电子天平、烧杯、蒸馏水、容量瓶（250ml）1个、50ml容量瓶6个、试管6支（制作标曲应用）、水浴锅、试管若干、药品、标签、研钵、称量纸、注射器。
三、溶液配制
酸性茚三酮溶液：将茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L的磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解贮于冰箱中。
6mol/L磷酸：浓度为85%的磷酸大约是14mol/l，如果要配置6M的磷酸大约稀释到原来体积的倍即可。
3%的磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
冰醋酸
甲苯
四、试验步骤
1、标准曲线的制作
(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg。
(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液，，，，及ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg·ml-1。
(3)取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和3ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
表2-5脯氨酸标准曲线表
试剂123456
系列Pro溶液(mL)222222
冰醋酸222222
酸性印三酮溶液222222
Pro含量24681012
(4)冷却后各试管准确加入5ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。
(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg·2ml-1)。
2、茎脯氨酸含量的测定
(1)脯氨酸的提取：每个树种随机取当年生茎段若干段，用去离子水洗净后，每个重复称取茎段g，剪碎，分别置大管中，共3个重复。然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球塞，在沸水浴中提取10min，(提取过程中要经常摇动使脯氨酸迅速释放)，取出试管冷却至室温待用，冷却后即为脯氨酸的提取液。
(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及3ml酸性茚三酮
显色液，在沸水浴中加热40min，溶液即呈红色。
(3)冷却后加入5ml甲苯，充分摇荡30s，静置片刻。（取上层液至10ml的离心管中，在3000r/min下离心5min）
(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。
根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg·2ml-1)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。配合公式(8)计算茎脯氨酸含量：
脯氨酸含量（μg/g）＝A
FWVX/1000000(8)式中：X为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg），V为提取液总体积（5ml），FW为针叶的质量（g），A为测定时所吸取的体积（2ml）。
五、注意事项
1.酸性茚三酮溶液宜现配现用，或配好后贮于4℃冰箱中2-3d可用。
2.提取过程中应注意经常摇动大管，以使脯氨酸提取彻底。
3.反应液中各试剂需按顺序加入。
氨酸的连续积累对提高植物抗逆性有着一定的帮助。本研究中随着脱锻炼的进行，6种观赏植物的抗寒性下降，游离脯氨酸的含量也随着下降(图6)，与韩蕊莲的研究结果一致。由此在本研究中，游离脯氨酸的含量可以作为评价此6种观赏树种抗寒性的一项指标。
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