1、医学细胞生物学实验指导人民卫生出版社PEOPLESMEDICALPUBLISHINGHOUSE主编杨康鹃王振华人民卫生出版社PEOPLESMEDICALPUBLISHINGHOUSE副主编朱金玲杨国华黄健潘智芳霍满鹏编委（以姓氏笔画为序）王振华青岛大学医学院冯卫国潍坊医学院朱金玲佳木斯大学医学院刘英芹佳木斯大学医学院刘金成青岛大学医学院杨国华武汉大学医学院杨康鹃延边大学基础医学院吴群英桂林大学基础医学院张静延安大学医学院人民卫生出版社PEOPLESMEDICALPUBLISHINGHOUSE张子波延边大学基础医学院岳凤珍
2、兰州大学基础医学院金艳花延边大学基础医学院金雄吉延边大学基础医学院高志芹潍坊医学院黄健桂林大学基础医学院蒋林彬桂林大学基础医学院蒲力群延安大学医学院慕明涛延安大学医学院潘智芳潍坊医学院霍满鹏延安大学医学院实验一显微镜的结构和使用方法一、目的要求(一)熟悉普通光学显微镜的主要构造、成像原理、操作方法，掌握低倍镜、高倍镜和油镜的使用方法。(二)了解其他类型的光学显微镜成像原理和应用范畴。(三)了解电子显微镜的工作原理及构造，初步了解电镜样品的制备技术和方法。二、实验内容（一）普通光学显微镜实验原理：光镜是根据光学原理，采用一组玻璃透镜制作而成。外部光线经反光镜反射入
3、聚光镜，聚光镜将光线会聚在被观察的标本上，照亮标本，便于观察。当光线透射标本进入物镜后，物镜将标本作第一次放大，形成一个倒立的实像。光线再经过目镜进入人眼,目镜将第一次放大的实像作第二次放大,此时便在人的视野中得到一个放大的倒立虚像，成为显微镜的观察图像。光学显微镜的成像原理模式图普通光学显微镜结构示意图1.光镜的基本构造与性能不同型号的光学显微镜示例（1）低倍镜的使用（2）高倍镜的使用（3）油镜的使用2.光学显微镜的使用方法（1）字母装片的观察（2）毛发交叉装片的观察（3）血涂片的观察3.低倍镜、高倍镜和油镜的使用练习（1）取用显微镜要避免目镜和其他零部件滑落；
4、（2）目镜不可随便取出以免灰尘落入镜内影响观察；（3）显微镜的光学部件清洗时只能用擦镜纸轻轻向一个方向擦拭，不可用纱布、手帕或普通纸揩擦，以免损坏镜头；4.注意事项（4）使用显微镜观察标本时，要注意不能一边在目镜中观察，一边上升载物台，以避免镜头与玻片接触，损坏镜头或玻片标本。观察时，应两同时眼开、双手并用，反复多次练习，做到能够一边观察，一边计数或绘图记录；（5）显微镜使用完毕后应及时复原,先下降载物台,取下玻片,使物镜转离透光孔，反光镜垂直底座,然后放回镜箱。4.注意事项1.相差显微镜2.暗视野显微镜3.倒置显微镜4.荧光显微镜5.共聚焦显微镜（二）其他类型光
5、学显微镜成像原理：相差显微镜借助环状光阑和相位板两个部件的作用，将相位差转变为人眼睛可分辨的振幅差（明暗差）。光线经过透镜会聚成束,发生互相叠加或互相抵消的干涉现象,使原来透明的活体表现出肉眼明显可见的明暗区别。1.相差显微镜应用范畴：相差显微镜能够比较清楚的观察到活细胞及活细胞内的某些细微结构甚至对细核、线粒体等细胞器的动态研究，而无需对细胞进行固定和染色等处理。1.相差显微镜成像原理：暗视野显微镜可用普通光镜改装而成，其聚光器底部的中央有一块遮光板，使进入反光镜的中央光不能直射入物镜，而仅允许光线从聚光器斜向照明被检标本，再经标本反射进入物镜成像。使用时应注
6、意物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径，否则会破坏或降低暗视场的照明。2.暗视野显微镜应用范畴：这种显微镜能比较方便的观察活体的细胞或微小生物的运动情况，但不能分辨清楚其内部微细结构。2.暗视野显微镜成像原理：倒置显微镜的物镜位于标本的下方，而光源位于标本的上方，即物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来。应用范畴：其主要用于无色透明的活体观察及细胞培养时观察培养瓶中的细胞生长情况。3.倒置显微镜倒置显微镜成像原理：荧光显微镜是利用一定波长的光（通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检标本，激发标本内物质发出可见的荧光，通过物镜和目镜的放大成像，视野中呈现出荧光映像。细胞内大
7、部分物质经紫外光等短光波照射后，可发出较弱的荧光；但有些物质需经荧光染料染色后才能发出荧光,进而对组织进行细胞化学的观察和研究。4.荧光显微镜荧光显微镜的主要部件：激发滤片可吸收可见光，产生单色光源；阻挡滤片可阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线，起到保护眼睛的作用。4.荧光显微镜应用范畴：观察细胞内经紫外光等短光波照射后可发出较弱的荧光的物质；某些组织进行细胞化学的观察和研究时有些物质需经荧光染料染色后才能发出荧光。4.荧光显微镜发展史：1955年，MarvinMinsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。1957年，Marvin
10、光谱重叠的不同染料，也可以获取未知染料的发射光谱曲线。5.共聚焦显微镜（6）串色功能：串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。5.共聚焦显微镜（三）电子显微镜电子显微镜（electronmicroscope）：是使用电子来展示物件的内部或表面的显微镜.高速的电子的波长比可见光的波长短。电子显微镜的分辨率约0.1nm，光学显微镜的分辨率约0.2m。1.电子显微镜的组成电子源电子透镜真空装置样品架探测器电子显微镜2.电子显微镜的工作原理电子显微镜是利用高压加速电子束
11、为照明源，在高真空系统中，快速电子照射样品时，入射电子要与样品物质中的原子结构发生碰撞作用，原子核与核外层电子都会对入射电子有碰撞引起的散射，导致部分电子的运动方向和能量变化.样品中不同结构不同区域致密度不同,散射程度也不尽相同，所以穿过样品的初射束是不均匀的电子束，束内电子密度各处互有差异，当其投射到荧光屏上就会形成描绘结构信息的可见光强度反差图像。因此，电子显微镜的成像机理是散射。3.电镜样品制备技术和方法超薄切片的制作步骤包括：取材固定脱水包埋切片染色4.样品的观察、识别和分析学习侧插式样品支架的使用方法，按仪器操作说明书实际操作演示，并将准备好的超薄切片铜网放入支
12、架上。给电镜进样、启动高压获得照明。假如电子光学系统已经对准调好状态，那就用样品移动杆选择观察视场，调节中间镜电流到适当的放大倍数。配合调节第二聚光镜选择合适的亮度,开始观察分析荧光屏上的结构图像。预先选择准备好的动物或植物样品切片供观察分析。实验二细胞的基本形态结构观察及其细胞计数和显微测量前言所有需观察的细胞都应放置到无色透明的载玻片上制备成临时或永久玻片标本后，才适于在光镜下观察，大多数情况下还需在细胞或组织上加盖一张盖玻片，以起到保护标本和显微镜镜头等作用。一、实验目的（一）熟悉光学显微镜下植物细胞和动物细胞的基本形态结构。（二）掌握临时制片和显微绘图的方法。（三）
13、熟悉细胞的计数和显微测量方法。（四）掌握X染色质标本的制备方法。（五）熟悉X染色质的形态特征和计数方法。1.器材：显微镜、载玻片、盖玻片、消毒牙签、吸水纸、擦镜纸、目镜测微尺、镜台、测微尺、小镊子、吸管、解剖刀、牙签、染色缸、纱布、吸水纸、擦镜纸。2.试剂：1%伊红染液、次甲基蓝染液或1%碘液、生理盐水、固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、5mol/L的HCl溶液、香柏油、乙醚、无水乙醇、硫堇染液或0.2%甲苯胺兰染色液3.材料：洋葱、人口腔黏膜上皮细胞二、实验器材和试剂（一）洋葱表皮细胞临时标本的制备和观察1.实验方法擦拭载玻片（如右图）；取一干净载玻片，中央滴加
14、伊红染液一滴；从洋葱鳞茎内侧用刀在其凹面划一约4mm2的小块，用镊子撕下很薄的一片表皮，置于载玻片的染液中；三、实验内容、原理及其方法载玻片擦拭方法将表皮展平放于染液中，用镊子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的染液，慢慢倾斜盖上盖玻片,注意防止产生气泡。（一）洋葱表皮细胞临时标本的制备和观察（2）洋葱表皮细胞结构观察:（一）洋葱表皮细胞临时标本的制备和观察低倍镜下观察（洋葱鳞叶表皮细胞排列整齐）细胞核细胞质细胞壁1.洋葱表皮细胞临时标本的制备和观察高倍镜下观察细胞壁制备：1)在洁净的载玻片中央，滴一滴甲基蓝染液或碘液。2)用消毒牙签的一端，在口腔侧壁上轻
15、轻地刮几下。3)将牙签放在载玻片上的染液中涂匀。4)盖上盖玻片，避免产生气泡，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的液体。5)用显微镜观察细胞形状，细胞呈扁平鳞状。（二）人口腔上皮细胞临时标本的制备及观察（二）人口腔上皮细胞临时标本的制备及观察结果观察：细胞膜细胞核细胞质注意事项：力度适中：过轻则刮取细胞量少，不易观察；过重则可能会引起口腔出血。黏膜选择：口腔内粉红色黏膜均可,以下唇内侧黏膜最佳。（二）人口腔上皮细胞临时标本的制备及观察（三）人体口腔颊部黏膜上皮细胞的显微测量镜台测微尺目镜测微尺镜台测微尺总长度为1mm,分为100个小格。镜台测微尺每小格实际长度=0.01mm=1
16、0m012345678910目镜测微尺镜台测微尺目镜测微尺的每格实际长度=镜台测微尺刻度/目镜测微尺的刻度镜台测微尺每格实际长度=40/2010m=20m（低倍镜下）目镜测微尺长度随放大倍数发生改变！目境测微尺标定方法（四）X染色质标本的制备、观察1.实验原理X染色质是女性细胞分裂间期核内的一种特有染色质,位于核膜边缘,一般呈三角形,半圆形或扁平形等，为异固缩小体。正常女性间期核X染色质出现率为1059数目为X染色体的数目减1通过进一步计算X染色质阳性率，可以在胚胎期较为准确的判断胎儿性别,当临床上怀疑有X染色体数目异常时，也可以作为辅助诊断方法,对于没有条件开展染色体检
17、查的地区不失为一种经济实用的方案。（四）X染色质标本的制备、观察2.实验方法(1)离心法受检者清水漱口后，以牙签稍用力刮取口腔黏膜细胞，用生理盐水洗下，1000r/min,离心10分钟,弃上清液,立即用3:1甲醇-冰醋酸固定液固定10分钟，在离心10分钟,800r/min1000r/min，弃上清液。然后，加入少许新配固定液，涂片法涂一均匀薄层待干，将玻片标本直接放入盛有0.2%甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，立即以流水冲洗，镜检。（四）X染色质标本的制备、观察(2)直接涂片法受检者用清水漱口后，以消毒牙签的钝头刮取口腔颊部黏膜，将刮取的细胞均匀涂布在洁净的载玻片上(约一
18、张盖玻片大小),用记号笔标记细胞面,不等涂布干燥，立即放入3：1甲醇-冰醋酸固定液中固定15分钟后取出玻片标本置于5mol/L的HCl中，水解15分钟，充分冲洗，除去多余盐酸。0.2%甲苯胺蓝染液染色5分钟，自来水冲洗，干燥后镜检。（四）X染色质标本的制备、观察3.观察将制备好的标本置于低倍镜下观察，找到分散良好，彼此无重叠的细胞后，转换高倍镜，将细胞核完整、核内染色均匀清晰无其他异固缩的浓染颗粒的细胞移至视野中央,加一滴香柏油观察X染色质.在光学显微镜下可见到X染色质为一结构轮廓清楚染色较深的小体，约在1m左右。（四）X染色质标本的制备、观察高倍镜下示X染色质(1)刮口腔黏膜时,应取较
21、粒体、高尔基复合体、溶酶体、中心体、微管、微丝等。有些细胞器体积较大，通过不同的染色方法可在光镜下观察到；而有些细胞器由于体积非常小，只能在电镜下才能观察到。通常把在光镜下所见到的结构称为显微结构，电镜下所见到的微细结构则被称为亚显微结构或超微结构。前言一、目的要求（一）观察并熟悉光镜下线粒体、高尔基复合体、中心体和细胞骨架的形态和分布。（二）掌握人口腔黏膜细胞线粒体活体染色的原理，了解其操作步骤。（三）掌握洋葱鳞茎表皮细胞骨架标本显示方法的原理，了解其操作步骤。（四）掌握液泡系活体染色的原理，了解其操作步骤。（五）熟悉纤毛运动的标本制备及观察方法。二、实验器材和试剂1.
22、材料：洋葱鳞茎、人体口腔颊部黏膜上皮细胞。2.仪器与用品：光镜、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、牙签、小镊子、吸管、解剖刀、牙签、染色缸、纱布、吸水纸、擦镜纸。3.试剂：1%伊红染液、1%碘液、生理盐水、固定液、5mol/L的HCl溶液、香柏油、乙醚、无水乙醇、0.2%甲苯胺兰染色液等。三、实验内容（一）高尔基复合体、线粒体、中心体标本观察（二）人口腔黏膜细胞线粒体活体染色的标本制备及观察（三）洋葱鳞茎表皮细胞骨架标本制备及观察（四）液泡系活体染色标本制备及观察（五）纤毛运动的临时标本制备及观察高尔基复合体在光镜下呈网状、点状或线状结构。线粒体在光镜下
23、呈线状、粒状、杆状、圆形、哑铃形、星形、分枝状等。中心体在光镜下呈球状或点状颗粒，包括中心粒和中心粒旁物质。（一）高尔基复合体、线粒体、中心体标本观察1.高尔基复合体的观察兔脊神经节切片在脊神经节细胞的细胞质中高尔基复合体呈棕褐色颗粒状、线状或卷曲成网状低倍镜下的兔脊神经节高倍镜下的兔脊神经节油镜下的兔脊神经节细胞示高尔基复合体1.高尔基复合体的观察兔脊神经节切片神经细胞细胞核高尔基复合体2.蟾蜍肾小管上皮细胞线粒体的观察在细胞质中有许多被染成蓝黑色的线状或颗粒状的结构，即线粒体。低倍镜下的蟾蜍肾小管上皮高倍镜下的蟾蜍肾小管上皮油镜下的蟾蜍肾小管上皮（示线粒体）2.蟾蜍肾小管
24、上皮细胞线粒体的观察在有丝分裂中、后期的受精卵的两极各有一个被染成深蓝色的小颗粒,即为中心粒。中心粒的周围有一层较致密的物质,称为中心粒旁物质(中心球），中心粒和中心粒旁物质共同组成中心体。3.中心体的观察马蛔虫子宫横切片受精膜围卵腔第一极体第二极体高倍镜下的马蛔虫子宫横切片低倍镜下的马蛔虫子宫横切片3.中心体的观察马蛔虫子宫横切片中心体有丝分裂中期和后期的受精卵示中心体3.中心体的观察马蛔虫子宫横切片第一极体第二极体中心体（二）线粒体标本制备和观察1.实验原理詹纳斯绿B（JanusGreenB）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态而呈蓝绿色，而
25、在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。在光镜下很容易观察到这种呈现特殊颜色的线粒体。2.实验方法滴2滴詹纳斯绿B染液于玻片中央用牙签刮取口腔颊部黏膜细胞于染液中混匀染色（5min10min）加盖玻片观察（二）线粒体标本制备和观察3.结果观察光镜下可见在接近无色的口腔黏膜上皮细胞的细胞质中散布着一些蓝绿色的短杆状或颗粒状的线粒体。（二）线粒体标本制备和观察（三）细胞骨架的制备与观察洋葱鳞茎表皮1.实验方法：取材：洋葱鳞叶表皮浸入PBS中5min，2%TritonX-100处理（37，2030min）；M-缓冲液洗23次，每次5min；3%戊二醛固定10m
26、in，PBS洗23次，3min；0.2考马斯亮兰染色8min;PBS洗23次,每次3min;镜检。2.结果观察低倍镜下的洋葱鳞茎表皮细胞高倍镜下的洋葱鳞茎表皮细胞（三）细胞骨架的制备与观察洋葱鳞茎表皮油镜下的洋葱鳞茎表皮细胞示细胞骨架（三）细胞骨架的制备与观察洋葱鳞茎表皮（四）液泡系活体染色标本制备及观察1.实验原理在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外全部属于液泡系，包括高尔基复合体、内质网、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。蟾蜍软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系
27、发达。中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白质有关。显微镜下可见软骨细胞为圆形或椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色、大小不一的小泡，即液泡系（右图箭头所示）。2.实验结果观察（四）液泡系活体染色标本制备及观察液泡系（五）纤毛运动临时标本制备及观察1.实验原理纤毛是细胞表面向外伸出的细长突出,长约510m，它是细胞表面的一种特化结构,具有复杂的内部结构和运动功能。在哺乳动物中,纤毛只出现在一些特定的部位，如呼吸道和雌雄生殖管道等的上皮、脑室的室管膜细胞等处。蟾蜍的上颌部黏膜上皮细胞表面排列密集的短而多的
28、纤毛，呈双相搏动而使生理盐水出现旋涡状的纤毛移动现象。（五）纤毛运动临时标本制备及观察1.实验方法（1）肉眼观察蜡屑移动：用捣脊髓法将蟾蜍处死之后，立即将蟾蜍腹部朝上固定在蜡盘上，沿两侧口角向后剪开约1(用棉花止血)，将下颌翻转固定在腹部，在上颌中线距喉头1处放置蜡屑，观察蜡屑移动。（五）纤毛运动临时标本制备及观察（2）纤毛临时标本片制备制片方法：用眼科剪刀剪取咽头前部的上颌黏膜约2mm2mm小块，用小镊子挟取剪下的黏膜，将纵切面贴于载玻片上，加一滴生理盐水，再加盖片。结果观察：显微镜下可见在黏膜上皮细胞表面排列密集的短而多的纤毛，呈双相搏动而使生理盐水出现旋涡状的纤毛移动现象。绘制
29、光镜下线粒体、高尔基复合体、中心体和细胞骨架的形态和分布图。用语言来描述显微镜下纤毛运动的特点。绘制显微镜下蟾蜍胸骨剑突下软骨液泡系的形态结构。四、实验报告细胞化学成分显示实验四一切细胞都是由蛋白质（包括酶）、核酸、脂类及糖等成分所构成，它们均具有不同的物理化学特性。应用细胞化学方法可对细胞内多种化学成分进行分析。细胞化学(cytochemistry）技术是在保持细胞原有形态结构的基础上，加上一定试剂，使它与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。前言一、目的要求（一）掌握血涂片及骨髓涂片制作方法。（二）掌握
30、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶显示的原理、化学成分显示的方法、在细胞中的分布。（三）掌握碱性蛋白和酸性蛋白显示的原理、化学成分显示的方法、在细胞中的分布。（四）掌握过氧化氢酶显示的原理、化学成分显示的方法、在细胞中的分布。（五）掌握核酸显示的原理、化学成分显示的方法、在细胞中的分布。二、实验器材和试剂1.材料：小鼠腹腔液涂片、小鼠肾脏冰冻切片、蟾蜍血涂片、家兔、马铃薯、洋葱根尖。2.仪器与用品：注射器、解剖剪、眼科剪、眼科镊、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、吸管、吸水纸、染色缸、牙签、染色缸、显微镜、冰冻切片机。二、实验器材和试剂3.试剂：6淀粉肉汤、酸性磷酸酶作用液、甲醛钙固
31、定液、0.05ml/L醋酸缓冲液、2硫化铵液、孵育液、2甲基绿水溶液、甘油明胶；95乙醇、25三氯醋酸、0.2快绿、0.005Na2CO3、1/75mol/LHCl、总蛋白染色液（pH2.2）、碱性蛋白染色液（pH8.0）；3%过氧化氢、0.1%钼酸胺、生理盐水、1%联苯胺、联苯胺混合液、0.5%硫酸铜溶液、1%番红、甲基绿-派洛宁染液、醋酸缓冲液、纯丙酮等。三、实验内容和实验方法碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的显示碱性蛋白和酸性蛋白的显示过氧化氢酶的显示DNA和RNA的显示（一）酸性磷酸酶的显示1.实验原理酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）是一种在酸性pH
32、范围内能水解酸性单酯的酶。主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内,常作为溶酶体的标志酶.在溶酶体膜稳定完整时，底物（-甘油磷酸钠）不易渗入,ACP活力微弱或无活性。经固定，在合适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。此酶在pH5左右发生作用,能分解磷酸酯而释放出磷酸基(PO43-)，PO43-可与铅盐结合形成磷酸铅沉淀，因其是无色的，需再与黄色的硫化胺作用，生成棕黑色PbS沉淀而被显示出来。-甘油磷酸钠甘油PO43-PO43-Pb（NO3）2Pb3（PO4）2Pb3（PO4）2（NH4）2SPbS（棕黑）（一）酸性磷酸酶的显示金属沉淀法
33、小鼠每日腹腔注射6淀粉肉汤lml,连续3天；第3天注射34小时后,处死小鼠，剖开腹腔,吸取腹腔液，用冰片作临时制片；入37酸性磷酸酶作用液30min；蒸馏水漂洗；10甲醛钙溶液后固定5min；蒸馏水漂洗；2硫化铵溶液35min；蒸馏水漂洗；晾干，镜检。2.实验方法（一）酸性磷酸酶的显示对照实验：入酸性磷酸酶作用液前先用高温50处理30min，使酶失去活性，作好标记,然后同时进行上述过程。或对照组的酸性磷酸酶作用液中不加-甘油磷酸钠，而以蒸馏水代替。（一）酸性磷酸酶的显示小鼠腹腔巨噬细胞为不规则状，阳性细胞内分布有棕褐色颗粒即为酸性磷酸酶所在。3.结果分析（一）酸性磷酸
34、酶的显示碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）在碱性条件下(pH9.09.4)使孵育液中的底物-奈酚磷酸钠水解,产生-奈酚,后者再与偶氮盐偶联生成不溶性耐晒染料。其最终颜色因所用的偶氮盐种类不同而异。（二）碱性磷酸酶的显示1.实验原理新鲜肾脏冰冻切片。室温下入孵育液20min左右。蒸馏水洗数次。2甲基绿复染细胞核10min。水洗、晾干、甘油明胶封片。2实验方法偶氮偶联法(二）碱性磷酸酶的显示细胞质中紫蓝或紫黑色物质即为碱性磷酸酶所在，核为绿色。3.结果分析（二）碱性磷酸酶的显示（三）碱性蛋白和酸性蛋白的显示1.实验原理以酸性氨基酸成分为主的蛋白
35、质为酸性蛋白;以碱性氨基酸成分为主的蛋白质为碱性蛋白。细胞核内有组蛋白（碱性蛋白）及少量酸性蛋白，细胞质中主要有酸性蛋白，标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，用不同pH值的快绿染液分别染色，可使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白显示出来。2.实验方法制备蟾蜍血涂片（如右图）。（1）固定：70%乙醇，10min；（2）抽提核酸：70905%三氯醋酸，1520min;（3）在冷5三氯醋酸溶液漂洗后，蒸馏水洗3次，每次5min；（4）染色:酸性蛋白染色液1015min,碱性蛋白染色液3060min;（5）清水冲洗，晾干;（6）镜检。（三）碱性蛋白和酸性蛋白的显示3.结果分析右图显示的是在低倍镜和
36、油镜下细胞内碱性蛋白质分布图：核被染成绿色就是碱性蛋白所在部位。(三）碱性蛋白和酸性蛋白的显示低倍镜油镜蟾蜍血涂片显示细胞核内碱性蛋白右图显示：在高倍镜下细胞胞质内遍布绿色，是酸性蛋白所在部位，细胞核内绿色稀少。（三）碱性蛋白和酸性蛋白的显示蟾蜍血涂片显示细胞质内酸性蛋白（四）DNA和RNA的显示1.实验原理利用碱性染料甲基绿和派洛宁处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异是由DNA和RNA聚合程度的不同所引起。甲基绿DNA聚合程度高绿色派洛宁RNA聚合程度低红色制备蟾蜍血涂片：同上；固定：95%乙醇，10min，晾干；染色：甲基绿-
37、派洛宁，10min；清水冲洗，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干；分化：将血涂片在纯丙酮中迅速地过一下，进行分化，取出晾干；镜检。2.实验方法（四）DNA和RNA的显示3.结果（四）DNA和RNA的显示右图显示：在低倍镜下细胞核内遍布绿色，是DNA所在部位，稀少粉色是RNA。细胞胞质内遍布粉色，是RNA所在部位。蟾蜍血涂片显示核酸分布（五）过氧化氢酶的显示1.实验原理酶是活细胞中具有催化功能的一类生物催化剂。在显示细胞中的酶时，往往利用反应产物本身的颜色或与某些试剂作用后出现的特殊颜色反应，从而间接地将相应的酶在细胞中的分布显示出来。2H2O22H2O+O
38、2过氧化氢酶联苯胺联苯胺蓝联苯胺腙（蓝色）（棕色）细胞代谢过程中会产生H2O2，细胞中的过氧化氢酶，能使H2O2分解，生成H2O放出O2。过氧化氢酶系还能把许多胺类物质氧化为有色化合物：因而可以根据颜色反应来判定细胞中过氧化氢酶的有无或多少！（五）过氧化氢酶的显示2.实验方法处死动物：用气栓法将家兔处死；取材和制片：取股骨，制备骨髓涂片，晾干；固定：将涂片放入0.5%硫酸铜溶液中固定3060s；（五）过氧化氢酶的显示氧化：取出涂片直接转入装有联苯胺混合液的染色缸中36min；冲洗：自来水冲洗；染色：滴23滴1%番红溶液于涂片上,染色12min；冲洗：自来水冲洗,晾干；观察。（
39、五）过氧化氢酶的显示3.结果细胞内棕色颗粒即为过氧化氢酶所在部位（五）过氧化氢酶的显示四、实验报告1.绘图描述细胞内碱性磷酸酶和酸性磷酸酶、碱性蛋白和酸性蛋白、过氧化氢酶阳性结果图。2.绘图描述细胞内DNA和RNA的分布。实验五细胞组分的分离与鉴定一、实验目的与要求1.掌握差速离心法分离细胞器的原理。2.掌握离心机和匀浆器的使用方法。二、实验材料和用品1.实验材料：小白鼠、冰块。2.仪器设备与用品：玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、
40、纱布、螬盘、平皿。3.药品与试剂：0.25molL蔗糖0.003molL氯化钙溶液、1甲苯胺兰染液、0.02詹纳斯绿B染液、0.9NaCl溶液。三、实验内容1.实验原理2.实验方法3.实验结果与分析4.注意事项（一）实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆,在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离,其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步。匀浆离心细胞核线粒体等离心（二）差速离心法-分离细胞核和线粒体细胞核的分离提取用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，
41、迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织）尽快置于盛有0.9NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25molL蔗糖0.003molL氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后,再全部加入。细胞核的分离提取3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨35次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中。4.将装有滤液的离心管配平后,放入离心机,以2500r/min，4离心15分钟；缓缓取上清液，移入高速离心管，保存于有冰块的烧杯中，余下的
42、沉淀物进行下一步骤。细胞核的分离提取5.用6ml0.25mol/L蔗糖-0.003molL氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，自然干燥。6.将涂片用l甲苯胺兰染色后盖片即可观察。高速离心分离提取线粒体将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000r/m离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。加入0.25molL蔗糖0.003molL氯化钙液lml,用吸管吹打成悬液，以17000r/m离心20分钟,将上清吸入另一试管中,留取沉淀物,加入0.1ml0.25molL蔗糖-0.003molL氯化钙溶
44、持细胞器的完整性，避免剧烈的机械操作。由于核沉淀中可能依然存在大量因为粘连或缠绕而沉淀的线粒体,所以可酌情将步骤(5)中洗涤核沉淀后离心得到的上清，与步骤（4）的上清合并加以利用。由于线粒体进行活性染色法的检测，所以样品制备好后应尽快染色，不要放置过久。四、实验报告1.将分离到细胞器（线粒体、细胞核）绘图描述显微镜下所见结果。2.估计分离所得的细胞和线粒体的纯度。3.根据你的体会，写出操作注意事项及改进方法。实验六细胞生理功能性实验一、目的与要求（一）观察巨噬细胞的吞噬活动。（二）掌握小鼠腹腔注射给药和脱颈椎处死方法。（三）掌握死活细胞鉴别的原理及方法。（四）通过观察加深理解细胞膜
45、的通透性的生理活动。二、实验器材和试剂1.材料：小白鼠、酵母悬液。2.仪器与用品：普通离心机、试管、试管架、光学显微镜、2ml注射器、载玻片、盖玻片、解剖器材、滴管等。3.试剂：0.15mol/LNaCl溶液、0.005mol/LNaCl溶液、氯仿、0.8mol/L甲醇溶液、0.8mol/L丙三醇溶液、2%TritonX-100、肝素抗凝剂（500U/ml）、l鸡血悬液、6淀粉肉汤、0.3台盼兰、酵母悬液0.2亚甲基蓝染液等。三、实验内容（一）细胞吞噬活动观察（二）活细胞和死细胞的鉴定（三）细胞膜的通透性观察（一）细胞吞噬活动观察1.实验原理白细胞
46、是机体防御系统中能游走的单位。它分为粒细胞系、单核细胞系、淋巴系三类。单核细胞由血液进入组织后逐渐演变成巨噬细胞。吞噬细胞首先由于趋化作用而向异物游走,然后伸出伪足包围异物,并发生内吞作用形成吞噬泡将异物吞入细胞,继而溶酶体与吞噬泡融合消化异物。2.实验方法实验前2天，每天向小鼠腹腔注射6淀粉肉汤0.51ml(含0.3台盼兰);实验时，每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1鸡血悬液0.51ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀;（一）细胞吞噬活动观察示小鼠腹腔注射方法1小时后，用颈椎脱位法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹壁，向腹腔注0.5ml1ml生理盐
47、水，用牙签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀;用注射器抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖片;镜检。（一）细胞吞噬活动观察颈椎脱位法3.实验结果与分析在高倍镜下，数量较多、体积较大、圆型或不规则的细胞，其表面有许多似刺状的小突起，胞质中有许多数量不等的蓝色颗粒（为吞入的含台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡）即为吞噬细胞。（一）细胞吞噬活动观察（一）细胞吞噬活动观察高倍镜下显示吞噬细胞（吞入了台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡的吞噬细胞）（一）细胞吞噬活动观察箭头所示正在吞噬肉汤的细胞(二)细胞活性的鉴定酵母菌1.实验原理许多染料不易穿过活细胞的质膜进入细胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来鉴
48、别死活细胞。2.实验方法取酵母悬液一滴于洁净玻片上，滴一滴0.2亚甲基蓝染液，加盖片，2分钟后于显微镜下观察细胞。(二)细胞活性的鉴定酵母菌3.实验结果显微镜下可见死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。(二)细胞活性的鉴定酵母菌（三）细胞膜的通透性1实验原理细胞膜是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生
50、层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血，镜检红细胞完好呈双凹盘状。(2)如果试管内液体浑浊，上层带红色者，称不完全溶血，镜检有部分红细胞呈碎片。(3)如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血，镜检发现细胞全部呈碎片。（三）细胞膜的通透性四、实验报告1.绘制小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程图。2.记录小鼠红细胞在不同溶液中的形态变化并对结果进行分析。细胞分裂标本制备及观察实验七前言细胞增殖是生命的基本特征之一，生命能够不断的延续，最重要的基础就是依靠细胞的生长和增殖。细胞增殖是通过分裂过程实现的。细胞处于活跃增殖状态，任何动植物组织可通过各种处理方法后，细胞可以进入分裂期，就可用于染
51、色体分析。细胞增殖分裂可分为无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。本实验主要介绍动植物细胞的有丝分裂标本制备方法和各期形态特征；动物细胞减数分裂标本制备方法、各期形态特征及其观察要点。一、目的与要求（一）初步掌握动物细胞有丝分裂和减数分裂标本的制备方法。（二）掌握动物细胞有丝分裂和减数分裂各期的主要形态特征和区别点。二、实验材料和用品1.材料：洋葱根尖纵切片标本、马蛔虫子宫切片标本；性成熟雄性小白鼠。2.仪器与用品：光学显微镜、培养箱、CO2孵箱、水浴箱、离心机、解剖盘、解剖刀、镊子、剪刀、注射器、吸管、刻度离心管、小烧杯、培养皿、载玻片3.试剂：100g/ml（0.1%）秋水仙
52、素、1mol/L盐酸、2%柠檬酸钠、0.075mol/L氯化钾溶液、Garnoy固定液、1/15mol/L磷酸盐缓冲液、60%乙酸、500g/ml（0.5%）甲苯胺蓝染液、改良碱性品红染液、10%Giemsa染液等。三、实验内容（一）动物细胞有丝分裂观察（马蛔虫卵切片）（二）植物细胞有丝分裂观察（洋葱根尖压片）（三）植物细胞有丝分裂标本的制备及观察（四）小鼠骨髓细胞染色体标本的制备及观察（五）小鼠精巢细胞减数分裂标本制备及观察（一）动物细胞有丝分裂标本观察1.实验原理有丝分裂是真核细胞分裂的主要方式之一，在分裂的过程中发生了一系列的形态变化，包括核分裂、染色体和纺锥体的出现，染色体
53、平均分配到两个子细胞等。根据形态学特征，人为地将有丝分裂分为前期、中期、后期和末期。植物根尖细胞、动物卵细胞等分裂旺盛的细胞，经固定染色制成光镜压片或切片，可以观察到有丝分裂过程中各时期的形态特征及变化规律。1.马蛔虫受精卵子宫切片观察将马蛔虫子宫切片放在低倍镜下观察，可见子宫周边为子宫壁，壁内为子宫腔，腔内有许多处于不同发育阶段的圆形卵细胞。（一）动物细胞有丝分裂标本观察低倍镜下马蛔虫子宫切片图像高倍镜下可见马回虫子宫腔内大量受精卵处于有丝分裂的各个时期的形态特征。（一）动物细胞有丝分裂标本观察高倍镜下马蛔虫子宫腔内各个分裂期的受精卵马蛔虫受精卵最外层有较厚而染色极深的受精膜（亦称卵
54、壳），在受精膜内侧和受精卵边缘，各有一深染小体，分别称为第一极体和第二极体。受精膜内有围卵腔，受精卵细胞在围卵腔内分裂。（一）动物细胞有丝分裂标本观察卵壳受精卵细胞卵膜围卵腔高倍镜下马蛔虫受精卵形态特征示意图有丝分裂中期和后期的受精卵示中心体和极体第一极体第二极体中心体右图是尚未分裂的受精卵，有两个核，一个雌原核和一个雄原核，核内含细丝状染色质。（一）动物细胞有丝分裂标本观察马蛔虫受精卵示雌、雄原核马蛔虫受精卵子宫切片中有丝分裂各期形态特征前期：核膨大，中心粒分开逐渐向细胞的两极移动，中心粒周围有呈放射状的星射线。染色质缩短变粗形成染色体，核膜核仁消失，纺锥体开始形成。（一）动物细胞有丝
55、分裂标本观察高倍镜下示前期分裂相中期：核膜完全消失，两极有中心体，中心体周围的星射线明显可见，染色体排列在赤道板上，且每条染色体分为两条染色单体。染色体数目为6条，光镜下清晰可数。（一）动物细胞有丝分裂标本观察高倍镜下示中期分裂相马蛔虫受精卵子宫切片中有丝分裂各期形态特征中期(侧面观)中心粒中期(侧面观)后期：染色体着丝粒纵裂，在纺锤丝的牵引下向细胞两极移动，两组染色体间仍可见纺锤丝。星射线也可观察到。（一）动物细胞有丝分裂标本观察高倍镜下示后期分裂相马蛔虫受精卵子宫切片中有丝分裂各期形态特征末期：两组染色体到达两极并逐渐解旋为染色质.核膜、核仁重新出现。纺锤体和星射线消失。细胞中央
56、处膜向内凹陷，逐渐加深，最后缢缩成两个子细胞。（一）动物细胞有丝分裂标本观察高倍镜下示后期分裂相马蛔虫受精卵子宫切片中有丝分裂各期形态特征(二）植物细胞有丝分裂的标本观察取洋葱根尖压片或洋葱根尖切片标本于低倍镜下观察，找到根尖分生区，再转换高倍镜观察分裂各期的特征及变化规律洋葱根尖各部结构图及其有丝分裂过程模式图(二）植物细胞有丝分裂的标本观察前期：早前期核膨大，核内充满染色质，染色质呈细丝状盘曲成网状。随着分裂的进行，染色质逐渐缩短变粗，到晚前期染色质凝集成染色体，核仁解体核膜消失，纺锥体形成。植物细胞有丝分裂各期形态模式图前期中期后期末期植物细胞有丝分裂各期形态特征(二）植
57、物细胞有丝分裂的标本观察中期：染色体形态、数目清楚（2n=16），染色体最大限度凝集,排列在细胞的中央赤道板上，有丝分裂器完全形成。后期：每条染色体的着丝粒纵裂，使两条染色单体分开并在纺锥丝的牵引下向细胞的两极移动末期：染色体到达细胞两极并开始解旋去凝集，逐渐伸长变细，恢复为染色质的状态。核仁、核膜重新出现，形成两个新的细胞核，在细胞板处分裂成两个子细胞。植物细胞有丝分裂各期形态特征（三）植物细胞有丝分裂标本制备及观察1.实验原理有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显
58、，而且是有规律地进行。洋葱体细胞中有8对共16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。（三）植物细胞有丝分裂标本制备及观察1.实验方法（1）取材：将去掉老根的洋葱鳞茎放在盛满清水的小烧杯里，于25培养箱或25室温培养34天.（2）预处理：剪下约0.5cm长的根尖，将切下的根尖放入0.1%的秋水仙素溶液中，室温24h。洋葱鳞茎（三）植物细胞有丝分裂标本制备及观察（3
59、）固定、水解、漂洗、染色：放入Carnoy固定液中固定1030min；再将根尖用清水冲洗后放入盛有少量1mol/L盐酸的培养皿中，置60恒温水浴箱解离10min左右，然后在蒸馏水中漂洗变软的根尖约30min，镊子夹取至洁净的载玻片上，吸去多余的水分；滴加0.5%甲苯胺蓝或改良碱性品红染液12滴，盖上盖玻片，用镊子柄平放轻压有根尖的部位，见根尖压扁铺开后置显微镜下观察。（三）植物细胞有丝分裂标本制备及观察3.结果分析(1)在低倍镜下找到分生区细胞。分生区细胞特点是：细胞呈正方形，排列紧密，有的细胞正处于分裂期。(2)在高倍镜下可见处于细胞分裂各期的分裂相：如右图为甲苯胺蓝染