海量干货:手把手教你结肠炎胰腺炎糖尿病动物造模

目前有多种动物模型被广泛用于研究炎症性肠炎(inflammatoryboweldisease,IBD)的病因、发病机制及测试新开发药物药效等,尤其以葡聚糖硫酸钠盐(DextranSulfateSodiumSalt,DSSMW:36000~50000)结肠炎(ulcerativecolitis,UC)模型应用最广。

图1.DSS溃疡病结肠炎模型发展历程

02DSS构建的UC模型特点

表1.DSS结肠炎模型组织学特征

DSS结肠炎模型类别

急性期结肠炎模型

慢性期结肠炎模型

组织学改变

结肠充血、水肿、变短、变脆、重量长度比增加

结肠明显缩短

出现不同程度的结肠溃疡

粘膜增厚、淋巴结肿大

黏膜水肿、杯状细胞缺失、隐窝肿胀破坏

杯状细胞缺失、隐窝缺失

黏膜和黏膜下层出现不同程度的炎症细胞浸润,上皮细胞损伤

小部分动物出现腺瘤性息肉、肿瘤样改变

03DSSUC模型的优势

1、症状表现与人UC极度相似,可用于研究急、慢性结肠炎的发生发展机制,也可用于药物的药效研究。

2、自由饮用DSS水溶液的建模方式,简单易行,成模率高,重复性强。

4、多种属动物中均可造模:小鼠、大鼠、斑马鱼、猪、果蝇等。

04DSSUC模型构建实例

1、小鼠造模

1)BALB/c小鼠,雌,6-8周,25g;

2)用无菌水配置3%DSS饮用水,然后用0.22μm的滤膜过滤;

3)给小鼠连续饮用7天,HE染色;

4)实验结果:小鼠的组织水肿充血,有明显的炎症现象。

图2.DSS急性结肠炎切片HE染色结果

2、斑马鱼造模

1)将斑马鱼胚胎培养在含甲基蓝的E3胚胎培养基中,28.5℃,培养至1dpf;

2)用E3培养基配置0.5%DSS饮用水,然后用0.22μm的滤膜过滤;

3)用0.5%的DSS处理斑马鱼,从3dpf处理到6dpf。

4)实验结果:0.5%的DSS药物处理均会导致斑马鱼肝脏颜色变深,产生炎症应激。

图3.DSS导致斑马鱼肝脏产生炎症反应

3、猪造模

1)四到五天大的约克郡小猪,实验组:灌注DSS,对照组:灌注生理盐水

2)每只小猪每日摄入量1.25gDSS/kg,灌注5天

3)实验结果:灌注DSS后,实验组的血浆D-甘露醇摄取率显著高于对照组,表明小猪出现了肉眼可见的肠炎症状。

图4.DSS诱导致小猪体内D-甘露醇浓度高于对照组

4、果蝇造模

1)将5~10日的雌果蝇放在一个装有2.5×2.5×1cm的空小瓶中培养中,用5%蔗糖溶液润湿的3.75-cm色谱纸(Fisher)进料介质;

2)用5%的蔗糖溶液分别配制含有不同成分的喂食培养基,类别包括各含3%的DSS,25μg/ml博来霉素;

3)果蝇放入含有层析纸的瓶中,29℃培养三天,期间每天将存活的果蝇移入含有新鲜培养基的空瓶中;

4)实验结果:DSS有致死的功能,且DSS诱导ISC前体细胞增殖。

图5.DSS诱导果蝇中ISC前体细胞增殖

05如何评价造模是否成功?

1、疾病活跃指数评分(DiseaseActivityIndex,DAIscore)

从三个方面进行评估打分,分别为体重、粪便粘稠度、粪便潜血等指标,DAI评分为三个指标之和。

表2.DAI评分细则

评分

体重下降百分比

粪便粘稠度

粪便潜血

0

正常

阴性

1

1-5%

软便

浅蓝

2

5-10%

黏液样便

蓝色

3

10-20%

稀液状便

深蓝

4

>20%

肉眼血便

2、组织学变化评分

组织学变化评分为上述各指标之和,在急性结肠炎模型中淋巴结形成不做评分。组织学分析的标准方法为HE染色(Cat.NO:60524ES60)。

表3.组织学变化评分

溃疡(个)

上皮细胞变化

炎症浸润

淋巴结(个)

杯状细胞缺失

隐窝周围浸润

杯状细胞大面积缺失

黏膜肌层出现浸润

隐窝缺失

黏膜肌层普遍浸润,黏膜增厚

>3

隐窝大面积缺失或息肉状再生

黏膜下层浸润

3、结肠长度

急性结肠炎模型中,第8天可检测到结肠长度缩短;慢性结肠炎模型中,结肠长度缩短更加明显。

4、总结

DSSUC动物模型构建应先进行预实验,摸索建模条件,建议预实验每组样本8-10只,并设立对照组。通常出现体重减轻、稀便、腹泻、血便或粪便潜血、溃疡可视为DSS药物有效,造模成功。

06翌圣DSS建模案例

表4.用DSS构建不同类型的肠炎模型

模型

建模样本

造模方案

造模结果

使用评价

急性结肠炎

BALB/c小鼠,雌,6-8周,25g

3%-5%DSS连续自由饮用7天

Day5出现,结肠长度缩短、HE染色,炎症明显

成模速度快,用时短。符合急性结肠炎模型特征

C57BL/6小鼠,雄,8周,20g

3%-5%DSS灌胃,持续给药

Day5出现,结肠长度缩短、体重下降、便血、拉稀

成模率高,用时短。符合急性结肠炎模型特征

慢性结肠炎

C57BL/6小鼠,雄,8周,22g

1-2%DSS灌胃,持续给药

Day40出现,结肠长度缩短、体重下降、便血、拉稀

成模率高。符合慢性结肠炎模型特征

结肠癌

C57BL/6小鼠,雄,8周,21g

1%-2%DSS自由饮用5天,持续3周

14周出现,结肠长度缩短、体重下降、HE染色,炎症明显

成模率高。符合结肠癌模型特征

07常见问题

表5.DSS结肠炎造模常见问题

可能出现的问题

可能的原因

建议解决办法

小鼠致死率高

DSS浓度太高

降低DSS给药浓度

小鼠无肠炎症状或低肠炎症状

DSS浓度太低

同一组小鼠,肠炎症状差异大

瓶盖堵塞

每天检查小鼠饮水瓶

08产品订购

热卖产品,建模效率与进口产品一致,产品价格低至进口价格的1/3,大量现货库存。

产品名称

货号

规格

价格(元)

60316ES25

25g

1255.00

60316ES60

100g

3855.00

60316ES76

500g

16855.00

60316ES80

1kg

32855.00

60524ES60

2×100mL

358.00

60751ES03/08/10

1mg/5mg/10mg

(液体:135mMinWater)

1095.00/2255.00/4165.00

动物急性胰腺炎造模

造模优势:

1、操作简单

2、成本较低

3、造模迅速

4、给药方式多

造模机制:

1、通过刺激胞内NF-KB来上调胰腺腺泡细胞内的细胞间黏附分子(ICAM-1)表达。表面ICAM-1反过来促进中性粒细胞粘附到腺泡细胞上从而增强胰腺炎症效应;

2、通过诱使消化酶分泌失调和细胞质空泡化导致腺泡细胞死亡和胰腺水肿,从而诱导胰腺炎;

3、活化炎症促进因子。

翌圣提供十肽分子形式,纯度≥97%(HPLC)雨蛙素;造模效率高,价格优惠,现货供应。

60321ES03

1mg

3878

60313ES60

100mL

279

60750ES76

500mL

185

糖尿病疾病模型造模

01STZ诱导糖尿病模型的构建标准SOP

1、动物的准备

尽量选用雄性动物,雌性含有激素影响建模效率。有研究显示,雌性动物成模率差,而且可能会比雄性出现更高死亡率,尤其是I型。

I型糖尿病(TypeIdiabetes)一般按照体重选择即可,推荐大鼠170-200g,小鼠17-22g,适应性喂养1~2周后空腹注射STZ,成模率相对理想。

II型糖尿病(TypeIIdiabetes)对于大鼠(比如SD/Wistar),选取4-5周龄,体重在90-100g,高脂(高糖)饲料喂养4-6周体重约达240-280g。对于小鼠(比如C57/ICR/昆明小鼠),选取4-5周龄,体重在16-20g,高脂(高糖)饲料喂养4-6周体重约达30-35g。对于新购入动物或更换饲养环境需要先用普通饲料适应性喂养一周,然后再选择适合周龄/体重动物转用高脂高糖饲料继续喂养。从模型建立成功率来看,大鼠推荐用SD,小鼠推荐C57。

2、造模前的喂养

造膜前的喂养,Ⅰ型糖尿病模型成模比较快,通常大鼠在普通饲料适应性喂养2周后即可开始造模;Ⅱ型糖尿病模型:高脂饮食诱导加小剂量STZ。造模前喂以高脂(高糖)饲料,诱发出胰岛素抵抗。

3、试剂的准备

①高脂(高糖)饲料

高脂(高糖)饲料成分:其中含10%蔗糖,10%猪油,5%胆固醇

由基础鼠饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按质量比搭配制作高脂高糖饲料:其比例为猪油18%,蔗糖20%,蛋黄3%,基础饲料59%。

②STZ溶剂——柠檬酸钠缓冲液的配制

A液和B液的配制:称取柠檬酸(FW:210.14)2.1g加入双蒸水100mL中配成A液;称取柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入双蒸水100mL中配成B液。

柠檬酸钠缓冲液的配制:将A、B液按一定比例混合(1:1.32也有按1:1的),pH计测定pH值,调节pH值到4.2-4.5,即是所需柠檬酸钠缓冲液。

4、注射前准备

配制STZ注射液前,STZ冻干粉放置于干燥灭菌瓶内,外用铝箔纸或锡纸包好,与柠檬酸钠缓冲液一起置于冰浴预冷,带到动物房备用。

注意:STZ冻干粉从?20°C冰箱取出后,于室温干燥避光放置10min左右,使其彻底解冻(很重要)。

5、配制注射液

大鼠过夜禁食(不禁水)后称重并测血糖浓度。对大鼠进行分组,以便按照动物数目和注射剂量来准备STZ注射液。以1%浓度(w/V)溶解STZ,过滤消毒,切记STZ完全溶解。

注意:

①STZ不稳定,易失活,快速称取后剩余试剂仍要求干燥避光,推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸包裹。

②注射时若操作不熟练,切忌不可一次性溶解完STZ。建议根据操作熟练度,分组溶解STZ,比如10只或15只鼠/组。

③亦可提前将STZ按动物分组的所需量称重,分装。

6、注射

按动物空腹体重腹腔或尾静脉注射。如果注射操作技术不熟练,应两组交替注射,注射应在30分钟内完毕。注意:注射大多要求快速注射。

Ⅰ型糖尿病模型:大鼠剂量为70~65mg/kg

Ⅱ型糖尿病模型:高糖高脂喂养1~2个月的大鼠,STZ剂量在25~40mg/kg。

7、注射后

注射完STZ后要给予动物足够的水、食物(糖尿病鼠的基本生活特征),需每日换垫料,保持鼠笼干燥。饲养时,注意避免强日光照射。尽可能勤消毒。

注意:STZ造模后,明显血糖水平波动呈现3个时相,一时性高血糖(1-2h)、短暂低血糖(6-10h)、持续高血糖(>72h)。必须适当补给胰岛素和葡萄糖。

02STZ诱导糖尿病模型建模效果评估指标

与对照组对比,统计以下指标:

1、一般性指标:出现多饮、多食、多尿现象,体重下降;

2、其他指标:空腹血糖、空腹血清胰岛素水平、血清胰岛素水平、胰岛素敏感性、糖耐量等;

3、血清生化指标:T-Cho、TG、HDL-C、LDL-C、CR、BUN、Alt等;

4、病理切片:胰腺组织病理切片。

03STZ诱导糖尿病模型的失败原因解析

模型不达标者,建议,再观察3天,还是不成模型的话,重新注射一次。

04STZ诱导小/大鼠死亡率高的原因解析

1、鼠的体重过低;

2、一定要保证足够的饮水量(饮水量不足容易导致死鼠);

3、高血糖和低血糖都会造成死鼠,避免死鼠可以通过注射胰岛素或暂时补糖,两种途径:①常见为血糖过高。补胰岛素法,补一些中效胰岛素。例如给诺和灵n或NPH(中性鱼精蛋白锌胰岛素),每次2-3个单位,过了3-5天,大鼠一般死亡率就低了;②补糖法,禁食后的鼠,注射的时候已经处于低血糖状态,造模4小时后腹腔注射20%的葡萄糖,可避免因注射时血糖过低死鼠;

4、防止动物自相残杀。食物缺乏和供水不足的情况下,会互相撕杀、啃食同类,所以食物和饮水要供应充足,最好是两路供应;

5、防止感染。糖尿病大鼠尿量多,垫料潮湿,需要勤换垫料,所以糖尿病大鼠较其他大鼠容易出现感染,特别是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后,要注意消毒工作。如每次采血测血糖后可用四环素(或金霉素眼药膏)局部涂抹处理伤口预防感染。

05糖尿病建模的影响因素

06STZ建模方法思路梳理

影响因素标准化是实现建模目的及建模稳定性的保证。理论上,所有的动物建模实验均要求预实验。

以STZ诱导糖尿病模型而言,实验时STZ的给药量应参照预实验的结果,尽量不要盲目按照文献上或他人的给药量来直接使用,鼠均重和空腹(低糖状态)抗药力、禁食时长、注射选时、以及之前饲养过程、测糖选时等都不相同,通过预实验来确定符合自己实验鼠的给药计量,才是最科学的。

07高建模成功率STZ使用指南

08翌圣产品

高成功率:纯度≥98%(HPLC测定);质量稳定,性价比高,现货供应,售后保障。

60256ES60/76

100/500mg

156/386

60256ES80

1g

676.00

60347ES25

20.00

60348ES25

SolventForStreptozocinSTZ链脲佐菌素专用溶剂(用于糖尿病造模)|CAS242-646-8

185.00

类风湿关节炎造模

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种慢性炎症性关节疾病,表现为持续性滑膜炎、全身性炎症,伴有骨骼和软骨侵蚀,最终可导致关节强直和畸形,常见的诱导模型有胶原诱导关节炎(CIA)和佐剂诱导的关节炎(AA)。

1.胶原诱导性关节炎(collagen-inducedarthritis,CIA)建模步骤(仅供参考)

2)将牛二型胶原(CⅡ)溶于冰乙酸溶液中,浓度2mg/mL,4℃过夜。

3)弗氏不完全佐剂补加已灭活的结核杆菌,使其浓度达2-5mg/mL,配制成弗氏完全佐剂。翌圣生物提供的60718ES弗氏完全佐剂中结核杆菌浓度小于10mg/mL。

4)将牛二型胶原(CⅡ)乙酸溶液与弗氏完全佐剂等量混合并乳化。

5)每只实验小鼠背部进行皮下注射,总共0.1-0.2mL。

6)3周后用弗氏不完全佐剂,与牛二型胶原(CⅡ)乙酸溶液等量混合并乳化,每只小鼠尾根部进行皮下注射,总共0.1-0.2mL。

7)病理检查:取实验组和对照组小鼠,去外皮,4%甲醛固定48h以上,5%硝酸脱钙2h,二甲苯浸润,石蜡包埋。制成切片,进行HE染色,用常规光学显微镜观察。

2.佐剂诱导的关节炎(adjuvantArthritis,AA)建模步骤(仅供参考)

2)观察记录:一般在第二次免疫后7-12天小鼠80%以上出现关节炎症状。根据小鼠关节部位红肿及活动程度进行临床症状分级,在实验前和实验后的第3,5,7,12天分别观察记录,等级区分参考如下:

表1.组织学变化评分

等级指数

症状

活动正常,没有红斑和肿胀的迹象

活动正常,皮肤发红,但无明显肿胀

活动稍有影响,足爪脚垫或膝关节有红肿

活动受影响,足爪脚趾或膝关节轻度变形红肿

活动受阻,足爪脚趾或膝关节红肿严重,强直或畸形

3)小鼠测定:采用小鼠爪足体积测量计测定实验前后小鼠后肢关节体积,测量每只小鼠后腿膝关节约5mm以下体积,重复三次,记录取平均值,每三天检测一次。

4)病理检查:取实验组和对照组小鼠,去外皮,4%甲醛固定48h以上,5%硝酸脱钙2h,二甲苯浸润,石蜡包埋。制成切片,进行HE染色,用常规光学显微镜观察。

3.实验案例图片(文献中摘录)

综上图片说明,IFA+CII组病理变化特点和CFA+CII组一样明显,但CFA+CII组病理变化更加严重和明显。

4.常见问题

答案

60718ES弗氏完全佐剂(CFA)与60719ES弗氏不完全佐剂(IFA)的区别是什么?

弗氏完全佐剂(CFA)包含热杀死的非活性化结核杆菌,刺激的免疫反应强烈;弗氏不完全佐剂(IFA)缺少结核杆菌这一成分,刺激的免疫反应较弱。

60718ES弗氏完全佐剂(CFA)中卡介苗的具体含量是多少

卡介苗的含量小于10mg/mL。

用于类风湿关节炎动物造模时,弗氏完全佐剂(CFA)与弗氏不完全佐剂(IFA)怎么选择?

因为大鼠一般比小鼠敏感,所以小鼠一般用CFA,大鼠用IFA也可以,但是CFA会更好用。

分类

类风湿关节炎模型

10mL/5x10mL

高血压(hypertension)以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征,相应的表现在体循环动脉血压(收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg),是一种最常见的慢性病,是心脑血管病最主要的危险因素,常伴有心、肾、脑等器官的功能或器质性损害的临床综合征。高血压的防治研究具有重要的现实意义,其中动物高血压模型的建立是研究高血压的重要环节。

图1.动物高血压模型分类

0101动物遗传性高血压模型1.1自发性高血压大鼠SHR模型

自发性高血压大鼠又称SHR大鼠,高血压的发病率接近100%,是应用最广泛的动物模型。正常大鼠收缩压110-120mmHg,SHR大鼠周龄4-6周后血压开始升高,育成后血压高达200mmHg以上,SHR模型是目前国际上公认的最接近人类原发性高血压的动物模型。

优点:高血压病发生率高,病程较短,可观察到发病过程中靶器官的病理变化。

缺点:培育周期较长,饲养条件有一定的要求,价格比普通大鼠稍贵。

1.2易卒中性自发性高血压大鼠SHRsp模型

易卒中性自发性高血压大鼠又称SHRsp大鼠,高血压的发病率接近100%,脑卒中的发病率接近80%。SHRsp大鼠周龄4-6周后血压开始升高,周龄10-15周后可达200mmHg。

优点:高血压发病率接近100%,脑卒中发病率为80%,是脑卒中研究的理想动物模型。

缺点:培育周期较长,遗传育种麻烦,易变种、断种。

0202药物性诱导的高血压模型2.1血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导

2.1.1实验方法(仅供参考)

2.1.2实验图片(文献中摘录)

应用1:血管紧张素Ⅱ与NaCl溶液饲养28天小鼠,实验组与对照组相比,血压明显升高。

图2.小鼠血压和心率变化情况图(A为收缩压,B为平均血压,C为舒张压,D为心率)

2.2醋酸去氧皮质酮(DOCA)诱导

醋酸去氧皮质酮(DOCA)可抑制肾素血管紧张素系统,导致血浆肾素活性低下,从而介导血压升高,一般通过在皮下植入DOCA缓释泵或注射DOCA,且加NaCl溶液诱导高血压的形成。

2.2.1实验方法(仅供参考)

将250-275g正常雄性大鼠切除左侧肾,并将DOCA与硅胶制成的橡皮介质放置在大鼠两侧肩胛骨之间的皮下,或者切除左侧肾后DOCA按每天50mg/(kg·d)皮下注射,注意在饲养过程中DOCA大鼠需饮用1%NaCl溶液,手术3-5周后测量大鼠血压情况。

2.2.2实验图片(文献中摘录)

应用1:小鼠切除单侧肾后加DOCA,结果显示,对照组小鼠血压较为恒定,但是实验组小鼠的血压明显升高。

图3.小鼠血压变化图

2.3N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)诱导的高血压病动物模型

L-NAME是一氧化氮合酶竞争性抑制剂,而一氧化氮(NO)是促进内皮功能的一种活性物质,一氧化氮升高时血压下降。一氧化氮合酶竞争性抑制剂L-NAME可削弱一氧化氮的舒血管作用而导致高血压病的发生。故可建立NO长期缺乏所致的高血压动物模型,模型实验研究对象多见于大鼠。

2.3.1实验方法(仅供参考)

将3-4周龄雄性大鼠,按20-50mg/(kg·d)腹腔注射(或灌胃)L-NAME,每天给药1次,连续4周,对照组仅腹腔注射(或灌胃)蒸馏水,注意每天监测大鼠的变化。

实验结束后测定实验组和对照组大鼠的体质量、血压、心率、血清生化指标等。

2.3.2实验表格及图片(文献中摘录)

表1.各组大鼠血压变化比较(mmHg)

应用2:大鼠灌溉4周后形成高血压,显著高于相应对照组大鼠的血压,用决明子水提物可降低压力和改善肾脏的病变。

图4.大鼠各组收缩压和平均动脉压的变化

图5.大鼠各组肾脏组织病理学改变

2.4药物性诱导的高血压模型的对比

药物性诱导高血压模型

血管紧张素Ⅱ

(AngⅡ)

醋酸去氧皮质酮

(DOCA)

N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)

方法描述

渗透泵皮下注射法,AngⅡ剂量一般用100ng/(kg·min)

先切除单侧肾,50mg/(kg·d)DOCA皮下注射,同时饮1%NaCI溶液

腹腔注射(或灌胃)20-50mg/(kg·d)L-NAME,如饮1%NaCI溶液可加速成模

造模周期

2-4周

3-5周

4-5周

应用场景

高血压模型

L-NAMEhydrochloride(L-NAMEHCl)

100mg

AngiotensinIIhuman血管紧张素Ⅱ

10mg

DeoxycorticosteroneAcetate

50mg/500mg

结肠炎模型

DextranSulfateSodiumSalt(DSS)结肠炎建模用葡聚糖硫酸钠盐60316ES25MW:36000~50000

25g/100g/500g/1kg

动物急性胰腺炎模型

Caerulein雨蛙素

糖尿病疾病模型

STZ链脲佐菌素Streptozocin糖尿病模型建模试剂

100mg/500mg/1g

官网地址:

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[1]Li,Y.,Dong,J.,Xiao,H.,Zhang,S.,Wang,B.,Cui,M.,&Fan,S.Gutcommensalderived-valericacidprotectsagainstradiationinjuries.GutMicrobes,.2020.1–18.IF=10.245

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THE END
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