中国临床药理学杂志第37卷第5期2021年3月
作者
周植星，黄芳华
国家药品监督管理局药品审评中心
摘要
关键词
小分子药物;代谢产物;非临床研究
_正文_
新药开发过程中，需要进行非临床安全性试验，以提示临床用药的潜在风险，并为临床试验的风险管控提供信息。在非临床安全性试验中，原形药及其代谢产物在动物中达到足够的暴露很重要。由于种属间差异，小分子药物在不同动物种属和人体中的代谢特征可能存在质和量上的差异。在小分子药物研发进入临床试验阶段后，在人体药代动力学(pharmacokinetics，PK)研究中可能会发现人体特有的或高水平的代谢产物，如果在非临床安全性动物试验中这些代谢产物未被鉴定或充分评估，可能导致不能充分保障人体用药安全性。
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药物监管机构对代谢产物非临床研究的要求
ICH于2009年6月发布的M3(Ｒ2)指导原则《支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则》和2012年3月发布的M3(Ｒ2)指导原则问答(Ｒ2)对代谢产物的非临床安全性评价的必要性及试验项目进行了阐述。美国食品药品监督管理局(U.S.FoodandDrugAdministration，FDA)于2008年2月首次发布了《药物代谢产物安全性试验指导原则》，我国在此基础上于2012年发布了《药物代谢产物安全性试验技术指导原则》，该指导原则为在FDA2008年版指导原则基础上的翻译转化。基于对代谢产物安全性研究的不断认知，FDA于2020年3月发布了第2版《药物代谢产物安全性试验指导原则》，该指导原则在符合ICHM3(Ｒ2)指导原则的基础上，对何时以及如何识别和表征需要评估非临床毒性的药物代谢产物提供了建议。
1.1ICHM3(Ｒ2)指导原则及其问答对代谢产物非临床研究的要求
ICHM3(Ｒ2)［1］建议:在开始人体临床试验前，一般应对动物和人的体外代谢、血浆蛋白结合率以及重复给药毒性试验中所采用动物种属的全身暴露数据进行评价。进一步的动物PK信息(如吸收、分布、代谢和排泄)、以及与潜在药物相互作用有关的体外生物化学信息，应在大规模或长期临床试验前获得(一般在Ⅲ期之前)。这些资料可用于比较人体和动物代谢产物的差异并确定是否需要进一步追加其它试验。
ICHM3(Ｒ2)问答［2］则通过问与答的形式对代谢产物的要求进行了细化。对ICHM3(Ｒ2)正文中“人体中暴露量明显高于毒理学试验中的最大暴露量时，才需要对该代谢产物进行非临床评价”中的“明显高于”，解释为:在毒代动力学评价中通常将≥2倍(平均)曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)的差异视为有毒理学意义。因此，当动物中的暴露量为人体暴露量的50%以上时，一般认为对代谢产物的毒性表征是足够的。但是，当一个代谢产物占人体总暴露量的绝大部分时，动物中该代谢产物暴露量应超过人体。
对于“当需要对代谢产物毒性进行评价时，在哪种类型的体内非临床试验中代谢产物达到充分的全身暴露是重要的”解释为:在一般毒理学试验、致癌性试验(或无需进行致癌性评价时为体内微核试验)以及胚胎－胎仔发育毒性试验中，各有一种动物种属中该代谢产物需要达到充分暴露。
对于“当人体代谢产物暴露量与该代谢产物在毒性试验中的最大暴露量进行比较时，是否均应采用动物试验中所达到的最大暴露量，或者在某些情况下采用未见不良反应剂量(noobservedadverseeffectlevel，NOAEL)、未见反应剂量(noobservedeffectlevel，NOEL)或最大耐受量(maximumtolerateddose，MTD)时的暴露量更合适”解释为:因为原形药物和代谢产物对MTD下动物中所观察到的靶器官毒性均有贡献，假设毒性担忧在人体中可充分监测且不会造成不可接受的风险，应将动物在MTD水平下的暴露量与人体在治疗剂量的最大暴露量进行种属间的比较。如果在人体中无法监测MTD时的毒性，或引起不可接受的风险，则暴露量比较应该在所担忧毒性的NOAEL上进行。
对于“在开发期间，应在何时获得代谢产物的非临床数据”再次明确了ICHM3(Ｒ2)正文中的要求:应该在人体临床试验启动前评价动物和人的体外代谢数据。在大样本受试者或长期暴露之前(通常在Ⅲ期前)，应获得试验种属和人的体内代谢数据。
遗传毒性和安全药理学试验的要求:对于代谢产物的遗传毒性，ICHM3(Ｒ2)问答明确“该问题已超出了ICHM3(Ｒ2)的范围”，因此ICHM3(Ｒ2)和ICHM3(Ｒ2)问答未明确代谢产物的遗传毒性试验要求。对于安全药理学，ICHM3(Ｒ2)问答认为:由于评价安全药理学终点的临床试验通常在Ⅰ期中进行，已在人体中对安全药理学终点进行评价，因此一般不需要为了评价代谢产物而进行非临床安全药理学试验。但是，如果在人体中观察到了原形药物非临床试验中未预测到的安全药理学信号，为更好地了解机制，可考虑对这些人体代谢产物进行附加的安全药理学试验。
对于“应该如何设计代谢产物的非临床试验(种属选择、期限、试验类型等)”解释为:超出了ICHM3(Ｒ2)的范围;试验设计应根据具体问题具体分析原则进行考虑，与监管机构协商，做出科学的判断。
另外，我国曾于2012年发布了《药物代谢产物安全性试验技术指导原则》［4］，该指导原则为FDA《药物代谢产物安全性试验技术指导原则》基础上的翻译转化，故主要内容相似。因为现FDA已更新该指导原则，因此参考FDA现版《药物代谢产物安全性试验技术指导原则》更有意义，具体内容见下节。
1.3FDA对代谢产物非临床研究的要求
关于非临床试验设计的一般考虑:对不成比例药物代谢产物进行非临床试验设计时，应考虑以下因素:代谢产物与母体分子的相似性;药理学或化学类别;溶解性;胃pH值下的稳定性;Ⅰ相或Ⅱ相代谢产物;人体与动物中暴露水平的相对量。其他需要考虑的因素包括药物拟定适应症和患者人群［例如对于严重疾病适应症非临床试验可以简化，如肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)］、拟定的用药疗程(短期、间歇或长期用药)以及治疗剂量下的暴露水平。
代谢产物非安全性试验应遵循药物非临床研究质量管理规范(goodlaboratorypractice，GLP)。代谢产物非临床安全性试验包括以下几个方面。
一般毒性试验:代谢产物直接给药的一般毒性试验的给药期限应遵循ICHM3(Ｒ2)的建议;应在剂量为人体暴露量的若干倍或至少与人体暴露量相当的情况下研究药物代谢产物的毒性;推荐使用原形药物的临床给药途径，有正常理由的情况下可采用其他给药途径以达到充分暴露，如果给药途径为口服，验证代谢产物在胃环境中的稳定性是重要的;对于此类试验通过毒代动力学以确保适当的暴露是至关重要的。
遗传毒性试验:应在检测点突变的体外试验和体外染色体畸变试验中评估潜在遗传毒性。若其中一项或两项试验结果为不确定和/或阳性，则可能需要进行完整的遗传毒性标准组合试验。
生殖毒性试验:若药物拟在包含有生育可能妇女中的人群中使用时，应对代谢产物进行胚胎－胎仔毒性试验。根据一般毒性和胚胎－胎仔发育毒性试验的结果，可能需要进行其他生殖毒性试验。有时，只对形成药物代谢产物的一种种属进行胚胎－胎仔发育毒性试验是合理的。
致癌性试验:对于用于治疗慢性或复发性疾病，至少连续给药6个月或间歇性给药，当代谢产物的潜在致癌性不能在母体药物的致癌性试验中充分评估时，应该进行代谢产物的致癌性试验。应参考ICHS1指导原则进行一项致癌性试验或一项替代试验。
关于何时进行药物代谢产物安全性评估:如果药物代谢产物的毒性试验是必要的，申办者应该在大规模临床试验开始之前完成试验并向FDA提供试验报告。为了优化和加快癌症之外的严重或危及生命的疾病(如ALS、人免疫缺陷病毒)的药物开发，药物代谢产物的非临床试验的数量和类型将可根据具体情况进行修改。FDA关于代谢产物非临床研究的决策流程图见图1。
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案例分析
当在人体试验中发现不成比例的代谢产物时，根据具体情况采用不同的研究策略，以下选择最近美国批准上市的几个药物对代谢产物的研究进行案例分析。
2.1Lefamulin
根据FDA审评报告［7］，人体物质平衡试验显示，Lefamulin经静脉注射后人体主要代谢产物Bc－8041(2Ｒ－羟基lefamulin)占0.8%～6.7%，口服给药后占8.3%～22.0%;该代谢产物在体外无抗菌活性;虽然在非临床安全性试验所用动物种属中存在，但不是主要代谢产物，如大鼠经静脉给药后在检测限以下，经口给药后仅为人推荐剂量下暴露量的0.12倍，说明该代谢产物在大鼠中暴露不充分;在兔胚胎－胎仔发育毒性试验中该代谢产物也未充分暴露;Bc－8041在食蟹猴中的暴露量大于0.5倍，在食蟹猴中已充分暴露。Bc－8041在重复给药毒性试验暴露情况见表1。
根据ICHM3(Ｒ2)要求，该代谢产物由于在两种种属重复给药毒性试验中的一种动物有充分暴露，无需进行代谢产物的一般毒理学试验。Bc－8041进行了体外hEＲG钾通道抑制试验(Bc－8041.HCl显示出抑制作用，IC50为702μM，比原形药的IC50高一个数量级)、体外遗传毒性试验(Ames试验和小鼠淋巴瘤细胞试验，结果均为阴性)和大鼠胚胎－胎仔发育毒性试验(可见心脏畸形，与原形药结果一致)。在大鼠胚胎－胎仔发育毒性试验中，Bc－8041静脉给药的NOAEL为10mg·kg·d－1，平均AUC0－12h为1705～2135ng·h·mL－1，大于人推荐剂量下暴露量。原形药和代谢产物的小鼠淋巴瘤细胞试验因为相对总生长率(relativetotalgrowth，ＲTG)不符合要求，而Ames试验因为具有过高的抗菌作用，使得这两个体外致突变试验无效，FDA要求上市后再进行高剂量ＲTG达到10%～20%时的原形药和代谢产物的小鼠淋巴瘤试验。
2.2Ozanimod
Ozanimod(商品名:ZEPOSIA)是一种鞘氨醇1－磷酸(sphingosine1－phosphate，S1P)受体调节剂，FDA于2020年3月批准其用于成人复发型多发性硬化症(relapsing－remittingmultiplesclerosis，ＲＲMS)患者的治疗。Ozanimod可与S1P受体1和5受体高亲和力结合，导致受体内化，抑制淋巴细胞从淋巴结流出，减少外周血淋巴细胞的数量。Ozanimod在多发性硬化症中的作用制尚不清楚，但可能与减少淋巴细胞向中枢神经系统的迁移有关。在多发性硬化(multiplesclerosis，MS)临床试验中，在3个月时平均淋巴细胞计数下降至约基线45%［8］。
该品种于2017年12月首次向FDA提交新药上市申请(newdrugapplication，NDA)，但FDA于2018年2月因“NDA中的非临床和临床药理学部分无法满足完全审评的要求”而给出拒绝受理信(refusaltofile，ＲTF)，2019年3月申请人完善资料后，重新提交了NDA。从FDA公开的审评信息看Ozanimod主要活性代谢产物CC112273的非临床研究评价和临床药理中的样品长期稳定性评价不完善是首次NDA被拒的原因。
根据FDA审评报告［9］，在临床试验中Ozanimod有2个主要活性代谢产物(CC112273、CC1084037)，原形药、CC112273和CC1084037分别占人体AUC的6%、73%和15%，其中CC112273半衰期(在人体长达10～13d)显著长于原形药，可能存在蓄积(蓄积指数16)。该两代谢产物在小鼠、大鼠和猴中均可形成，但是有暴露量的差异。FDA在pre－NDA会议中指出:需确保所有的主要人体循环代谢产物在非临床试验中得到了充分评估。需要确保CC112273在完整的非临床研究包中达到了充分暴露，包括2个种属的慢性毒性、生殖毒性和致癌性试验。但是在首次提交NDA时，申请人并未解决该代谢产物的暴露问题。FDA在ＲTF中指出:需要在标准的非临床评价包中评估CC112273;为桥接已有的非临床数据，需在所有试验种属中，采用关键性试验中相似的给药方案，证明在雄性和雌性中有充分的CC112273血浆暴露;已有的毒代动力学(toxicokinetics，TK)数据不足以确定安全性评估是否足够。
申请人在重新提交NDA时，补充了在GLP条件下进行的小鼠、大鼠、食蟹猴和兔14d重复给药PK桥接试验，代谢产物CC112273的CByB6F1小鼠28d、SD大鼠96d重复给药毒性试验，以及妊娠兔剂量探索/TK试验资料。因为CC112273和CC1084037发现于临床开发后期，原形药的毒理学试验中均未对这两个代谢产物进行暴露量测定，均通过14d重复给药桥接试验估算其暴露情况。采用桥接性试验的暴露量，计算之前进行的原形药的非临床安全性试验中的主要代谢产物的暴露情况见表2。
另外，为了在非临床试验中达到人体主要代谢产物更高的暴露量，进行了小鼠、大鼠和猴经口给药代谢产物CC112273的试验。结果显示，在大鼠或猴中直接给予CC112273，因为经口给药后的广泛清除而不能提高CC112273的系统暴露量;由于在体内CC1084037与CC112273相互转化而处于平衡状态，猴经口给予CC112273后未检测血浆中的CC1084037。
大鼠96周致癌性试验中未见致癌性，14dPK桥接数据显示高剂量(2mg·kg－1)下CC112273的AUC约相当于人在MＲHD下AUC的0.6倍，CC1084037暴露量不足(为MＲHD的0.18倍)。Tg.rasH2小鼠致癌性试验中高、中剂量具有致癌性，NOAEL为低剂量8mg·kg－1，14dPK桥接数据显示NOAEL下CC1084037、CC1084037的AUC均高于MＲHD下的AUC。
综上所述，除PPND试验外，虽然在所有采用Ozanimod进行的关键性试验中的暴露量并不一致，但原形药和人体主要代谢产物在至少一个种属的长期一般毒理学、致癌性、遗传毒性和生殖毒性试验中得到了充分的暴露，因此不需对代谢产物进行单独的相应试验。
另外，申请人对代谢产物CC112273和CC1084037进行了体外遗传毒性试验(Ames试验、染色体畸变试验)，除了CC1084037体外染色体畸变试验结果为阳性外其余试验结果均为阴性。另外，追加了CC1084037大鼠体内骨髓微核/肝彗星试验，结果均为阴性。考虑到代谢产物CC112273半衰期(在人体长达10～13d)显著长于原形药，可能存在蓄积(蓄积指数16)，因此追加了CC112273的小鼠1个月和大鼠3个月重复给药毒性试验，结果显示二者NOAEL均为100mg·kg－1，CC112273的AUC均大于MＲHD下的AUC。
2.3布立西坦
布立西坦(Brivaracetam，商品名BＲIVIACT)是一种2－吡咯烷酮衍生物，对脑特异性结合位点突触囊泡蛋白2A(synapticvesicleprotein2A，SV2A)具有高度选择性亲和力，减少兴奋性神经递质的释放［10］。布立西坦于2016年获得FDA批准上市，作为联合疗法治疗4岁以上癫痫患者的癫痫部分性发作;欧盟批准作为联合疗法治疗4岁以上癫痫患者伴有或不伴有继发性全面性发作的癫痫部分性发作。
2.4Brexanolone
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3.2关于代谢产物非临床研究策略和非临床试验项目的考虑
在人体试验中发现人体特有的代谢产物或高水平的代谢产物时，需对已有的各项资料进行综合评价，分析代谢产物的性质，阐述在已有毒理学试验中是否达到了充分暴露，是否可评价代谢产物的安全性，在此基础上确定是否需要追加非临床安全性评价试验及其试验内容。FDA指导原则给出了一个比较明晰的代谢产物非临床研究决策流程图，可参考其进行判断。FDA指导原则中所列举的3个案例［5］和以上所列举的4个案例中，基于代谢产物的不同情况确定是否需要进行非临床试验，以及不同的非临床试验策略。
在需要进行代谢产物非临床试验时，一种策略是直接对代谢产物进行毒理学试验。另一种策略是在能使代谢产物达到充分暴露的种属中进行原形药的毒性试验来覆盖评价代谢产物的安全性。在原有的毒理学试验未检测药物代谢产物，再重新进行毒理学试验尤其是长期的毒理学试验(如致癌性试验)的情况下，进行药代的桥接性研究是一种比较快捷的方式，但是此种方法需采用与关键性毒理学试验同样的给药方案，包括同样的动物种属，从而来保证可进行药代桥接。
对于代谢产物的非临床试验项目，根据ICHM3(Ｒ2)及其问答要求，在一般毒理学试验、致癌性试验(或无需进行致癌性评价时为体内微核试验)以及胚胎－胎仔发育毒性试验中，代谢产物需要在一种动物种属中达到充分暴露;一般情况下不需要进行安全药理学试验，除非人体试验中发现非预期的安全药理学信号而可能需要进行附加的安全药理学试验以了解毒性机制;对于遗传毒性试验，ICHM3(Ｒ2)未明确要求，在FDA指导原则提出需要进行遗传毒性试验，包括点突变试验和体外染色体畸变试验，若结果为不确定和/或阳性，则需要进行完整的遗传毒性标准组合试验，如果代谢产物遗传毒性试验结果为阳性，还需要进行一项致癌性试验。由于遗传毒性试验对于预测致癌性和遗传性疾病很重要，因此建议对代谢产物进行遗传毒性试验。
3.3关于代谢产物非临床安全性评价的阶段性和特殊人群的考虑