(一)原理转氨酶是体内重要的一类酶。转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的α–酮基之间的相互转化,从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸,这种作用称为转氨基作用。它在生物体内蛋白质的合成、分解等中间代谢过程中,在糖、脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系、相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。在动物机体中活力最强、分布最广的转氨酶有两种:一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(简称GPT),另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称GOT)。它们的催化反应如下:
3.GOT基质液:称取a–酮戊二酸29.2mg及DL–天冬氨酸2.66g,溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml中,溶解后再加缓冲液70ml,并移入100ml容量瓶内。加1mol/L的NaOH溶液0.5ml,校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100ml。贮存于冰箱备用,可用1周。4.2,4–二硝基苯肼溶液:称取2,4–二硝基苯肼20mg,先溶于10ml浓盐酸中(可加热助溶),再以蒸馏水稀释至100ml(有沉渣可过滤),棕色瓶内保存。5.丙酮酸标准液(1ml=2μmol丙酮酸):精确称取丙酮酸钠22mg,溶解后转入100ml容量瓶中,用磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7.4)稀释至刻度。6.0.4mol/L氢氧化钠溶液。7.血清8.柠檬酸苯胺溶液:取柠檬酸50克溶于50ml蒸馏水中,再加苯胺50ml充分混合即成,低温出现结晶时,可置于37℃水浴中,待溶解后应用。(三)操作
1.标准曲线制作:取6支试管按下表操作。
试剂(ml)123456
丙酮酸标准液00.050.10.150.20.25
GPT(GOT)基质液0.50.450.40.350.30.25
pH7.4磷酸缓冲液0.10.10.10.10.10.1
水浴37℃,10min
2,4二硝基苯肼溶液0.50.50.50.50.50.5
水浴37℃,20min
0.4mol/L氢氧化钠溶液5.05.05.05.05.05.0
(ml)
相当活性(单位数)空白100200300400500
混匀后,在520nm波长处,以空白调“0”点,读取各管光密度。以单位值为横座标,
光密度为纵座标,绘制标准曲线。
2.GPT(GOT)测定:取2支洁净的试管按下表操作。
试剂(ml)空白测定
血清0.10.1
GPT(GOT)基质液--0.5
混匀,37℃水浴,60min
GPT(GOT)基质液0.5--
柠檬酸苯胺溶液(滴)11
2,4二硝基苯肼溶液0.50.5
混匀,37℃水浴,20min
0.4mol/L氢氧化钠(ml)5.05.0
混匀,放置5min,在波长520nm处测定,以空白调“0”点,读取光密度。GPT测
定不加柠檬酸苯胺溶液,其他操作方法同GOT测定法。
(四)计算
1.由所测得之光密度值直接查标准曲线,即可得知活性单位。
2.若用标准管法测定,可用丙酮酸标准液(1ml=2μmol)0.1ml,按操作测知标准管光密度,按下列方式计算结果:
(测定管光密度/标准管光密度)×200=转氨酶活性(单位数)/100ml血清。