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2023.11.12云南
台盼蓝染色法(TrypanBlue)是组织和细胞培养中经典的细胞活率鉴定方法之一。
正常的活细胞，如果细胞膜结构完整，就具有选择透过性，因此能够不让台盼蓝通过细胞膜进入到细胞中，细胞也就不会被染色。而死细胞和濒死细胞细胞膜不完整或膜的通透性增加，可以让胎盘蓝渗透进入细胞而将细胞染色蓝色。因此，使用台盼蓝染色可以简单、快速地区分活细胞和死细胞，获得细胞社群的活率。
左图为正常情况下的台盼蓝染色后视野，右图为异常情况下的台盼蓝染色后镜下视野
绿色荧光(AO)
细胞的两种死法
细胞是组成生物体的基本单元，一般情况下，我们见到的细胞会有两种死亡方式：一种是自然状态下死亡，即细胞自身的老化或营养耗尽造成的死亡，通常会经历比较长的过程；另一种则是被非自然手段破坏而导致的瞬时死亡，比如药物处理、热水煮沸、液氮浸泡等。
两种不同死亡方式会让台盼蓝染色出现不同效果吗？
自然死亡
为了模拟细胞在自然状态下的死亡，研究者将Jukat细胞放置在常温下，并在0、6、12、24、48、72、96、168小时后取出部分细胞和0.8%台盼蓝进行1:1混合染色。
这些“气球”到底是什么呢？是不在一个视野中的细胞呢？还是杂质呢？？
在上面的视频中，台盼蓝染料被缓慢加入在室温中培养了168小时的Jurkat细胞中，大家可以清楚地看到部分细胞被染成蓝色后迅速膨胀和破裂，被染色细胞的颜色随之变浅，细胞失去形态变成了所谓的“气球”，整个过程从发生到结束仅几秒钟。
淡影“气球”状物体，就是死细胞的残骸。但当我们在显微镜下计数时，这些“气球”由于颜色太浅，通常不会被计入其中。因而导致死细胞数和总细胞数被漏计，进而造成细胞活率被高估。研究者将同样的样品分别用荧光核染料AO和PI共同染色、单独用PI染色，并用Cellometer细胞计数仪检测染色后样品的细胞活率，结果如下：
结果显示，台盼蓝染色检测得到的细胞活率(蓝色和红色曲线)总是高于荧光染料AO/PI组和单独PI组检测得到的细胞活率(绿色和紫色曲线)。当细胞活率低于80%时，两种方法检测得到的结果会有显著差距，最高可达30%。鉴于此，有研究者建议，对于细胞活率低于80%的细胞样品，应该用荧光核染法(比如AO/PI)来检测细胞数量和细胞活率。
有研究者将培养后收集的Jurkat细胞分为两份：一份用沸水煮15分钟，一份不作处理。按理说煮熟的细胞，细胞活率应该是0%，不处理的细胞理论上细胞活率为100%。
将这两份细胞按比例混合，制成细胞活率为0%、25%、50%和100%的细胞样品。
将细胞样品分为两份，一份用0.8%台盼蓝溶液与样品细胞按照1:1的体积比混合染色(终浓度为0.4%)，另一份用PI荧光染料与样品细胞混合染色。再分别用Cellometer细胞计数仪检测细胞活率。
上图是细胞活率为100%、50%、0%细胞样品的染色效果，和自然死亡细胞不同的是，热水煮熟后的死细胞台盼蓝染色后细胞都变成了深蓝色，形态完整，没有出现淡影'气球状'细胞。
此外，台盼蓝染色法和与PI染色染色法检测得到的细胞活率高度一致，也和预期设定的细胞活率相当接近。
为什么沸水煮熟后的细胞和自然死亡的细胞在台盼蓝染色后，镜下观察的视野会有这么大的区别呢？
根据数据和镜下观察得到的现象，研究者们提出一个假设，就是细胞膜通透性增加而依然保持完整时，胎盘蓝可以进入并留在细胞内，细胞呈深蓝色并具有细胞形态；当细胞膜破损时，进入细胞中的台盼蓝就会随着细胞质漏出细胞外，扩散到周围，形成类似“气球”状的物体，细胞形态随之消失。简单的说，就是细胞这个大气泡破了，里面的台盼蓝溢了出来。
上图统计了不同浓度胎盘蓝检测到的死细胞(深着色)和'气球'状细胞的浓度。
所以，Nexcelom公司建议所有Cellometer用户使用0.2%的台盼蓝和细胞样品1:1混合后(终浓度0.1%)上机检测。
为进一步研究不同浓度台盼蓝对细胞形态产生的影响，研究者分别用明场光学显微镜和相差显微镜对0.4%和0.1%台盼蓝染色的细胞进行拍照，结果如下：
3）台盼蓝的浓度适中，不可过高也不可过低
当然，如果想要获得更准确、更精确的细胞数量及细胞活率检测结果，需要升级装备、鸟枪换大炮，把单通道的台盼蓝染色细胞计数仪升级为双通道的荧光核染色细胞计数仪！还是那句话，要想有好的效果，必须得有好的装备！