点PCR，为MSP提供更准确的甲基化定量分析。利用实时PCR，对
PCR扩增子的熔解曲线分析是检测目标位点甲基化状态的一种替代性PCR方法。
考虑到甲基化分析对DNA聚合酶的更高要求，PhusionU热启动DNA聚合酶（货
号：F555S）成为最佳的选择。其具有较好的保真度，能够扩增含有U的模板，能够快速扩
增20kb以内的片段。
7.4测序
PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性，强烈建议
使用高保真PCR来制备测序模板。
在Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点
（如M13或T7“通用引物”结合位点）对PCR引物的5′末端进行标记，以简化测序工作流
程（图7.4.1）。
图7.4.1用于Sanger测序的PCR扩增子制备
下一代测序（NGS）中，PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中，DNA样
品通过PCR反应富集（在起始量有限的情况下）并使用测序适配子（Adapter）（以及用
于多重检测的唯一条形码（Barcode）或索引（Index））标记（图7.4.2）。除了具有高保真
度，DNA聚合酶还应具有最小的扩增偏倚，为测序文库提供典型覆盖度。
PlatinumSuperFiIIDNA聚合酶（货号：12361010）和PhusionPlusDNA聚合酶（货
号：F630S）是两款非常适合下游测序的DNA聚合酶。两者都有很高的保真度，快速的扩
增效率，能够扩增GC含量丰富的片段，采用通用退火温度免去了对反应体系优化的麻
烦。但PlatinumSuperFiIIDNA聚合酶性能更加优越，保真度能够高于Taq酶的300倍，
能够扩增片段长于20kb的长片段，最大可以达到40Kb。
聚合酶链式反应|59仅供科学研究使用
图7.4.2使用PCR为新一代测序制备DNA样品
仅供研究使用。不用于临床诊断。2022ThermoFisherScientificInc.保留所有权利。除非另有说明，所有商标均为Thermo
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