因此我们推断，Iso是通过抑制TLR4/NFκB信号通路的激活进而抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡这一机制抑制肾IRI的发生。
刘超1王芳2李继峰1武强1陈娜3
1鹤壁市人民医院麻醉科，鹤壁458030；2济宁市中西医结合医院呼吸科，济宁272000；3鹤壁市人民医院药剂科，鹤壁458030
国际麻醉学与复苏杂志,2022,43(12):1233-1239.
DOI：10.3760/cma.j.cn321761-2021051200688
基金项目
河南省科技攻关计划联合共建项目（LHGJ20191300）
ORIGINALARTICLES
【论著】
本研究拟采用异氟醚（Iso）预处理肾肾缺血再灌注损伤（IRI）动物模型，并利用Toll样受体4（TLR4）/NFκB信号通路激活剂脂多糖（LPS）进行逆转实验，探讨Iso是否通过调控TLR4/NFκB信号通路发挥肾IRI保护作用，从而为器官损伤的麻醉保护研究提供一定依据。
1.1动物处理
1.2肾功能指标检测
取血液标本2000r/min离心15min（离心半径8.5cm）后取上清，采用全自动生化分析仪测定大鼠静脉血Cr、BUN水平。
1.3炎症因子及氧化应激指标检测
取大鼠新鲜肾组织，低温下制成匀浆，而后采用ELISA试剂盒检测肾组织IL1β、TNFα、IL6水平。另取部分肾组织匀浆，采用SOD活性检测试剂盒检测肾组织SOD活性，采用可见分光光度法检测肾组织MDA、GSHPx水平。
1.4HE染色观察肾组织病理学形态
取肾组织石蜡切片经三级脱蜡后，于二甲苯内浸泡10min，而后用苏木精染色5min，冲洗3次，加入伊红溶液染色1min，冲洗后梯度乙醇脱水，晾干后封片。于显微镜下观察组织形态，每只动物染色3张切片，每片随机选取5个视野。使用NISElementsViewer4.2.0软件评估肾小管损伤程度（组织病理学评分）。每张切片5个视野的平均分为本切片评分，3张切片评分再取均值作为该大鼠的评分。
1.5TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡
取制备好的大鼠肾组织匀浆，加入高效RIPA裂解液，于匀浆器中匀浆2min，室温静置10min，4℃14000g离心15min，取上清提取总蛋白；同时取部分组织匀浆，加入苯甲基磺酰氟（PMSF）调整终浓度为1mmol/L，4°C下1500g离心5min，吸弃上清后取沉淀，加入含PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，多次重复震荡30min使沉淀悬浮，而后4°C12000g离心10min，吸取上清为细胞核蛋白。采用BCA法分别测定总蛋白和核蛋白的浓度，而后进行SDSPAGE电泳，转膜，封闭，总蛋白样品中分别滴加兔抗大鼠TLR4（1∶1000）、MyD88（1∶1000）和βactin一抗孵育，核蛋白中加入兔抗大鼠NFκBp65（1∶1000）、TBP（1∶1000）一抗，4℃孵育过夜；第2天加入对应的羊抗兔二抗，摇床室温孵育1h。ECL发光显色，扫描。用ImageJ软件计算目的蛋白的相对表达量，其中TLR4、MyD88以和βactin的比值反映相对表达水平，NFκB以和TBP的比值反映相对表达水平。
2.1肾组织切片病理观察
各组肾组织切片HE染色结果见图1。与S组比较，IRI组可见明显肾组织损伤，以皮质和髓质交界区尤为严重：明显间质出血、水肿，炎症细胞浸润，小管肿胀，小管上皮细胞形态异常，刷状缘紊乱消失等。与IRI组比较，Iso+IRI组病理损伤减轻：间质水肿、炎症细胞浸润减轻，肾小管上皮细胞形态改善。与Iso+IRI组比较，Iso+IRI+LPS组肾组织病理表现加重。
2.2组织病理学评分及静脉血Cr、BUN水平比较
与IRI组比较，Iso+IRI组组织病理学评分降低（P<0.05），Iso+IRI+LPS组差异无统计学意义（P>0.05）；与Iso+IRI组比较，Iso+IRI+LPS组组织病理学评分升高（P<0.05）。
与S组比较，IRI组、Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组Cr和BUN水平升高（P<0.05）；与IRI组比较，Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组Cr及Iso+IRI组BUN水平下降（P<0.05）；与Iso+IRI组比较，Iso+IRI+LPS组Cr、BUN水平升高（P<0.05）。见表1。
2.3肾组织IL1β、TNFα、IL6水平比较
与S组比较，IRI组、Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组IL1β、TNFα、IL6水平均升高（P<0.05）；与IRI组比较，Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组IL1β、TNFα、IL6水平均降低（P<0.05）；与Iso+IRI组比较，Iso+IRI+LPS组IL1β、TNFα、IL6水平均升高（P<0.05）。见表2。
2.4肾组织SOD活性及MDA、GSHPx水平比较
与S组比较，IRI组、Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组SOD活性降低、MDA水平升高（P<0.05），IRI组和Iso+IRI+LPS组GSHPx水平降低（P<0.05）。与IRI组比较，Iso+IRI组SOD活性增加、MDA水平降低、GSHPx水平升高（P<0.05），Iso+IRI+LPS组MDA水平降低（P<0.05）。与Iso+IRI组比较，Iso+IRI+LPS组SOD活性降低、MDA水平增高、GSHPx水平降低（P<0.05）。见表3。
2.5肾小管上皮细胞凋亡率比较
TUNEL检测结果显示，S组偶见少量阳性细胞。与S组比较，IRI组、Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组细胞凋亡率升高（P<0.05）；与IRI组比较，Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组细胞凋亡率降低（P<0.05）；与Iso+IRI组比较，Iso+IRI+LPS组细胞凋亡率升高（P<0.05）。见图2、图3。
2.6TLR4、MyD88、NFκBp65水平比较
与S组比较，IRI组、Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组TLR4、MyD88、NFκBp65水平升高（P<0.05）；与IRI组比较，Iso+IRI组、Iso+IRI+LPS组TLR4、MyD88、NFκBp65水平降低（P<0.05）；与Iso+IRI组比较，Iso+IRI+LPS组TLR4、MyD88、NFκBp65水平升高（P<0.05）。见图4。
本研究结果显示，与S组相比，IRI组出现明显肾组织损伤病理特征，肾功能指标Cr、BUN及炎症指标IL1β、TNFα、IL6均显著升高，氧化应激指标SOD活性、GSHPx水平显著降低，MDA水平显著升高，肾小管上皮细胞呈凋亡样形态学改变，TLR4、MyD88、NFκBp65水平显著升高，提示大鼠肾IRI建模成功，且证实肾IRI存在过度氧化应激、炎症反应及TLR4/NFκB信号通路的激活，从而促进肾小管上皮细胞凋亡、肾损伤进展的病理过程。因此，从病理分析入手，直接或间接干扰TLR4/NFκB信号通路激活，可能是保护肾IRI的有效手段。
本研究结果显示，与IRI组比较，Iso+IRI组肾组织损伤程度明显减轻，炎症因子水平、氧化应激指标、肾小管上皮细胞凋亡率、生化指标（Cr、BUN、TLR4、MyD88、NFκBp65）水平等均显著降低，提示Iso对肾IRI发挥保护作用，其机制可能是通过抑制TLR4/NFκB信号通路的激活，减轻炎症和氧化应激反应，从而抑制肾小管细胞的凋亡，改善肾IRI程度。为验证该信号通路机制，我们采用TLR4的激活剂LPS进行了逆转实验，结果显示，在Iso处理的基础上进行LPS干预，可以上调TLR4/NFκB信号通路，重新上调炎症因子和氧化应激水平，增加细胞凋亡率，即逆转了Iso的肾IRI保护作用。因此我们推断，Iso是通过抑制TLR4/NFκB信号通路的激活进而抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡这一机制抑制肾IRI的发生。
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