基于医学决策的mNGS病原微生物检测申请，一般用于传统检验方法未能给出明确病原学结果从而影响患者准确诊疗的感染性疾病、新发突发传染病、验证常规检验结果或排除其他发热疾病。推荐临床通过拟诊先行传统微生物检验及聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）检测拟诊疑似常见病原微生物，不盲目使用mNGS技术。在必要或紧急情况下，如危急重症、疑难感染、群体性感染事件等，可考虑作为一线检测方法。表1列出了mNGS临床应用适应性说明。
临床上在选择mNGS进行病原微生物确认时应注意如下事项。
2.靶向基因测序：基于高通量测序技术的病原微生物检测，除无偏倚的mNGS外，还包括原核生物的16SrRNA基因、真菌（5SrRNA基因两端的ITS1、ITS2及25-28SrRNA基因中的D1及D2区等）以及特定病原微生物靶基因等［17］。如怀疑沙眼衣原体可选momp（主要外膜蛋白基因），怀疑结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）可选rpoB等靶向基因测序［18,19,20,21］。临床医生通过测序实验室提供的项目清单选择适宜的项目，切忌大撒网式排查。
3.DNA测序与RNA测序的选择：mNGS技术理论上可检测以核酸为遗传物质的所有病原微生物。若临床上已排除病毒感染，可直接进行DNA测序。考虑到DNA测序受人源基因组影响较大，为避免因死亡微生物DNA残留影响现症感染判断，可进行RNA测序［14，22,23］。当怀疑病毒感染，尤其对呼吸道、脑脊液（cerebrospinalfluid，CSF）及血液标本，或临床表现复杂，无特定怀疑方向时，需要同时对样本中的DNA和RNA进行测序。mNGS技术本身是一种核酸检测技术，由于不同微生物类别本身结构差别，其核酸释放效率差异明显，尤其是真菌、分枝杆菌等核酸提取需要特定的破壁处理，对于疑似真菌或分枝杆菌感染时也应特别提出，在检测过程中增加必要的样本处理过程。
（二）标本类型及采集规范
理论上，凡存在于临床标本中的病原微生物均可通过mNGS检出，但该技术的准确性依赖标本中微生物的核酸质量及含量，也依赖于不同类别微生物核酸的提取效率。
1.血液及高凝标本：持针器肘静脉采集3~5ml［实验室提供专用采血管，即游离DNA样本保存管，内含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝剂和保护剂，可抑制血浆中核酸酶及有核细胞中DNA的释放］。采血时皮肤需彻底消毒，采血至刻度，上下颠倒混匀5~10次，条码标记或编号。切忌在输液处或导管处采集血标本。此外，高凝状态的关节液、胸腹腔积液，甚至CSF也可采用此方法。如果增加RNA测序应同时采2管。
2.支气管肺泡灌洗液及痰液：严格按操作规程采集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF），弃去前段可能污染的部分，回收10ml置无菌螺帽管（塑料或玻璃质地均可）中，内含支气管末梢和肺泡中的分泌物。咳痰标本需在医护人员协助下，患者用生理盐水漱口2~3次，弯腰90°，用力咳出深部痰3~5ml置无菌螺帽管中。若无法自行咳痰，可通过吸痰器从气道采集。咽拭子只适用于呼吸道病毒检测。检查容器有无渗漏，紧盖后封口膜密封，条码标记或编号。
3.CSF、房水及其他体液：经专科医生标准化采集方法获得，无菌螺帽管封口膜密封。CSF（留取第2管或第2管后标本）、关节腔积液、胆汁等检测病原微生物DNA或RNA需采集1ml，如同时进行DNA及RNA测序应采集2ml。房水至少采集200μl。骨髓单独进行DNA或RNA测序，0.5ml标本即可，如果同时进行DNA及RNA测序则至少采集1ml。这些临床标本采集困难，切记防污染，避免经引流管采集。胸腹腔积液需富集后提核酸，至少采集10ml［24］。
4.脓肿及深部组织：（1）开放性脓肿需清创后采集深部伤口或溃疡基底部分泌物拭子置无菌管中。（2）封闭的脓肿需对病灶局部的皮肤或黏膜表面彻底消毒，注射器抽取脓液，若少于3ml，应采集最大标本量送检。（3）深部组织感染需手术取材，置于无菌螺帽瓶中。多数情况下组织中病原微生物含量低于脓液，尽可能取脓肿边缘组织。
5.粪便标本：至少黄豆粒大小的新鲜标本，稀便3~5ml，置螺帽容器中。
（三）报告解读原则
目前病原微生物的确认依然遵循Koch法则，即：（1）该微生物存在于同类疾病患者中，健康个体则无此微生物。（2）该微生物必须能够被分离、培养、纯化。（3）该微生物接种于易感动物可引起相同疾病，并可从被接种的动物体内分离到此微生物。（4）该微生物可引起每一个个体发病［25］。但是，作为一种临床检验方法，利用mNGS确认的感染病例并不能够完全满足传统Koch法则，作为该法则的补充，mNGS具有如下特征。
1.mNGS结果分析：理论上，凡存在于标本中的微生物均可检出，但因不同类型微生物基因组长度和测序平台等差异，导致无法针对所有微生物建立统一的阴阳性判读标准［7，26,27,28］。实验室应根据预期用途、标本类型、检测目标和技术特点，建立并验证阳性阈值及判读标准。原则上mNGS的临床意义同核酸检测。另外，决定一个序列是否来自于某种微生物，很大程度上取决于用于比较的参考微生物序列数据库，如果数据库中未包括该物种以及与其进化距离较近物种的基因组序列可能造成结果不准确。
2.mNGS结果确认：如果检出的微生物符合疾病特征则可能是引起感染的病原微生物，但不能只从序列数多少确认，需考虑序列在基因组上的覆盖度、特异性及保守性［11，14］。该病原微生物可通过PCR等方法得到验证，如呼吸道标本中的流感病毒、腺病毒及新冠病毒等；粪便标本中的志贺菌、沙门菌及诺如病毒等；CSF中的肠病毒、单纯疱疹病毒及西尼罗河病毒等；血液中的布鲁菌、巴尔通体及人类免疫缺陷病毒等。如果检出高序列数的某种未命名微生物，应高度警惕新物种的出现。
4.微生物种群致病：无菌部位脓肿标本可见多种病原微生物共检出现象。如脑脓肿、颈间隙脓肿、咽旁脓肿、口腔脓肿等，所检出的微生物序列数均可能达到阳性阈值，多数为严格厌氧菌与兼性厌氧菌共生。这种因微生物种群而致病的现象称为一个种群或一个微生物生态系统引起一种疾病，而非Koch法则的一种病原菌引起一种疾病。尽管种群致病的理论还需进行深入探讨，但随着深度测序技术的广泛应用，这种现象在临床上将得到更多验证［29］。
5.不可培养或难培养微生物的结果验证：mNGS针对标本中所有病原微生物核酸序列，不可培养或难培养微生物不能通过传统培养方法再现，且这类病原微生物同样缺乏血清学或抗原检测。除病毒、螺旋体、立克次体、寄生虫外，这些微生物可通过核酸检测验证，测序同样是诊断的金标准。
8.提高测序深度：mNGS常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性［8，30］，因其得到的微生物序列数不足样本总序列的5%，特异性序列覆盖度不到微生物基因组1%，在这种情况下进行耐药基因、毒力岛基因、转录组及代谢通路分析几乎不可能。目前，有以下几种做法可提高测序深度：（1）在常规测序深度下已明确了病原微生物，再提高测序数据量至可覆盖该物种基因组80%，但花费巨大不适合普及。（2）在宏基因组基础上叠加固定的若干种耐药基因进行靶向测序。（3）研发降低人源核酸比例的创新方法，获得更多微生物测序数据量［4，7，31］。
建议3如果检出的病原微生物符合临床预期，应确认序列结果的准确性和特异性。为提高结果的特异性，降低错误率，即使病原微生物也应建立阳性阈值。阳性阈值建立在微生物特异序列数及其在基因组覆盖度上。临床医生在解读条件致病菌时，应排除污染和背景微生物，考虑患者免疫状态及与临床表现的符合性。mNGS结果不能作为临床决策的唯一依据，结果阴性也需结合临床排除感染。
二、mNGS检测病原微生物的实验室要求
（一）实验室分区及人员要求
1.基本原则：即各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作，以达到工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时［16］。mNGS检测分“干、湿实验”，“湿实验”指从样本处理到测序数据产生的整个测序过程，需要在标准的测序分区实验室完成。一般“测试分区实验室”分试剂准备区、标本处理与核酸提取区、文库构建区及测序区。“干实验”指测序数据的生物信息学分析。
2.单向工作流程：若实验室设有缓冲间，缓冲间统一为正压或负压。若未设缓冲间，从试剂准备区到测序区压力依次递减。为避免相互干扰，DNA和RNA操作（核酸提取）应分开。如在同一实验室应分两个区域，主要仪器耗材包括生物安全柜、核酸提取仪、移液枪、离心机、试剂及耗材等不可混用。如使用琼脂糖凝胶电泳检查核酸及文库质量，则需有单独的电泳区。靶向测序PCR应在单独的扩增区进行［33］。
3.污染防控：应定期进行环境评估，为了监控污染需制定试剂、仪器和实验室物表定期消毒的标准作业程序（standardoperationprocedure，SOP）。还应对无模板参考品或阳性对照中可能出现的污染物进行连续跟踪，并使用保守的阈值标准（见第一章第三部分报告解读原则3），最大程度减少假阳性结果产生［9］。
（二）检测平台
1.建立标本前处理及核酸提取方法：标本预处理方法和核酸提取技术在使用前需经过验证。
2.测序平台的选择：包括仪器设备的选择、测序平台质量的评价及主流测序平台类型3个方面。
配备开展高通量测序检测项目所需的所有仪器设备：优先选择国家药品监督管理局（NationalMedicalProductsAdministration，NMPA）批准的测序平台和配套试剂。
测序平台应达到临床预期：除开展满足临床需求的项目外，测序通量、序列的准确率、支持读长、仪器性能验证、内部质控、测序周期及批量检测能力等也是评价测序平台质量的重要指标。
主流测序平台：目前，mNGS主流测序方法有边合成边测序、DNA纳米球测序及半导体测序［3，32］。实验室根据需要选择适宜的检测平台，使用模拟样本或临床已知微生物样本验证测序全流程。表2列出了不同类型测序平台的技术特点及环境要求。
3.自动化测序平台：mNGS微生物检测的灵敏度与标本背景有关，如组织标本中含有大量人源基因组，导致微生物序列数占比减少，通过高效自动化测序平台，增加测序深度可提高检测灵敏度。自动化过程降低人工操作、减低外源污染，实验室分区简化。已有文献报道实现了血液、CSF、尿液等标本，从文库构建到报告发放全自动化过程［26］。自动化平台应包括标本前处理、核酸提取、文库构建、高通量测序、生物信息分析和报告发送。
（三）生物信息平台
生物信息学分析（也称“干实验”）是mNGS检测中的重要部分，是对测序产生的原始数据进行处理和分析，包括但不限于数据质控、人源序列比对过滤、微生物物种检测等过程［35,36,37］。目前尚无统一的标准化数据分析程序及软件［3］。数据分析流程由多种分析软件配套完成，包括数据质控软件（如Fastp、Trimmomatic、FastQC等）、比对软件（如Bowtie2、BWA、MAQ、SOAP2、Blast等）、物种分析软件（如SURPI、Taxonomer、MegaBLAST等）［26，38,39］。人源基因组和微生物基因组检测数据库有美国国家生物技术信息中心、美国病原体系统资源整合中心［40］、真核生物病原体数据库［41］及病毒病原数据分析资源库［42］等，在构建物种比对数据库时可予以选择，还有耐药基因分析可考虑抗性基因数据库［43,44,45］，毒力基因分析可使用毒力基因分析数据库［46,47］等。随着mNGS产品的体外诊断化发展，结合人工智能技术的自动化的数据分析系统已经能够提供给临床实验室。
建议5实验室构建mNGS技术平台以拟开展的检测项目及科研工作为依据，充分论证不同检测平台的适用性，包括生物信息平台。技术平台的建设应包含标本处理、核酸提取、文库构建（DNA和RNA文库）、高通量测序、核酸扩增、产物分析、数据分析等全流程。采用模拟样本或临床已知病原体样本对所有技术环节进行验证，包括检测灵敏性、测序通量、序列质量、读取准确率、支持读长、仪器性能验证、内部质控、测序周期及生物学信息分析能力。比对数据库应满足各类微生物检测需求。
三、mNGS微生物检测方法的建立
（一）标本前处理
标本液化、浓缩及去除宿主核酸等前处理方法和设备使用应标准化。所有标本应具有唯一标识，防止在信息录入和标本分拣过程中交叉污染。根据申请要求提前准备被检测微生物所需的文库资料及生物信息分析软件。建立临床标本的前处理程序，包括复杂标本、微量标本和组织标本的前处理程序，针对真菌和/或分枝杆菌等特殊微生物的破壁处理程序。建立RNA病毒、微生物游离核酸测序的前处理方法。建立组织标本研磨方法，具体方法见表3。
（二）核酸提取
1.使用经性能确认的核酸提取试剂：临床标本中存在不同类型的病原微生物，核酸提取方法的可重复性和提取效率对保证核酸的完整性及纯度至关重要。实验室应根据临床标本类型和微生物种类建立针对性的标准化提取程序。建议使用经性能验证的商品化提取试剂及设备。
2.核酸质量验证：（1）高质量的DNAA260/A280应在1.7~1.9，A260/A230应>2，可用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA质量（无杂带、无拖尾、背景无蛋白污染）。（2）DNA完整性（如Agilent2100Bioanalyzer）检测，如果大部分片段在200nt（血浆游离DNA除外，140nt）以下说明DNA降解严重，需重提。（3）高质量的RNAA260/A280应在1.8~2.0，A260/A230应>2。（4）微量的核酸采用Qubit荧光染料法进行定量测定［15］。
3.核酸含量极低样本的处理：如CSF、房水等，应在标本中加50μlATL（DX）研磨珠，低频震荡10min，离心后取150μl。加入150μl裂解液和8μl蛋白酶K，涡旋震荡混匀30s，56℃恒温震荡15min（若无恒温震荡仪，可用金属浴代替，期间每3min混匀1次）；取裂解后的样本300μl，加入磁珠240μl，震荡混匀，室温静置5min，上清提核酸。按照商品化的操作说明进行。
4.去除人源DNA的方法：多数临床标本存在大量宿主细胞和宿主游离核酸，微生物核酸丰度相对较低。因此，在核酸提取环节中可考虑建立高效去宿主DNA方法，提高mNGS微生物检测的灵敏度［4，48］，去除人源核酸的方法选择需要结合临床检测目的，举例如下。
去污剂处理：因人源细胞的细胞膜较微生物外壁脆弱，在核酸提取前用温和去污剂（如皂苷）裂解宿主细胞释放DNA，再用脱氧核糖核酸酶Ⅰ降解人源DNA，通常可使微生物富集效率提高1000倍［49］。
低渗溶液破坏宿主细胞：使用细胞膜不透性的叠氮碘化丙锭结合暴露在溶液中的宿主DNA［48］。
抗甲基化DNA磁珠：因人源DNA甲基化程度高，大多数微生物基因组中缺乏甲基化DNA，使用抗甲基化DNA磁珠可有效去除人源DNA，可实现3~5倍富集［26］。
使用CRISPR-Cas9（基因编辑技术）剥离目标序列：此法对构建RNA文库较为有利，可提高非编码rRNA序列含量，但对DNA文库构建意义不大，不推荐花费更大财力去除全部人源DNA。
5.qPCR预估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA后，对宿主及微生物常用的标志基因，如β肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因和16SrRNA基因等，进行实时荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR，qPCR）定量检测，通过经验积累大概预估宿主残余比例及有效数据比例，必要时可提高测序数据量。
（三）文库制备
文库制备是将基因组DNA片段化并在片段末端连接寡核苷酸接头的过程，文库质量直接影响测序数据质量。目前常用的建库方法有超声波打断建库、酶切建库及转座酶建库等，选用操作简单的方法对降低污染有利。
1.明确核酸质量及文库产出标准：实验室根据文库制备方法及测序平台明确起始核酸质量标准（纯度、浓度）及文库产出标准（文库浓度、片段大小等）。
2.建议使用配套试剂：若起始DNA在10ng以上，可采用普通建库试剂盒；若DNA在100pg~10ng之间，则采用超微量DNA建库试剂盒；若DNA量低于下限，应先行全基因组扩增，再进行建库。
3.构建RNA文库：逆转录前需在冰上操作，防止RNA降解。应添加RNA酶抑制剂，必要时在建库前采用杂交捕获法或核糖体分离法去除rRNA［15］。
4.文库质量：可采用Qubit荧光染料法检测文库浓度，qPCR检测文库中有效连接接头的核酸浓度。上机前需根据不同的测序平台对文库浓度的要求进行。高质量的文库DNA，其A260/A280通常在1.75~2.00。此外，还应采用生物分析设备检测文库片段大小及峰型，文库片段大小为插入片段和接头序列的总长度，合格文库插入片段长度大于100bp，文库应主峰明显、无杂峰、无接头、无引物二聚体［15］。
建议6实验室应具备针对不同类型临床标本的前处理方法，尤其针对复杂和极微量标本应具备经验证的灵敏的手段。无论DNA还是RNA核酸提取质量应满足测序要求。在核酸提取的过程中应引入经验证的降低人源核酸处理方法。推荐使用配套试剂构建文库，根据初始核酸浓度选择文库建库试剂盒，若DNA量低于下限应先行全基因组扩增再进行建库，文库核酸浓度、纯度及长度应达到测序（包括靶向测序和宏基因组测序）要求。文库制备方法需用已知临床标本或模拟样品或质控品进行验证或开展实验室间比对，合格后方可用于临床。
（四）上机测序
mNGS微生物检测的灵敏度与标本人源核酸含量有关，不同类型临床样本人源核酸平均含量不一样，为保证结果可靠性，在相同样本处理和核酸提取方法时，通常不同类型临床标本推荐不同测序数据量，原则上背景简单的标本如CSF、血浆等（人源核酸含量低）较低的测序数据量即可满足病原微生物检出。在条件允许的情况下可增加测序数据量以提高检测灵敏度。可通过数据抽样，即从下机数据中（如20M）随机抽取15M组成一个模拟的15M测序数据集模拟分析不同测序数据量、不同物种的检测限，从而最终确定不同标本类型的最佳测序数据量。通常靶向测序的数据量应≥3万条序列，宏基因组测序鸟枪法测序数据量应≥2000万（20million，20M）高质量序列，准确度Q30比例≥85%。也有文献推荐CSF600万条（6M）序列［26，35］、血液游离DNA2400万条序列（24M）［50］、咽拭子病毒检测1000万条（10M）序列［51］等。测序数据量提升可显著提高灵敏度，以血流感染为例，每个标本平均20M序列时，总体灵敏度为31%［52］，每个标本平均24M序列时，总体灵敏度达到48%［50］，当每个标本平均数据量达到33M序列时，总体灵敏度达到71%［53］。
（五）生物信息学分析
1.序列质量：碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，用于评估下机序列数的准确度。质量值（Q）越高代表碱基被测错的概率（P）越低，两者关系为Q=-10lgP。Q20对应的测序错误概率为1%、准确率99%。Q30对应的测序错误概率为1‰、准确率99.9%。常用Q20和Q30分别代表质量值≥20或30的碱基所占百分比。实验室应要求保证Q30至少达到85%［54］。在对测序数据进行分析之前，应首先进行质量控制，去除读长过短（如<50bp）和低质量的序列，获得的高质量序列再与人源基因组比对去除，剩余序列进入后续的微生物检测分析［11，14,15］。
其他判读方法：有文献通过自建参考品先设定判读标准，再采用临床标本进行判读标准的确认。也有文献通过检测一定数量的已知阴阳性样本，采用统计学方法，如受试者工作特征曲线或准确率-召回率（precision-recall，PR）曲线来确定合理的判读标准［27］。
3.阳性阈值：判读为阳性的界值即为阳性阈值。阈值的设置与检出序列数、检出序列的特异性、特异序列的基因覆盖度、该物种同源性复杂程度以及检测灵敏度有关。即使病原微生物也应制定阳性阈值。针对某些特殊传染病病原微生物，在排除污染的前提下，即使检出1条序列也应视为阳性，如MTB、鼠疫耶尔森菌及流行性出血热病毒等［7，29，55］。
5.具备数据库更新能力：实验室应持续跟踪使用版本的数据库。应使用标准化数据集对更新后的数据库进行验证，确保数据的准确性和可重复性。
6.建立背景微生物数据库：mNGS可能含有多种微生物信息，其中不乏正常菌群、污染微生物及背景微生物［57］。应建立人体不同部位正常种群数据库，并纳入报告分析解读流程。虽然有些微生物存在于标本中，但与疾病无关，应在报告中去除或说明。此外，mNGS流程中所用的各种试剂中也可能存在微生物个体或核酸，应建立试剂背景微生物序列数据库，在报告中予以去除。
7.建立错误数据修正机制：mNGS同样存在测序错误的情况，因此需去除原始下机数据中的低质量序列，包括测序接头污染的序列、质量值低的序列及短重复序列等。由于mNGS为批量标本平行上机测序，难以完全避免标签跳跃，应通过技术手段与分析流程防止高拷贝微生物序列污染平行上机样本。
建议7实验室需通过已知标本确立不同类型标本个性化的测序数据量、验证序列质量值、确定判读标准及不同类型微生物阳性阈值。在进行序列比对时掌握如下原则：序列比对一致性相同优先考虑人源序列，该序列与数据库中微生物种属匹配度高、属水平序列数大于种水平、种序列数越接近属水平则确认该种的可能性越大、结果的可靠性与基因组覆盖度成正比、低于阳性阈值的病原微生物不可轻易放过，需结合临床或复检或重留标本再测。
建议8实验室应使用国际公认或经验证或文献推荐的公共数据库，包括人源数据库与微生物数据库。实验室可在临床用库的基础上建立二级科研数据库，以便应对罕见或新发微生物。建立生物信息学分析程序并进行性能确认，确定测序数据量与不同类型微生物的判读标准。生物信息学分析程序满足预期检测性能参数，结果应符合预期要求。实验室应建立监测生物信息学分析程序，记录分析流程中各组分改变或版本更新（如软件升级、数据库更新、脚本更改等），定义流程及数据库的版本号，以保证报告的可溯源性。
（六）检验报告
2.报告单的使用：从技术角度讲，mNGS阳性或阴性结果不能作为临床诊疗决策的唯一依据，即使无菌部位标本的mNGS结果也需结合临床表现或其他检查结果进行综合判断。mNGS检出或未检出某物种的核酸片段，提示患者标本中含有或不含有该物种核酸，但不能明确该物种与感染的关系，即mNGS阳性不一定是病原微生物。另一方面，受取样及病程变化、测序策略本身的灵敏度局限、实验室检测能力和生物信息学分析水平的影响，mNGS检测阴性结果也需结合临床进行判定。从法律角度讲，无认证实验室的检测结果不能成为诊断依据，仅做研究所用。因此，目前国内任何实验室出具的mNGS微生物检测报告均不可直接用于临床诊断，也不应成为医疗文书［59］。
建议9用于临床辅助诊断的mNGS报告应包括测序总序列数、检测病原微生物列表、检出病原特异序列数量、检测病原范围、覆盖度、测序深度、检测方法及检测技术说明。mNGS结果的本质与PCR相似，代表临床标本中检出或未检出某微生物的核酸片段，不能明确该物种与感染的关系，即使阴性结果也需结合临床表现及其他检查结果进行综合判断。
四、性能确认
优先选择NMPA批准的仪器与试剂，如果改变获批试剂制定的预期用途、试剂组分、操作流程等，则按照LDT试剂要求进行管理，在开展临床服务之前所有与mNGS有关的仪器、试剂、检测流程、数据库及分析软件均需进行性能确认［16］。
（一）测序平台的性能确认
（二）生物信息分析平台的性能确认
实验室可以选择商业化的自动分析系统，也可需根据检测项目和预期用途选择合适的算法和软件，搭建本实验室的生物信息学分析流程，并进行必要的性能确认，以保证对病原微生物检测的准确性。性能确认包括但不限于最低测序数据量及碱基识别质量值等，实验室应根据国际上本领域发展不断优化分析平台。临床标本的测序数据是进行性能确认时最重要的数据，即临床标本mNGS全流程检测后得到的测序数据。计算机模拟的测序数据可通过数据模拟软件ART等软件生成［59,60］。但是计算机模拟和参考物质的测序数据只能作为补充数据，不能完全替代临床标本测序数据。
（三）分析性能确认
分析性能确认包括从临床样本前处理到生物信息学分析的全过程，观察指标至少应包含精密度、准确度、可报告范围、分析敏感性、分析特异性等。
1.精密度：指在规定条件下所获得的多次独立检测结果的一致度，评价检测方法的重复性。包括对同一批样本在同一条件下（相同的环境、操作人员及仪器）至少进行3次以上检测，评价重复精密度，以及不同日间、不同人员、不同仪器（相同型号）至少进行3次以上检测，评价再现性精密度。可选择高、低2个不同梯度的参考品进行验证，精密度应>90%［13］。
2.准确度：是指与真阳样本、真阴样本结果或金标准方法检测结果的符合率。对准确度的评价可通过两部分进行。
通过临床样本验证：选另一NMPA已获批或被普遍接受的金标准方法与mNGS同时检测临床样本，比较mNGS与金标准方法之间的差异，不一致的结果再用第3种方法进一步确认，通过阳性符合率和阴性符合率评价定性测定的准确度［16，35，61,62］。
通过参考品验证：mNGS目前尚无国际或国家参考品，实验室可自制企业参考品进行验证。如在明确阴性或健康人标本中掺入不同类型病原体的标准参考品（如病毒、细菌、真菌、寄生虫等）制备模拟阳性样本，建议使用8~10种病原微生物（包括RNA病毒）验证检测的准确度。样本数量不少于20例，浓度范围应覆盖高、中、低，一致率应大于90%［26，62］。
3.最低检测限（limitofdetection，LoD）：用于描述测序方法的分析敏感性，它是指能够通过测序获得准确目标微生物的最低浓度，一般要求可信度≥95%。可根据预期用途、标本类型等，选择含有代表物种的混合参考品，10倍梯度稀释进行检测，每个梯度至少3个重复，计算出LoD值，并在该LoD浓度进行20次以上重复，确保95%的检出。实验室需要建立不同样本类型、不同代表物种的LoD［63］。
4.分析特异性：分析特异性主要评价样本中潜在干扰物质对检测结果的影响。mNGS最大的干扰物是人源核酸，高浓度的宿主背景可严重降低检测灵敏度。痰标本需增加黏蛋白对结果干扰程度的评估。血液标本需增加血红蛋白干扰程度评估。应使用接近临床真值的干扰物浓度进行验证，建议包含每种干扰物质的潜在最大浓度。可将不同含量的干扰物质分别添加到阳性样本中，以评估干扰物质对检测结果的干扰程度。mNGS分析特异性还需考虑近源物种的交叉反应，即鉴别不同亚种、亚型的能力［4，26，50］。
（四）性能确认的样本要求
1.代表性：涵盖不同类型微生物的各类感染标本是理想的性能验证样本。未经性能验证的标本类型应被视为无法准确得到结果的样本。如果缺少具有代表性的病原微生物，可使用模拟样本代替。不同类型微生物应特别强调结核分枝杆菌、丝状真菌、RNA病毒及寄生虫。不同类型的临床标本特别强调血液、CSF、BALF、组织标本和关节液及胸腔积液。
（五）临床性能确认
临床性能确认包括临床敏感性和特异性。实验室需结合临床信息对检测结果进行临床性能确认，如常规检查、影像学检查、临床表现及临床医生的判断等。如果疾病种类、标本类型及病原微生物的覆盖度无法达到临床性能确认的统计学标准，实验室可从无症状对照组获得临床特异性的指标。此外，也可根据文献建立临床性能确认指标［7，26，35］。
建议10使用NMPA批准的mNGS试剂应进行分析性能验证，LDT试剂应根据预期用途进行方法设计和优化，并对检测全流程进行整体的性能确认。分析性能确认应包含不同类型样本及重要病原微生物，如果没有足够的临床样本可用模拟样本代替。分析性能确认包括但不限于精密度、准确度、检测限、分析特异性和可报告范围等。在确认分析性能后建立“湿实验”和“干实验”的SOP，明确性能参数及检测局限性。若实验室流程改变需进行全面或部分性能再确认。
五、质量保证
（一）质量要素
质量要素包括核酸提取的浓度和纯度、文库构建所需的核酸量、文库片段分布、文库浓度、最低测序数据量、符合要求质量值的碱基百分比（如Q30）以及检测的局限性、检测全过程SOP（采样要求、样本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序、生物信息学分析等）及其他参数（内标、质控品、分析参数、质量标准、数据库等）。若试剂、软件及其版本、参数和数据库发生改变，实验室应根据影响程度进行全流程或部分环节的再确认［26，64,65,66］。
（二）分析前
实验室应针对不同样本类型（如肺泡灌洗液、痰液、血液、CSF、脓肿、组织等）、采集方法、采集容器、采样量、运送及保存条件等制定SOP文件并进行确认，保证标本质量，避免交叉污染。应制定临床标本接收和拒收标准，对不满足接收标准又无法重新取样的标本，实验室与临床沟通后实施让步检测（虽然标本不合格，但难以再次获得，征得临床同意后进行的检测）［67,68,69,70］。
（三）分析中
实验室应根据性能确认或性能验证结果，针对不同类型样本建立分析中检测的标准操作程序。
1.记录：核酸提取浓度、文库上样量、文库片段大小分布范围、测序数据量、测序质量值及序列数量是分析中记录的重点。当上述指标未达到检测标准时，实验室应建立异常情况处理程序，如让步检测、确认检测或检测报告待发等。鼓励实验室记录信息化，减少人为错误。
2.室内质量控制程序：可采用模拟样本作为阴性及弱阳性对照的质控品（包括DNA质控品和RNA质控品）。模拟样本的生物学特征和基质应尽可能与临床样本一致。自制质控品应有制备流程及验证记录［16，26，36，71,72］。
阴性对照为不含任何微生物核酸的样本，可使用多种材料制备，如核酸提取试剂或其他试剂的洗脱缓冲液、商品化的人体模拟样本或经确认的临床阴性样本。阴性对照可对外部污染（如采集管、实验室环境、消耗品等）、试剂和交叉污染进行一定程度上的控制。
弱阳性对照可通过在阴性对照中掺入适量浓度具有代表性的微生物核酸（一般指细菌DNA、真菌DNA、病毒RNA）进行制备。如果弱阳性对照未检测到目标微生物，则可能表明在标本前处理、核酸提取、文库制备、测序及生物信息分析过程中出现错误，需重新检测。
若质控品出现失控，应分析失控原因，并采取相应的纠正措施和预防措施。若在检测过程中发现试剂污染或某一检测步骤存在问题，则应重复检测。
3.不合格率统计：实验室定期统计核酸提取、文库构建、下机数据质控、测序数据量等的不合格率，以及污染率及病原微生物阳性率等，动态监测检测量和室内质控数据。mNGS受环境菌、试剂工程菌、实验室背景微生物影响，应定期对实验室环境、试剂等进行监测，确定对mNGS干扰的背景微生物种类。
4.参加室间质评或能力验证：目前我国尚未开展mNGS微生物检测的室间质评。本共识鼓励进行实验室间比对，如果发现结果不符合应查找原因。
（四）分析后
2.结果的可溯源性：参照指南、共识或文献建立报告解读的SOP。结果解释应准确及时，并描述该微生物的临床意义。意义不明、无法排除背景干扰的微生物可在报告附录中显示。可疑新发病原微生物需用其他方法验证，并转送国家CDC或有资质实验室确认［14，16，28］。
3.报告内容：（1）基本信息同申请单。（2）正式报告除明确微生物特异序列数外，还应包括测序数据总量。（3）结果解释中有微生物基本信息及可能的临床意义。（4）未命名微生物需给出同源性比对结果。（5）注明检测范围、方法的局限性及实验室信息［11，28］。
建议11实验室应建立全面的质量控制体系，针对“人、机、料、法、环”及分析前、中、后所有环节制定相应的程序文件、SOP、记录表格、室内质控要求及报告的质量控制。对让步检测建立异常情况处理程序，在报告中提示风险因素。mNGS结果报告应对检测局限性等进行说明。具有明确临床意义的病原微生物应在报告正文中提示，意义不明或无法排除背景干扰的微生物应在附录中提示。针对特殊病原微生物应提示临床进行多方法验证。
mNGS技术是针对未知、疑难病原微生物检测的新型核酸检测手段，无论针对新发突发传染病还是临床棘手的疑难感染性疾病都有出色表现。它以无选择性、结果快速、适用各类临床标本而较其他检测技术有不可比拟的优势，成为传统方法难以为继时认可度最高的检测手段。但是任何技术都不可能解决所有问题，mNGS技术仍然没有摆脱核酸检测的局限性，每一结果的解释都需结合临床。同时，基于该技术开展的不同临床检测策略本身还有比技术更多的局限性，不同测序策略也有不同的适用范围，因此，对mNGS技术应用于临床微生物检测保持科学严谨、合理、规范使用的态度，使其发挥最大作用是检验同道的期望。希望本共识对提高疑难感染性疾病的诊疗水平、完善微生物检验技术、指导mNGS实验室建设发挥作用。
执笔人：
鲁辛辛（首都医科大学附属北京同仁医院检验科）；王玫（首都医科大学附属北京同仁医院检验科）；赵建玉（首都医科大学临床检验诊断学2018级）；樊高威（首都医科大学附属北京朝阳医院检验科）；杨瑞馥（军事医学研究院微生物流行病研究所）；任丽丽（中国医学科学院病原生物学研究所）；胡继红（北京医院国家老年医学中心卫生部临床检验中心）；鲁炳怀（中日友好医院临床微生物室与感染实验室）；赵晓涛（北京大学人民医院检验科）；吴丽媛（广州市妇女儿童医疗中心检验科）；隋文君（首都医科大学附属北京同仁医院检验科）；周倩倩（首都医科大学临床检验诊断学2018级）
撰写专家组成员（按姓氏汉语拼音排序）：
陈唯军（中国科学院大学华大教育中心）；金荣华（首都医科大学附属北京佑安医院肝病科）；李振军（中国疾病预防控制中心传染病预防控制所）；胡继红（北京医院国家老年医学中心卫生部临床检验中心）；鲁炳怀（中日友好医院临床微生物室与感染实验室）；鲁辛辛（首都医科大学附属北京同仁医院检验科）；任丽丽（中国医学科学院病原生物学研究所）；苏建荣（首都医科大学附属友谊医院检验科）；王成彬（中国人民解放军总医院第一医学中心临床检验科）；王辉（北京大学人民医院检验科）；王晶（中国科学院大学心理所）；王景林（军事医学研究院微生物流行病研究所）；王佳伟（首都医科大学附属北京同仁医院神经内科）；肖迪（中国疾病预防控制中心传染病预防控制所）；徐英春（中国医学科学院北京协和医院检验科）；杨启文（中国医学科学院北京协和医院检验科）；杨瑞馥（军事医学研究院微生物流行病研究所）；于艳华（首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心）；赵雁林（中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心）
志谢麻锦敏（深圳华大因源医药科技有限公司）、刁智娟（欧蒙未一医学检验实验室）、张柳燕［欧蒙医学诊断（中国）有限公司］、马丽娟［欧蒙医学诊断（中国）有限公司］、李沛志［因美纳（中国）科学器材有限公司］、梁蕊［因美纳（中国）科学器材有限公司］和李永军（广州微远基因科技有限公司）对本共识中所涉及的技术路线及方法给予验证，并提出修改建议