本发明属于动物精油提取技术领域，具体涉及一种罗仙子精油的制备方法及其清除自由基的应用。
背景技术：
中药罗仙子，为丽蝇科(calliphoridae)大头金蝇(chrysomyiamegacephala)。主产于湖北汉川、汉阳，浙江兰溪；安徽、广东等地亦产。据《本草纲目》、《本草求原》记载，本品性寒、无毒，有清热解毒、消积化滞之功效。内服多用于治疗腹胀、小儿疳积、牙疳、口疮等；干燥研磨后，供搽敷外用，能治疗臁疮、唇疔和痈疽等感染性外科疾病。
化学分析显示罗仙子含粗蛋白59～65％，必须氨基酸总量为43.83％，脂肪含量约12％，油脂中不饱和脂肪酸占68.2％，必需脂肪酸占36％。近年来临床医学研究发现罗仙子药材干粉对于促进感染创面愈合、防治关节炎及心脑血管疾病等有较好疗效。药理实验证实罗仙子水提物具有抑菌抗炎、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等多种药理活性。针对罗仙子精油的研究寥寥，迄今仅见其对小鼠高血脂症、化学致炎、烧烫伤具有显著疗效；脂肪酸fa1和fa2对人白血病细胞、人肺癌细胞、hiv-1整合酶有显著抑制作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种罗仙子精油的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种罗仙子精油。
本发明的再一目的在于提供上述方法制备的罗仙子精油在制备抗氧化制剂或/和清除自由基制剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
罗仙子精油的制备方法，包括以下步骤：
1)罗仙子粗油的制备：将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：15～1：25，超声提取2～4次，每次30～50min，超声功率为400～500w；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；
2)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至48～52℃时加入水，用水体积为粗油体积的15％～20％，于48～52℃条件下搅拌10～22min，离心，取上清液，得脱胶油；
3)脱酸：将脱胶油加热至50～60℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的碱溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.15％～0.2％的碱溶液，继续于50～60℃加热搅拌，待产生的絮状物凝结后停止搅拌，离心取上清得脱酸油；
4)水洗：将上步所得脱酸油加热至80～85℃，加入80～85℃水，水体积为脱酸油的28％～32％，继续加热至80～85℃搅拌28～32min，静置分层，取油层即为罗仙子精油。
进一步的，步骤2)中所述碱溶液为8％～12％w/v的naoh溶液。
进一步的，所述的水为蒸馏水。
进一步的，上述方法包括以下步骤：
1)罗仙子粗油的制备：将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：25，超声提取3次，每次30min，超声功率为450w；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；
2)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至50℃时加入蒸馏水，蒸馏水体积为粗油体积的20％，于50℃条件下搅拌20min，离心，取上清液，得脱胶油；
3)脱酸：将脱胶油加热至50℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的naoh溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.2％的naoh溶液，继续于50℃加热搅拌，待产生的絮状物凝结后停止搅拌，离心取上清得脱酸油；
所述naoh溶液浓度为10％w/v；
4)水洗：将上步所得脱酸油加热至80℃，加入80～85℃蒸馏水，蒸馏水体积为脱酸油的30％，继续加热至80℃搅拌30min，静置分层，取油层即为罗仙子精油。
上述任一所述方法制备的罗仙子精油。
上述任一所述方法制备的罗仙子精油在制备抗氧化制剂或清除自由基制剂中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明方法制备的罗仙子精油具有很好的纯度，外观性状显著改善，为澄清透明的金黄色，且刺激性气味显著降低，其中含有的脂肪酸种类多，得率高，其中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比为41.4％/58.5％，稳定性好，具体很好的抗氧化作用或清除自由基的作用，应用价值广泛。
附图说明
图1为罗仙子精油和粗油的的外观性状对比图，其中a为粗油，b为精油；
图2为罗仙子精油的gc-ms色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1罗仙子精油的制备方法
1)罗仙子粗油的制备：罗仙子幼虫微波干燥后，碾碎得罗仙子粉末，将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：25，超声提取3次，每次30min，超声功率为450w；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；
3)脱酸：将脱胶油加热至50℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的naoh溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.2％的naoh溶液(以下称为超碱量)，继续于50℃加热搅拌30min后，产生的絮状物凝结，停止搅拌，4000r/min离心5min，取上清得脱酸油；所述naoh溶液浓度为10％w/v；
实施例2罗仙子精油的制备方法
1)罗仙子粗油的制备：罗仙子幼虫微波干燥后，碾碎得罗仙子粉末，将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：15，超声提取2次，每次50min，超声功率为400w；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；
2)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至48℃时加入蒸馏水，蒸馏水体积为粗油体积的15％，于48℃条件下搅拌22min，离心，取上清液，得脱胶油；
3)脱酸：将脱胶油加热至60℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的naoh溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.15％的naoh溶液，继续于60℃加热搅拌32min后，产生的絮状物凝结，停止搅拌，4500r/min离心4min，取上清得脱酸油；
所述naoh溶液浓度为12％w/v；
4)水洗：将上步所得脱酸油加热至85℃，加入85℃蒸馏水，蒸馏水体积为脱酸油的32％，继续加热至85℃搅拌28min，静置分层，取油层即为罗仙子精油。
实施例3罗仙子精油的制备方法
1)罗仙子粗油的制备：罗仙子幼虫微波干燥后，碾碎得罗仙子粉末，将罗仙子粉末与溶剂正己烷混匀，料液比为1：20，超声提取4次，每次30min，超声功率为500w；过滤，减压回收溶剂，得罗仙子粗油；
2)粗油脱胶：将罗仙子粗油加热至52℃时加入蒸馏水，蒸馏水体积为粗油体积的18％，于52℃条件下搅拌10min，离心，取上清液，得脱胶油；
3)脱酸：将脱胶油加热至55℃，根据脱胶油酸值加入刚好能够中和酸的naoh溶液，另外再加入体积为脱胶油体积0.18％的naoh溶液，继续于55℃加热搅拌28min后，产生的絮状物凝结，停止搅拌，3500r/min离心6min，取上清得脱酸油；所述naoh溶液浓度为8％w/v；
4)水洗：将上步所得脱酸油加热至80℃，加入80℃蒸馏水，蒸馏水体积为脱酸油的28％，继续加热至80℃搅拌32min，静置分层，取油层即为罗仙子精油。
下面对本发明上述实施例制备的罗仙子精油作进一步的效果检测。
一、罗仙子精油和粗油的理化值比较
方法：取本发明制备的罗仙子精油和罗仙子粗油进行酸值、碘值、过氧化值和皂化值的测定、统计和分析，并对外观性状进行对比。
酸值和过氧化值测定参考国家标准gb/t5009.37-2003。碘值测定参考国家标准gb/t5532-2008。皂化值测定参考国家标准gb/t5534-2008。
结果：
罗仙子精油和粗油的外观性状如图1所示，从中可以看出，罗仙子精油外观性状显著改善，由浑浊黏稠黄褐色转为澄清透明的金黄色，颜色浅淡、澄明度好、流动性较好、油脂纯度高，且刺激性气味显著降低。
罗仙子精油和罗仙子粗油酸值、碘值、过氧化值和皂化值的测定结果如表1所示。酸值表示油脂中游离脂肪酸的含量，为评价油脂质量的重要指标，中华人民共和国国家标准gbt26516-2011按摩精油及gbt29990-2013润肤油中均对精油酸值作了规定，分别要求低于≤7mg/g及≤5mg/g，本发明制备的罗仙子精油均符合以上标准规定。另外本发明制备的罗仙子精油的碘值为18g/100g，过氧化值为0.0164g/100g，皂化值130.2122mg/g。
表1罗仙子精油和罗仙子粗油理化值对比(n＝3)
二、罗仙子精油化学组成和相对含量分析
方法：
(1)脂肪酸甲酯的制备
精密称取实施例1制备的罗仙子精油0.15g，加入0.5mol/l的氢氧化钾-甲醇溶液2ml，65℃水浴至油滴完全消失，冷却后加入14％三氟化硼-甲醇溶液2ml，水浴煮沸10min，室温中冷却，加入异辛烷10ml，饱和氯化钠溶液20ml，取上清液于试管中，加无水硫酸钠，离心分层，取上清液保存备用。
(2)gc-ms分析条件
色谱条件：色谱柱hp-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；采用程序升温，初温160℃，以5℃/min升温至170℃，以3℃/min升温至176℃，保持2min，以5℃/min升温至190℃，保持10min；进样口温度280℃；检测器温度250℃；载气为高纯氦气，流速1.0ml/min；进样量1.0μl，分流比40∶1。
质谱条件：电离方式为电子轰击(ei)，电子能量70ev，接口温度250℃；质量扫描范围(m/z)35～500u。质谱检索软件nist02，采用峰面积归一法进行定量分析。
罗仙子精油的gc-ms色谱图如图2所示，采用气质联用仪对罗仙子精油中的化学成分组成及相对含量的检测分析结果如表2所示，含有脂肪酸类成分13种，其中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比为41.4％/58.5％。
表2本发明制备的罗仙子精油中脂肪酸的组成及相对含量
三、罗仙子精油自身氧化稳定性研究
考察环境温度和光照对本发明方法制备的罗仙子精油稳定性的影响，以酸值和过氧化值作为评价指标。
(1)温度对罗仙子精油稳定性的影响
精密称取本发明制备的罗仙子精油3份，每份100g置于250ml的锥形瓶中，分别于4℃、25℃、55℃不同温度下避光条件放置。20d内每隔3d测定其过氧化值、酸值，共测5次。由表2、3可知，环境温度变化对罗仙子精油的酸值及过氧化值均没有明显变化。
表3温度对本发明制备的罗仙子精油酸值的影响(n＝3,mg/g)
表4温度对本发明制备的罗仙子精油过氧化值的影响(n＝3,g/100g)
(2)光照对罗仙子精油稳定性的影响
精密称取本发明制备的罗仙子精油2份，每份100g置于250ml的锥形瓶中，25℃条件下，一份避光保存，一份暴露于自然光下，每隔3d测定精油的酸值和过氧化值，共测5次。由表5、表6可知，在光照或避光条件下，罗仙子精油的酸值及过氧化值均没有明显变化。
表5光照对本发明制备的罗仙子精油酸值的影响(n＝3,mg/g)
表6光照对本发明制备的罗仙子精油过氧化值的影响(n＝3,g/100g)
综上，温度与光照对罗仙子精油的稳定性没有明显影响，表明对本发明制备的罗仙子精油自身稳定性较好，易于保存。
四、罗仙子精油体外清除自由基作用研究
材料：2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)(批号201603101)、1,1-二苯基-2-苦肼基(dpph)(批号201608101)购自成都艾科达化学试剂有限公司；抗坏血酸(vc，纯度98％)购自天津市大茂化学试剂厂。
对照品溶液的配制：取vc用95％乙醇定容于容量瓶中，配制成原始浓度为0.5mg/ml的vc溶液；吸取不同体积的vc溶液用95％乙醇分别定容于10ml容量瓶中，得到vc浓度范围0.002～0.008mg/ml溶液。
供试品溶液的配制：取本发明制备的罗仙子精油用乙酸乙酯定容于容量瓶中，配制成原始浓度为0.5g/ml的样品溶液；吸取不同体积的样品溶液用乙酸乙酯定容于10ml容量瓶中，得到浓度范围0.02～0.07g/ml的样品溶液。
工作液的配制：dpph工作液配制：取0.0041g的dpph粉末用乙酸乙酯定容于100ml容量瓶中，配制成105μmol/l的dpph溶液，避光密封保存。
abts工作液配制：称取0.3841g的abts粉末溶于100ml蒸馏水中配制成7mmol/l的abts溶液，称取0.0993gk2s2o8溶于50ml蒸馏水中配制成7.35mmol/l的k2s2o8溶液，将abts溶液和k2s2o8溶液按体积比2:1混合后常温避光反应12～16h，得到abts+储备液，使用前用无水乙醇稀释直至其吸光度在734nm处为0.70±0.02之间。
(1)dpph+清除能力测定
样品溶液对dpph+清除能力测定：分别吸取2ml不同质量浓度的样品溶液与2mldpph+工作液混合，涡流振荡30s后暗处静置10min，于517nm处测定其吸光度，每个浓度平行测三次，按公式(1)计算清除率和ic50值(清除率为50％时样品的质量浓度)。vc对dpph+清除能力测定方法同样品。
k＝[1-(ai-aj)/ac]×100％
ai-2mldpph溶液+2ml样品的吸光度；aj-2ml样品+2ml乙酸乙酯的吸光度；ac-2mldpph溶液+2ml乙酸乙酯的吸光度。
结果：本发明方法制备的罗仙子精油对dpph自由基清除作用测定结果如表7所示，问问中可以看出，罗仙子精油对dpph自由基具有一定的清除能力，在所选浓度范围内，样品的浓度与对自由基清除率存在良好的线性关系，根据标准曲线方程计算ic50值。
表7本发明方法制备的罗仙子精油对dpph自由基清除作用测定结果
(2)abts+清除能力测定
样品对abts+清除能力测定：分别吸取1ml不同质量浓度的样品溶液与2mlabts+工作液混合，涡流振荡30s后室温暗处反应8min，于734nm波长处测定吸光度，每个浓度平行测三次，按公式(1)计算清除率和ic50值(清除率为50％时样品的质量浓度)。vc对abts+清除能力测定方法同样品。
ai-2mlabts溶液+1ml样品的吸光度；aj-1ml样品+2ml乙醇的吸光度；ac-2mlabts溶液+1ml乙酸乙酯的吸光度。
表8本发明方法制备的罗仙子精油对abts自由基清除能力测定结果
结果：本发明方法制备的罗仙子精油对abts自由基清除能力测定结果如表8所述，罗仙子精油对abts自由基也具有一定的清除能力，在所选浓度范围内，样品的浓度与对自由基清除率存在良好的线性关系，根据标准曲线方程计算ic50值。
在本发明研究过程中，发明人还设计了大量的对比实验，其提取效果均不及本发明方法。
一、不同提取方式对罗仙子粗油得率的对比分析
(1)冷浸法提取法
精密称取罗仙子粉末20g，置于具塞的锥形瓶中，加入正己烷500ml，室温浸提3次，每次8h，过滤，合并提取液，减压回收溶剂至恒重，测定得油率。
(2)索氏提取法
精密称取罗仙子粉末20g，置于索氏提取器中，以500ml正己烷为溶剂提取3次，每次8h，合并提取液，减压回收溶剂至恒重，测定得油率。
(3)超临界流体萃取法
(4)本发明超声波提取法
精密称取罗仙子粉末20g，置于锥形瓶中，加入500ml正己烷，超声提取3次(功率400w)，每次30min，过滤，减压回收溶剂，得到罗仙子粗油。
不同粗油提取方法的得油率如表9所示，从中可以看出，不同提取方法的得油率排序为：超声提取>索氏提取>冷浸>超临界提取，其他粗油提取方法的效果均不及本发明的超声法提取效果。
表9不同提取方法条件下罗仙子粗油的得率(n＝3)
二、不同提取溶剂进行提取的效果对比分析
精密称取4份罗仙子干粉，每份20g，分别以500ml的石油醚-丙酮、正己烷-丙酮、石油醚和本发明用的正己烷作为提取溶剂，超声提取3次(功率400w)，每次30min。
由表10可知，正己烷-丙酮、石油醚-丙酮两种溶剂的得油率稍高，但所得粗油色深浑浊，否说明杂质含量过多。正己烷提取所得油脂颜色浅淡，澄明度好、流动性较好、油脂纯度高，经综合分析对比，其他3种溶剂提取的效果均不及正己烷提取的效果。
表10不同提取溶剂的得油率(n＝3)
三、不同料液比进行罗仙子粗油提取的效果比较
精密称取5份罗仙子干粉，每份20g，分别按照料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25和1：30加入正己烷溶液，超声提取3次(功率400w)，每次30min。
由表11可知，综合考虑提取效率和溶剂消耗量，料液比为1:15～1:25，最优选为1：25。
表11不同料液比的得油率(n＝3)
四、不同超声次数对罗仙子粗油提取效果的影响
由表12可知，超声提取2～4次效果较好，最优选为4次。
表12不同超声次数的得油率(n＝3)
精密称取5份罗仙子干粉，每份20g，按料液比1:25加入正己烷，超声提取3次(功率400w)，每次30、40、50、60、70min。
六、不同超声频率对罗仙子粗油提取效果的影响
精密称取5份罗仙子干粉，每份20g，按料液比1:25加入正己烷，超声提取3次(功率400w)，每次30min，超声频率分别是300、350、400、450、500w。
由表14可知，超声频率为400～500w时效果较好。
表14不同超声频率的得油率(n＝3)
七、粗油提取因素分析
表15主体间效应的检验
a.r2＝0.986(调整r2＝0.945)
八、不同加水量对脱胶效率、精油得率的影响
取5支试管，分别精密称取适量罗仙子粗油，加热到50℃，考察蒸馏水的添加量分别为粗油体积的5％、10％、15％、20％、30％时对脱胶效率、精油得率的影响。除了脱胶过程中各组用水量不同，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。
当加水量为15％～20％时，脱胶彻底，所得油颜色由浑浊黄褐色转为澄清金黄色，且精油得率较好(达88.75％以上)，其中当加水量为20％时效果最佳；而当加水量为其他情况时，要么脱胶不彻底，要么精油得率太低，要么易滋生微生物引起腐败，不利于精油的保存。
九、加酸量对脱胶效率、精油得率的影响
取5支试管，分别精密称取适量罗仙子粗油，加热到50℃，加水量为20％的条件下，考察磷酸添加量分别为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％时对脱胶效率、精油得率的影响。除了脱胶过程中各组加酸量不同，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。
结果显示，酸的加入对罗仙子粗油脱胶效果不明显，对精油性状改善不明显，且引起了精油的腐败，影响精油得率(表16)。故在本发明罗仙子精油的制备过程中不适合加酸进行脱胶。
表16加酸量对脱胶后精油得率的影响(n＝3)
十、加热温度对脱胶效率、精油得率的影响
取5支试管，分别精密称取适量罗仙子粗油，加水量为20％的条件下，考察加热温度分别为30、40、50、60、70℃时对脱胶效率、精油得率的影响。除了脱胶过程中各组加热温度不同，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。
由表17可知，当加热温度为30℃、40℃、60℃、70℃时的精油得率均不及温度为50℃时的精油得率。
表17加热温度对脱胶后精油得率的影响(n＝3)
十二、脱酸过程碱浓度与碱量对脱酸效率、精油得率影响
精密称取适量上述实施例中的脱胶油，按照国家标准gb/t5009.37-2003规定方法测定酸价，根据酸值计算总加碱量。将脱胶油加热至50℃，快速加入适量naoh溶液，磁力搅拌使碱液和油完全混合，渐渐出现细小皂粒，待絮状物充分凝结后停止搅拌，离心分离。把上清液放置烧杯中加热至80℃，加入80-85℃蒸馏水，水量为油量体积的30％，继续搅拌30min后，静置于分液漏斗中分离，分出的废水滴加几滴酚酞指示液，水洗至废水中滴加酚酞后不变色即可停止水洗。
m1＝7.13×va×g0/10000c；m2＝g0×w；
式中：m1-理论加碱量(g)；m2-超碱量(g)；va-罗仙子脱胶油的酸值(mg/g)；g0-罗仙子脱胶油的质量(g)；c-naoh溶液的质量分数(％)；w-超碱量占罗仙子脱胶油量的百分比(％)。
(1)碱浓度对脱酸效率的影响
除了脱酸过程中各组naoh碱溶液浓度w/v不同(2％、6％、10％、14％、18％)，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。
以罗仙子精油的酸值和得油率为指标，综合评价脱酸效率，由表19可知当碱浓度为10％w/v时精油得率和精油酸值的综合评价最高，当碱浓度为2％、6％、14％或18％时，要么精油得率太低，要么精油酸值偏高。
表19碱浓度对脱酸效率影响(n＝3)
(2)超碱量对脱酸效率的影响
除了脱酸过程中超碱量不同，即各组中10％w/vnaoh溶液用量在能够中和酸的基础上再分别加入体积为脱胶油体积0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％的量，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。
以精油的酸值和得油率为指标，综合评价脱酸效率，由表20可知当超碱量为脱胶油体积0.15％～0.2％时，精油得率和精油酸值的综合评价最高，当超碱量为其他情况时，要么精油得率太低，要么精油酸值偏高。
表20超碱量对脱酸效率影响(n＝3)
十三、脱酸过程加热温度对脱酸效率、精油得率影响
除了脱酸过程中各组加热温度不同(分别设置为40、50、60、70、80℃)，其他操作都相同，均按照实施例1记载的操作进行。
以精油的酸值和得油率为指标，综合评价脱酸效率，由表21可知当加热温度为50～60℃时，精油得率和精油酸值的综合评价最高，在其温度情况下，要么精油得率太低，要么精油酸值偏高。
表21加热温度对脱酸效率的影响(n＝3)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。