苯并咪唑类驱虫药，如甲苯咪唑、阿苯达唑和氟苯达唑是治疗广谱寄生虫蠕虫的长期药物，它可以干扰微管的形成、葡萄糖摄取和ATP的形成，从而抑制寄生虫存活和繁殖[3]。芬苯达唑是一类苯丙咪唑类的药物，已广泛用于人和动物中抗肠道寄生虫，其作用机理有2种理论，一种认为药物通过抑制线虫的延胡索酸还原酶而发挥驱虫作用，另一种理论认为抑制蠕虫线粒体的电子传递体系和电子传递体偶联的磷酸化反应，抑制与微管形成有关的葡萄糖转运系统，进而使ATP的合成受阻[4]。研究报道，芬苯达唑是一种微管靶向剂，在体外实验中可以干扰癌细胞有丝分裂微管形成，抑制癌细胞增殖。此外，其还干扰癌细胞葡萄糖摄取和代谢、破坏癌细胞线粒体及p53的稳定，促进癌细胞凋亡[5-7]。
本研究旨在探讨芬苯达唑对肺腺癌的自噬及增殖、侵袭和迁移能力的影响，为抗寄生虫药物老药新用治疗肿瘤提供新的理论依据和见解。
1、材料与方法
1.1试剂及抗体
1.2细胞及培养
人肺腺癌细胞系（A549、H358）购自中国科学院细胞库。2株细胞均在含有10%胎牛血清、青霉素–链霉素–谷氨酰胺的培养基中培养，并置于37℃、5%CO2的培养箱中。
1.3CCK-8实验
将A549和H358细胞用胰蛋白酶消化，以每孔100μL、4000个细胞接种于96孔板，每组设置3个复孔。在细胞培养箱孵育24h，分为对照组（不加药）和芬苯达唑组（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）。药物处理24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，继续孵育2h后，使用SpectramaxI3酶标仪测量450nm处的吸光度（A）。通过A值计算细胞活力并绘制曲线。在自噬抑制实验中，与芬苯达唑同时加入5、10μmol/L氯喹进行共处理，24h后按上述方式进行检测。
1.4细胞计数实验
将A549和H358细胞以1×106个细胞、2mL接种在6孔板中，细胞培养箱孵育24h后加入不同浓度（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）的芬苯达唑，续孵育24h后，胰蛋白酶消化后离心，PBS重悬后用血细胞计数器手动计数。
1.5划痕实验
A549和H358细胞在6孔板（1×106）上铺板，当细胞贴壁后，通过用一次性1mL枪头做水平划痕以获得无细胞的空间，PBS洗去脱落细胞并吸尽，加入含有不同浓度（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）芬苯达唑的无血清培养基。0时刻组在划痕完成后立即在显微镜下拍摄划痕区域，24、48h组在划痕完成分别在24、48h时在显微镜下拍摄划痕区域，用ImageJ软件进行处理分析。在自噬抑制实验中，与芬苯达唑5μmol/L同时加入5、10μmol/L氯喹进行共处理，并单独设置氯喹10μmol/L组，0、24、48h后按上述方式进行检测。
1.6Transwell侵袭实验
在24孔板中加入500μL含不同浓度（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）的芬苯达唑及10%胎牛血清的培养基，将基质胶与无血清培养基以1∶8的比例稀释后（60μL）加入Transwell小室中，后将Transwell小室至于24孔板中，取1×105、200μL的A549和H358细胞悬液加入上室，置于细胞孵箱中培养24h。取出小室后，24孔板弃培养基，加入4%多聚甲醛固定15min,PBS洗后加入结晶紫染色液染色30min。最后在显微镜下进行细胞计数。在自噬抑制实验中，与芬苯达唑5μmol/L同时加入5、10μmol/L氯喹进行共处理，并单独设置氯喹10μmol/L组，24h后按上述方式进行检测。
1.7RT-qPCR实验
使用Trizol试剂对A549细胞进行裂解及提取总RNA。用PrimeScriptTMRT试剂和gDNAEraserKit进行逆转录。使用TBGreenPremixExTaqTM和Bio-RadCFX96PCR系统（美国Bio-Rad）和CFXManager软件（Bio-Rad）检测cDNA样品。引物序列为：N-cadherin上游引物：5’-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3’，下游引物：5’-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3’;Cytokeratin上游引物：5’-AGAGTGGACCAACTGAAGAGT-3’，下游引物：5’-ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT-3’;Occludin上游引物：5’-ACAAGCGGTTTTATCCAGAGTC-3’，下游引物：5’-GTCATCCACAGGCGAAGTTAAT-3’;Vimentin上游引物：5’-GACGCCATCAACACCGAGTT-3’，下游引物：5’-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3’;FN1上游引物：5’-CGGTGGCTGTCAGTCAAAG-3’，下游引物：5’-AAACCTCGGCTTCCTCCATAA-3’;GAPDH上游引物：5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3’，下游引物：5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’。
1.8转录组测序及数据分析
1.9蛋白免疫印迹
将1×106个A549细胞接种在6孔板中并生长过夜后分别用0、1、2.5、5μmol/L芬苯达唑处理细胞24h。重悬于含有蛋白酶抑制剂的100μL裂解缓冲液中，冰上孵育15min后离心收集上层清液。通过BCA蛋白测定法测量上清液中总蛋白浓度。总蛋白通过10%SDS-PAGE分离、电泳转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用牛血清白蛋白封闭1h，在4℃下与一抗（N-cadherin、Snail、Keratin17、Occludin、Vimentin、FN1、LC3、P62、Beclin-1,1∶1000）孵育过夜。将PVDF膜与二抗（1∶20000）在室温下孵育2h。通过ECL试剂盒（碧云天）发光显影蛋白条带，拍照后用ImageJ软件进行处理和分析。
1.10统计学方法
数据采用表示，采用GraphPadPrism8.0.1软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析并进行事后检验。
2、结果
2.1芬苯达唑对肺腺癌细胞增殖的影响
图1细胞增殖活力（A）和细胞计数（B）情况（n=3)
与对照组比较：**P<0.01***P<0.001。
2.2芬苯达唑对肺腺癌细胞迁移能力的影响
图2在不同浓度下A549和H358细胞迁移情况（n=3)
与0h组比较：*P<0.05**P<0.01***P<0.001。
2.3芬苯达唑抑制人肺腺癌细胞侵袭能力的影响
Transwell实验结果显示，与对照组相比，在芬苯达唑作用24h后，且随着药物浓度增加，A549和H358细胞穿膜数量显著降低（P<0.001），表明芬苯达唑显著抑制了细胞侵袭，见图3。
图3在不同浓度芬苯达唑下A549和H358细胞侵袭情况（n=5，×200)
与对照组相比，随着芬苯达唑药物浓度的增加，N-cadherin、Cytokeratin、FN1、Occludin的蛋白相对表达量显著降低，而Vimentin蛋白相对表达水平随药物浓度降低而增高（P<0.05、0.01、0.001），见图5。
2.7自噬抑制剂对人肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响
Fig.6Expressionlevelofautophagy-relatedgeneshotmap
在划痕和Transwell实验中，24h时，芬苯达唑10μmol/L+氯喹10μmol/L组A549和H358细胞的相对迁移率显著低于芬苯达唑单独处理组（P<0.01、0.001），表明氯喹可以逆转芬苯达唑引起的A549、H358细胞侵袭和迁移能力降低的作用，见图9、10。
3、讨论
尽管目前已有多种药物用于肺腺癌的临床治疗，然而现有药物在临床应用中会出现响应率低、耐药及复发等问题，使得综合治疗后肺腺癌患者的预后仍然不理想。另一方面，新药的发现与开发面临耗时长、成本高及风险高等困难，因此“老药新用”成为了当前比合成新型药物更快、更经济、低风险策略。
Fig.7Effectofvariousconcentrationoffenbendazoleontheexpressionlevelofautophagyrelatedproteins
与对照组比较：*P<0.05**P<0.01***P<0.001。
图8使用氯喹与芬苯达唑共作用后对细胞增殖的影响
与芬苯达唑相同浓度组比较：*P<0.05**P<0.01***P<0.001。
图9使用氯喹与芬苯达唑共作用后对细胞迁移的影响
图10使用氯喹与芬苯达唑共作用后对细胞侵袭的影响
参考文献:
[4]王宏磊,刘义明,徐飞,等.芬苯达唑的药理作用及其在动物生产中应用的研究进展[J].中国兽药杂志,2019,53(5):67-73.
基金资助:国家自然科学基金资助项目(81972190);陆军军医大学第二附属医院青年博士人才孵化计划(2022YQB012);
糖尿病不仅严重危害人类健康，而且给家庭和社会带来极大的经济负担，因此降糖药的研发极其重要。由瑞士诺华有限公司研发的维格列汀可用于糖尿病患者的全程治疗，是国内适应证最广泛的二肽基肽酶-4(dipeptidylpeptidase-4,DPP-4)抑制药之一[2]。
胃痞又名痞满、心下痞,临床以心下胃脘部痞塞、胀满,触之无形、按之柔软、压之无痛为主要症状。《景岳全书?痞满》云“痞者,痞塞不开之谓;满者,胀满不行之谓”,对其临床症状做了精简说明。胃痞是当前常见的消化系统疾病,根据其临床表现,现代医学中的慢性胃炎、功能性消化不良、胃下垂等疾病均可参照胃痞的治疗原则进行辨证施治。
血友病A为凝血因子Ⅷ（coagulationfactorⅧ，FⅧ）缺乏导致的X染色体隐性遗传性出血性疾病。根据FⅧ水平，分为轻型（5%-<40%）、中型（1%-5%）和重型（<1%）。其中重型血友病A患者临床表型较重，主要表现为关节肌肉反复出血，致残率较高[1]。
糖尿病肾病(DN)由大约40%的糖尿病患者发展而来，并随着世界范围内糖尿病患病率的急剧上升而逐年增加，DN症状包括肾小球滤过率下降、白蛋白尿及终末期肾衰竭等，然而大多数患者在需要进行肾脏替代治疗之前便死于心血管并发症及感染。引起DN的致病因素很多，包括家族遗传、血糖代谢异常、高血压及肥胖等。
我国在药物警戒领域虽然起步较晚，但自2018年起呈现较为迅猛的发展势头，2019年修订的《中华人民共和国药品管理法》正式将药物警戒纳入法律，提出国家建立药物警戒制度。同年，我国发布首版《药物警戒质量管理规范》(GVP),使药物警戒进一步制度化、规范化、标准化。
221s(2,9)母核脯氨酸残基C端以酯键的形式与天然冰片相连，冰片具有芳香开窍作用，可以协助药物分子通过血脑屏障，直接作用于大脑[3-4],见图1。脯氨酸残基的丙氨酸端与丹参素通过更为稳定的酰胺键结合，丹参素可协同降压[5],同时起到保护血管[6]、心脏[7]、肾脏[8]等作用。
药品上市许可持有人制度是贯穿《中华人民共和国药品管理法》的核心制度，也是基本制度。相比于过去药品上市许可与生产许可相捆绑的管理制度，药品上市许可持有人制度最核心的特点在于由持有人持有品种，以自己的名义将产品投向市场，对药品全生命周期质量管理承担主体责任。