核酸提取方法的深度解读提取操作关键点解读

1）核酸溶解：纯化后的核酸，其中RNA以水溶解为主，DNA则多以弱碱性的Tris或者TE溶解。经典的DNA溶解方法多提倡使用TE溶解，其中原因是有人认为EDTA可以减少DNA被可能残留下来的DNase降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用Tris或者水(pH接近7)溶解DNA。

（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似，而且分子量都十分大，所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。

（4）同类核酸的分离：①RNA混合物的分离：经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时，多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。例如tRNA与rRNA的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化钠溶液洗脱，或用蔗糖梯度（顶部5%浓度，底部20%浓度）离心法分开。mRNA的代谢速度较快，在细菌中平均寿命为90min，在哺乳动物中约为几小时至十几小时，常用密度梯度离心法和DNA-琼脂柱进行分离。制备rRNA时，由于共沉作用，常混有mRNA，一般可用萘-1，5-二磺酸处理，使二者分开。各种tRNA的提纯，通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行，分离效果较好。②DNA混合物的分离：主要是变性或降解的DNA和天然的分离，常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶，梯度离心等方法。一个具有生物活性高度提纯的DNA制品应具有如下标准：不含有蛋白质及多糖；不含有可透析的小分子杂物；在pH7时紫外吸收最大值在257～261μm之间，E（P）在6600左右；不含有RNA；固体为纤维状，水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用；具有电泳均一性及超离心中单分散性；具有生物活性。