内毒素一种在革兰氏阴性菌细胞壁中发现的脂多糖（LPS）。它是一种典型的热原，哪怕是皮克级（10-12g）或纳克级的（10-9g）内毒素进入血液，也会引发各种生物反应。因为其有着耐热性和稳定性，通过高压蒸汽处理也不能完全使内毒素灭活，需在250℃或以上的温度下，干热处理至少半小时才能使其灭活。它存在于革兰氏阴性菌栖息的环境中（例如水，空气），即使在细菌死亡后，细菌性的内毒素（LPS）仍然存在。
图1为脂多糖的结构图，如图所示，脂质A在该物质中是负责生物活性的主要部分，这部分的分子量约为2000。包含糖链部分在内的整个分子的分子量一般为5000到8000左右。然而，因为内毒素是一种同时拥有亲水区（糖链）和疏水区（脂质A）的分子，它能在水溶液中相互缔合，形成表观分子量为数十至数百万的胶束结构。有报告指出，胶束结构的变化，会影响其生物活性的强弱。
图2所示为大肠杆菌型和沙门氏菌型的脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不一样，脂质A的基本结构在大体上仍然相同。
图1.脂多糖（LPS）结构示意图
图2.脂质A的结构（大肠杆菌型和沙门氏菌型）
2.使用鲎阿米巴样细胞溶解物（LAL）试剂的各种内毒素检测方法
由马蹄蟹（美洲鲎）的阿米巴样细胞溶解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示，在内毒素的参与下，级联反应开始进行，其中C因子，一种丝氨酸蛋白酶前体，最先被活化。随后接下来的是B因子的活化，B因子也是一种丝氨酸蛋白酶前体和凝固酶前体，它能将凝集原水解成凝集素，形成不溶性凝胶。在LAL测试中，内毒素可以通过三种方式定量：对凝胶的形成进行测定，对浊度的增加进行测定，或对由合成底物分解而释放出的黄色色原体进行测定。
普通的LAL试剂不仅与内毒素反应，而且会与（1→3）-β-D-葡聚糖（真菌细胞壁成分）反应，因为G因子途径会在LAL试剂作用下被激活。为了消除这种（1→3）-β-D-葡聚糖活化，在工业中通过去除G因子或抑制其活化，开发了各种内毒素特异性试剂。
图3.LAL试剂反应机理
(1)凝胶法
将样本与LAL试剂在试管中混合，并使用干浴器，在37±1°C下，孵育60±2min，期间不要振动。加热完成后，立即缓慢地将试管倾斜180°。如果凝胶已形成并能保持其完整性而不变形或塌陷，则结果可确定为阳性，而如果未形成凝胶则为阴性。在检测期间，对于一系列样本，要进行多倍稀释（通常为2倍），以检查每个样品的结果是否为阳性。确定为阳性的最大有效稀释倍数或最小浓度被称为终点。
在单次型试剂盒和多次型试剂盒中都包含LAL试剂，其中单次型试剂盒中的反应小瓶包含了预分装好的用于单次检测的LAL试剂，而多次型试剂盒则是将所需量的已经溶解好的LAL试剂装入到反应瓶中。单次型试剂盒非常适用于少量样品的检测，而多次型试剂盒则适用于样本量更多的检测。
多次型试剂盒的使用方法式是将0.1mL已经溶解好的LAL试剂分装到反应管中，然后再加入0.1mL样品，并将其混合。而单次型试剂盒的使用方法则是将0.2mL样本加入到含有预先分装好的LAL冻干试剂的反应小瓶中。
ES-II系列
特异性内毒素LAL试剂（不会被（1→3）-β-D-葡聚糖活化），与细菌内毒素检测（BET）（日本药典）相兼容。其胶凝灵敏度为0.015EU/mL，单次型和多次型试剂盒均有提供。
（2）比色法
由于内毒素会使LAL试剂活化，比色法是根据其对显色底物的分解来检测其活化。由于对硝基#苯*胺的黄色的吸光度是在405nm波长下检测的，如果样品在约405nm波长下具有相当大的光吸收，则不宜使用比色法。
ColorKY系列
内毒素特异性比色法LAL试剂，与BET（日本药典）一致性测试相兼容。与Toxinometer结合使用的单次型试剂盒，以及与酶标仪和Toxinometer结合使用的多次型试剂盒，可用于动态比色测试。这些系列在我们的试剂产品有着最高的灵敏度：检测限为0.0002EU/mL（单次型）和0.0005EU/mL（多次型）。
（3）比浊法
比浊法利用凝胶浊度的变化来检测由内毒素诱导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。
ES-F系列和ES-II系列
3.对检测用具的要求
用于内毒素检测的所有检测用具必须不含内毒素和β-葡聚糖。为使内毒素失活，需要在250°C下干热处理超过30min。建议使用经干热灭菌的玻璃器皿。避免使用金属工具，因为即使有少量被洗脱出的金属离子（例如铁，铝，镓，铬），也可能影响测试。而当使用一次性塑料工具（其制造商未能保证其能用于检测用途）时，检查它们是否满足以下要求（与玻璃器皿相比）：1）未被内毒素污染;2）不吸附内毒素;3）无洗脱物。
4.内毒素标准品
根据检测目的使用适当类型的内毒素标准品。
需符合BET（美国药典/欧洲药典/日本药典）的检测，例如药品和医疗器械的产品最终检验
→必须使用美国药典，欧洲药典或日本药典标准的内毒素国家标准品。
→可以使用内毒素工作标准品（CSE）。
5.样本干扰
有时候需要采取预防措施，以防止样本对内毒素检测有潜在影响（反应干扰）。这些干扰分为以下两种类型：
（1）对LAL试剂的干扰
蛋白变性剂（例如酸，碱，尿素，表面活性剂，有机溶剂）
蛋白酶和蛋白酶抑制剂
螯合剂（会清除反应所需的钙和镁）
对于比色法：着色物质（在约405nm处具有相当大吸收的物质）
对于比浊法：浊度
（2）对内毒素的干扰
金属离子（例如铁，铝，镓和铬离子。即使微摩尔级别的存在也会对测试产生影响）
表面活性剂
样本的干扰效果可以通过进行药典中的干扰因子测试来衡量：即通过对加标了已知量的内毒素的样本进行检测，获得加标内毒素的回收率。如果回收率在50％至200％范围内，则可以确定该样本不会造成影响，换句话说，检测所得的内毒素浓度是正确的。如果发现样本会造成影响，可以通过对样本溶液进行稀释，从而减少对测试的影响。然而，对样本溶液的稀释会提高了由原始溶液（预稀释溶液）的浓度转换而得的内毒素浓度值。合理的稀释倍数（最大有效稀释倍数），是根据待检测的内毒素的所需浓度以及所用LAL试剂的检测灵敏度来确定的。欲了解反应干扰因子和最大有效稀释度的详细信息，详见药典中的细菌内毒素检测。
6.LimulusES的原理（内毒素特异性试剂）
图4.鲎试验反应级联
LAL试剂和内毒素的级联反应机制如图4所示。如果反应体系中存在（1→3）-β-D-葡聚糖*，会激活G因子，引起伴有凝胶化的假阳性反应。在这种情况下，无论体系中是否存在内毒素，都会发生反应，意味着无法对内毒素进行特异性检测。为此，我们研发出Wako'sLimulusES，该产品通过在反应体系中加入过量共存的（1→3）-β-D-葡聚糖（羧甲基化凝胶多糖），从而来抑制（1→3）-β-D-葡聚糖的干扰。因此，β-葡聚糖对LAL试剂的活化受到抑制，从而使内毒素特异性检测能够进行。过量的β-葡聚糖可以抑制其自身反应的原理如图5所示：β-葡聚糖和LAL试剂之间反应的浓度范围对于整个反应而言很窄。另一方面，内毒素和鲎试剂的反应在很宽的浓度范围内都会发生，并且不受大量共存的β-葡聚糖的任何干扰。Wako的LimulusES就是根据这个原理而制作的（见图6）。
图5.羧甲基化凝胶多糖和LAL反应
○在99min内检测不到凝胶的生成
●有凝胶的生成
图6.羧甲基化凝胶多糖对使用LimulusHS和LimulusES进行的内毒素检测的影响