崔爽，张明倩，梁五林，郭凡帆，张天睿，欧文静，伍永鸿，贾占红，旦增曲培，张硕峰*
（1.北京中医药大学中药学院，北京102488；2.西藏藏医药大学，西藏拉萨850000）
SPF级SD大鼠36只，体质量200～220g，雌雄各半，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2019-0010，所有大鼠均在恒温（25℃）、恒湿（50%）的环境条件下饲养，自由饮水进食，所有操作均符合北京中医药大学实验动物伦理要求，批准文号：BUCM-4-2021120201-4088。
复方甘草口服溶液（青岛黄海制药有限责任公司，批号：2005801）；脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）、氯化乙酰胆碱（美国SigmaAldrich公司，批号：L2630、A6625-25G）；组胺（上海源叶生物科技有限公司，批号：S20188-1g）；肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）、白介素6（interleukin6,IL-6）检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）（武汉云克隆科技股份有限公司，批号：SEA133Ra、SEA079Ra）。
BuxcoRC肺功能仪检测系统（美国Buxco公司）；精密蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司，型号：BT300-2J）；小动物喉镜（北京元森凯德生物技术有限公司，型号：HY-SHJ01）；石蜡包埋机、轮转式切片机[德国徕卡公司，型号：HistoCoreArcadiaC、RM2255]；微量液体气管内雾化器、大小鼠操作平台（北京元森凯德生物技术有限公司，型号：HY-LWH01、HY-SC01）；BIOBASE离心机（济南鑫驰医疗科技有限公司，型号：TD-4M）。
将36只SD大鼠适应性喂养5d后，按体质量随机分为3组，每组12只，分别为空白组、模型组、复方甘草组。采用异氟烷麻醉大鼠，麻醉后将大鼠置于大鼠插管台上，将小动物喉镜沿舌背弯度插至舌根部，挑起会厌软骨显露声门，在喉镜显示器的引导下将微量液体雾化器的给药端通过口腔沿声门插入气管，迅速将1mg/mL的LPS溶液雾化喷入大鼠气管。第6、13、20天雾化给药25μL，第23、27天雾化给药50μL，进行AECB的模型制备，实验于第30天采集标本。剩余天数空白组和模型组灌服纯净水（10mL/kg），同时复方甘草组灌服复方甘草口服溶液（3mL/kg），1次/d，共计灌胃给药19d。实验过程中，因灌胃失误空白组与模型组大鼠各死亡一只。
1.5.1肺功能检测1.5%戊巴比妥钠（5mg/kg）腹腔注射麻醉后气管插管，另一端连接肺功能仪，待肺功能仪基线平稳5min后分别雾化吸入氯化乙酰胆碱和组胺1∶1混合液，总浓度为3.125、6.25、12.5、25、50mg/mL，激发后通过测定大鼠气道阻力(airwayremodeling,RI)较基础变化率的变化来反映大鼠的肺功能情况。
1.5.2BALF中白细胞总数计数和白细胞分类计数分别采用2mL、2mL、1mLPBS缓冲液灌洗大鼠左肺，BALF回收率均在90%以上，离心后将细胞沉淀加入50μL磷酸缓冲盐溶液（phosphate-bufferedsaline,PBS）致细胞重悬。取10μL细胞悬液滴至细胞计数板进行白细胞计数。分别将20μL细胞悬液涂于2张载玻片，经瑞氏染色法进行细胞分类计数（分为两类：巨噬细胞、中性粒细胞），置于400倍光学显微镜下观察，每张涂片选取两个视野，每个视野测定后取均值作为该切片的平均细胞数。
1.5.3HE肺组织病理学观察取4%多聚甲醛固定大鼠右肺，常规脱水包埋，切片后进行HE染色，置于200倍镜分析肺部病理学变化。
1.5.4PAS染色切片常规脱蜡至水后，严格按照染色液试剂盒说明书进行糖原PAS染色，并置于200倍镜观察大鼠气道黏膜杯状细胞增生结果，每张切片选取5个视野，结果采用ImageJ软件进行计数，每个视野计数后取均值作为该切片的平均阳性细胞数。
1.5.5Masson染色切片常规脱蜡至水后，严格按照染色液试剂盒说明书进行Masson染色，并置于200倍镜观察大鼠肺组织胶原沉积情况，每张切片选取5个视野，结果采用ImageJ软件进行胶原容积分数（collagenvolumefraction,CVF）即胶原纤维面积占视野肺组织面积百分比的测定，每个视野测定后取均值作为该切片的平均CVF。
1.5.6BALF中促炎因子IL-6、TNF-α水平采用ELISA试剂盒的方法进行BALF中促炎因子IL-6、TNF-α的测定，用酶标仪测定OD值后再计算试剂样品的浓度。
与空白组相比，模型组大鼠注射不同剂量氯化乙酰胆碱和组胺1∶1混合液后气道阻力显著升高（P＜0.01）；且随着氯化乙酰胆碱和组胺1∶1混合液刺激浓度的增加，气道阻力不断上升。与模型组相比，复方甘草组大鼠气道阻力显著下降（P＜0.01）。详见图1。
图1氯化乙酰胆碱和组胺对各组大鼠气道阻力的影响
与空白组相比，模型组大鼠BALF中白细胞总数显著上升（P＜0.01）；与模型组相比，复方甘草组白细胞总数明显降低（P＜0.05）。详见图2。
图2各组大鼠BALF中白细胞总数计数结果
与空白组相比，模型组大鼠BALF中中性粒细胞和单核巨噬细胞数量显著增加(P＜0.01)；与模型组相比，复方甘草组BALF中中性粒细胞和单核巨噬细胞数量明显减少(P＜0.05)。详见图3。
图3各组大鼠BALF中中性粒细胞、单核巨噬细胞计数结果
与空白组相比，模型组大鼠支气管黏膜上皮存在局部脱落缺损，管腔变窄且腔内出现较多炎性分泌物，伴肺泡塌陷，肺泡间隔增厚和肺出血，大量炎性细胞浸润。与模型组相比，复方甘草组大鼠支气管黏膜上皮基本完好，肺泡壁和肺泡腔存在轻微的充血扩张，可见少量炎性细胞浸润。详见图4。
图4各组大鼠肺组织病理学(HE，×200)
糖原PAS染色，大鼠气道黏膜中杯状细胞呈紫红色。与空白组相比，模型组大鼠气道黏膜杯状细胞数量明显增多，气道黏液分泌增加(P＜0.01)；与模型组相比，复方甘草组大鼠气道黏膜杯状细胞数量明显减少，气道黏液分泌减轻(P＜0.05)。详见图5、图6。
图5各组大鼠气道黏膜杯状细胞染色结果(PAS，×200)
图6各组大鼠肺组织PAS阳性细胞数结果
与空白组相比，模型组大鼠肺组织出现明显病变，气管周围及肺泡间隔出现大量呈束状或片状的蓝色胶原纤维增生，细支气管相邻肺泡发生融合，支气管壁出现明显增厚，蓝色胶原纤维面积占视野肺组织面积百分比即气道外周CVF显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，复方甘草组大鼠肺组织结构较为完整，气管周围及肺泡间隔中胶原纤维沉积和管壁增厚情况明显减轻，CVF显著降低（P＜0.01）。详见图7、图8。
图7各组大鼠肺组织胶原纤维沉积结果(Masson，×200)
图8各组大鼠气道CVF比较
与空白组比较，模型组大鼠BALF中促炎因子IL-6和TNF-α含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，复方甘草组大鼠BALF中促炎因子IL-6、TNF-α含量显著降低（P＜0.01）。详见图9。
图9各组大鼠BALF中促炎因子IL-6、TNF-α水平
综上所述，本研究采用多次气道内雾化吸入LPS成功建立大鼠AECB模型，通过肺功能、炎症因子等指标，以及组织病理学检测进行验证，为深入研究AECB的发病机制和研究开发新药提供参考。