关于《胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）指导原则》（征求意见稿）公开征求意见的通知
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附件：1.《胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）指导原则》（征求意见稿）
一、前言
本指导原则旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对该类试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究内容，可自行补充。
二、适用范围
（一）临床背景
胎儿染色体非整倍体（fetalchromosomeaneuploidies）中的21三体、18三体、13三体（trisomies21、18、13，即T21、T18、T13）是临床上最常见的染色体非整倍体疾病。其对应的分别21-三体综合征（又称唐氏综合征，先天愚型或Down综合征）、18-三体综合征（又称Edwards综合征）和13-三体综合征（又称Patau综合征），发病率分别约为1/700、1/6000、1/10000，患儿绝大多数存在严重智力障碍及器官畸形，生活无法自理，不仅影响儿童的生命健康和生活质量，同时影响经济社会的健康可持续发展。
我国对以下孕妇均实行产前诊断：35岁以上的高龄孕妇；产前筛查出来的胎儿染色体异常高风险的孕妇；曾生育过染色体病患儿的孕妇；产前B超检查怀疑胎儿可能有染色体异常的孕妇；夫妇一方为染色体异常携带者；医师认为有必要进行产前诊断的其他情形。
（二）高通量测序法进行产前筛查
高通量测序（High-ThroughputSequencing）是近年来迅速发展的测序技术，又称做下一代测序（NGS,NextGenerationSequencing）或大规模平行测序（MPSS，massivelyparallelsignaturesequencing）。相较于以Sanger测序为代表的第一代测序技术，其检测通量高，灵敏度高，速度快，随着近年来检测成本的降低，逐渐由科研转入临床应用研究。但从检测的准确性上说，第一代测序技术目前仍然是测序检测的金标准。
（三）适用范围
本指导原则所述的高通量测序法，指的是通过文库构建、片段扩增进而进行上机测序的第二代高通量测序方法，不需要进行片段扩增的第三代、第四代单分子测序方法在文中并未涉及。但高通量测序技术发展迅速，第三代、第四代单分子测序方法如果在企业内部参考品设置、性能评估或临床评价等处如有适用的方面，可以参照执行。
适用人群：本指导原则预期用途为对孕周12周（包含12周）以上的孕妇进行产前筛查，其结果不能代表对孕妇怀有三体胎儿的确认，产前筛查的结果必须要经过产前诊断进行确认。
三、基本要求
（一）综述资料
综述资料应详细阐明检测原理，可配合图示并写明一个完整检测配合使用的全部试剂及耗材名称、生产厂家、货号或注册证书号以及详细的组成成分。
（二）主要原材料的研究资料
主要原材料的研究资料包括企业内部参考品和完成检测所需试剂组成两部分。
1.企业内部参考品应至少包括：阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、嵌合体参考品，具体要求如下：
1.2阴性参考品：应包括采用染色体数目正常胎儿DNA片段按一定比例与正常女性血浆混合的模拟样本，以及采用其他染色体异常胎儿DNA片段按一定比例与正常女性血浆混合的模拟样本。其他染色体异常的阴性参考品由申请人依据常见染色体异常项目并根据对产品的质控要求自行选择。
1.3检测限参考品：应采用T21、T18、T13胎儿DNA片段按不同比例梯度与正常女性血浆混合的模拟样本，如5%、3.5%、2.5%等，建议采用95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。
1.4嵌合体参考品：由申请人按照对产品的质控要求自行设定模拟T21、T18和T13嵌合体的组成比例，如70%异常，30%正常；30%异常，70%正常等。
申请人应详细说明企业内部参考品的组成、详细说明制备及检定方法、胎儿DNA片段浓度确认方式和所占比例的选择依据。企业内部参考品中各类型均应设置多个重复。
2.完成全部检测流程所需试剂应至少包括：血浆游离DNA提取纯化试剂、文库构建试剂、文库定量试剂、测序试剂、阴、阳性质控品，以及与之配合使用的测序芯片和数据分析软件。具体要求如下：
2.1血浆游离DNA提取纯化试剂：该试剂分类界定为一类试剂，无论申报产品中包含或是配合使用，申请人均应提供该试剂提取纯化原理、生产厂家及货号或一类备案凭证号，提交详细组成成分资料。性能方面需对该试剂提取的DNA片段准确性及纯度要求，提取效率、重复性及抗干扰能力进行评估。
2.2文库构建试剂、文库定量试剂、测序试剂：文库构建试剂通过对片段化的DNA进行缺口补平及相应部分5‘端磷酸化和3’端去磷酸化之后使用连接酶加上用于测序和分析的标签和接头，构建成可以用来测序上机的标准文库；文库定量试剂通过PCR扩增及与标准品曲线的比对，用于定量测定文库浓度，为后续均一化文库进行上机测序做准备，同时能够评估文库构建的质量。文库定量时应明确对文库质量、片段大小及浓度要求，应提供分析图谱，对其中参数进行解释说明（如是否有杂峰，产生的原因，是否对最终结果产生影响等）；测序试剂用于对均一化的文库进行片段扩增，通过基因测序仪捕捉扩增过程中碱基的变化引起的信号变化来达到读取序列的目的。
以上三种试剂一般由：相应功能的酶（末端修复酶、DNA连接酶、缺口修复酶DNA聚合酶等）、核苷酸序列（引物、接头序列、标签序列、文库定量标准品）、缓冲液及dNTP组成。具体要求如下：
2.2.1酶：应提交纯度、活性和稳定性资料，提交功能性试验资料。例如：文库构建过程包括但不限于末端修复酶、DNA连接酶、缺口修复聚合酶等，所选择的酶应当具有末端突出削平、缺口补平、标签或接头连接、DNA聚合酶活性；
2.2.2核苷酸序列：应提交相应的序列组成和纯度信息，序列准确度及稳定性资料；引物设计应提交引物设计原则及选择对比依据；
2.2.3缓冲液：缓冲液应明确详细的组成及各盐浓度选择对比的依据；
2.2.4dNTP：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，应提交对纯度、浓度、保存稳定性等的详细验证资料。
2.3阴、阳性质控品：须能够监控DNA片段提取到最终测序结果全过程，因此应当由阴、阳性（T21、T18和T13）胎儿DNA片段按已知比例与正常女性血浆基质混合组成。
2.4测序芯片：应详细阐明芯片进行片段扩增原理及结构，明确使用芯片型号，并对同一次测序芯片上样的样本间精密度进行评价。
2.5数据分析软件：举例介绍原始数据质量评估、数据处理和筛选的方法，明确数据筛选依据以及使用的算法。
2.6除上述材料外，还需提交不同原材料对于最终测序数据质量影响的评估材料。由于各测序平台的技术侧重点不同，数据质量评估的项目可能存在差异，需考虑包括但不限于以下方面：文库浓度、文库片段大小、单样本总序列数（数据量）、唯一比对率、单次检测的GCgap（最高GC值与最低GC值的差值）以及错误率等。
综上所述，申请人应提交主要原材料的筛选依据及试验资料。如为自制，则应提交：制备方法、质量要求、质量检测方法、对比筛选的试验资料等；如为外购，则应提交：外购证书、质量要求、质量检测方法、对比筛选的试验资料等。其中，对比筛选的试验资料应包括筛选过程中的数据、图谱、对比图表等信息。
（三）主要工艺及反应体系的研究资料
1.主要生产工艺：包括配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对关键参数进行有效控制。主要包括主要生产工艺介绍和应用流程图方式表示，后者需标明关键工艺质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。
此外，还应进行数据量对检测结果的影响研究和胎儿游离DNA浓度和比例对检测结果的影响研究。
（四）分析性能评估资料
1.最低检出限：建议使用国家参考品进行梯度稀释并多次检测，将具有95%阳性检出率的胎儿游离DNA浓度水平作为最低检出限。
2.企业内部参考品符合率：用试剂检测企业内部参考品的符合情况进行评估。
3.微缺失微重复评价：申请人应采用一定比例的微缺失微重复胎儿DNA与正常女性血浆混合制备微缺失微重复评估模拟样本，微缺失微重复模拟样本的类型及数量由申请人选择确定，并在产品说明书中明示。
4.嵌合体评价：申请人应采用不同嵌合比例的模拟T21、T18和T13嵌合体样本对试剂检测嵌合体的能力进行评估，对不能检测到的模拟嵌合体的嵌合比例进行确认。
5.2合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精密度进行评价。
5.3用于精密度评价的模拟样品和临床样本均应至少包含3个水平：阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品，并根据产品特性设定适当的精密度要求。精密度评价中的每一次检测均应从核酸提取开始。
5.4干扰试验：包括内源性干扰物质和外源性干扰物质。应针对可能存在的干扰情况进行验证。建议申请人在干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价。内源性干扰物质的评价只少应包括胆红素、游离血红蛋白、甘油三酯。
5.5特异性：主要包括其他常见染色体样本是否干扰T21、T18和T13阴、阳性的检出能力进行评价。其他常见染色体样本类型及数量由申请人选择确定，并在产品说明书中明示。
（五）参考值的确定资料
由于目前胎儿染色体非整倍体T13、T18、T21的阳性值测算存在多种计算方式，且更好的算法和数据处理方式仍在不断开发中，因此，如申请人选择了某一算法作为参考值的计算方式，则应详细阐述选择该算法作为依据的原因（如权威文献、行业共识等），并详细阐述计算公式和各参数代表的意义并提交采用一定数量真实临床样本对参考值的试验验证资料。
以大样本常用的Z-值（Z-score）算法来举例说明：
1.Z-值这个统计量反应的是当前数值距离平均数的相对标准距离，Z-值的应用条件为大样本量以及数据符合正态分布，计算公式如下，
1.1chrNz-scorefortestsample:所检测样本的Z-值；
1.2N：为指定的第N染色体；
1.3%chrNsample：待测样品第N条染色体唯一比对序列数占常染色体的百分比，通过高通量测序后软件分析获得；
1.4Mean%chrNreference：参照样品第N条染色体比例平均值；
1.5S.D.%chrNreference：参照样品第N条染色体比例的标准偏差。
2.被筛查孕妇所怀胎儿的染色体数量状况应当符合正态分布图，即大概率为正常染色体数量，小概率事件为胎儿染色体非整倍体，如下所示：
如图可以看出，出现在Z-值为正负3以外的数值，则有99.9%的可能为阳性，因此，通常将Z-值=3定为参考值分界点。Z-值>3则判断为胎儿染色体非整倍体阳性。
鉴于并无100%阴、阳性分界点，申请人应将参考值设定灰区范围，灰区的设定应提交理论和实际试验结果的依据，并在说明书【参考值】和【检验结果的解释】项进行解释说明，如是否需要用产前诊断的方式进行最终确认，可能的原因，是否需要孕龄再大时进行再次抽血复测等等。
在参考值设定后，申请人应当选取一定数量阴、阳性临床样本进行试验验证，如与该公式不符，则应说明出现的问题及详细的数据矫正方式。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。主要涉及两部分内容：申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。
1.申报试剂的稳定性研究，主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。
此外，试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
（七）产品技术要求
如果拟申报试剂已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于上述标准要求。
（八）注册检测
根据总局第5号令要求，首次申请注册的第三类产品应在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。该产品已有国家参考品发布，在注册检测时应使用“高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体（T21、T18和T13）国家参考品”进行
（九）产品说明书
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对说明书的重点内容进行详细说明。
1.【产品名称】
建议按照如下方式命名：胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（方法学）或胎儿染色体非整倍体（T21/T18/T13）检测试剂盒（方法学）。
举例：胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（半导体测序法）、胎儿染色体非整倍体（T21/T18/T13）检测试剂盒（可逆末端终止测序法）。
2.【预期用途】
2.1第一自然段：预期用途描述，包括被测孕妇孕周特征，样本类型等。
举例：该产品用于定性检测孕周为12-24周的孕妇外周血血浆中胎儿游离脱氧核糖核酸（DNA），通过分析样本中的胎儿游离DNA的21号、18号及13号染色体数量的差异，对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征进行产前辅助诊断。如试剂盒仅是测序步骤中的建库步骤，则预期用途应描述为“构建测序文库”。
2.3明确该产品作为产前筛查用途，其结果的确认要由产前诊断金标准进行。
3.【检验原理】
详细说明母体胎儿游离DNA判断染色体数量的检测原理并简介方法学原理（必要时可用图示进行）。
4.【主要组成成分】
说明试剂盒所包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
5.【储存条件及有效期】
5.1按照稳定性研究资料，说明试剂盒的效期稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等，应标明具体的储存条件及效期。
5.2按照《医疗器械说明书和标签管理规定》（总局令第5号）增加生产日期，使用期限或者失效日期。
6.【样本要求】
6.1样本采集要求。
6.2说明对采血管及抗凝剂的要求；
上述内容需在稳定性研究资料中详述并用产品进行性能评估与验证。
7.【适用机型】
适用的测序仪器具体型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。
8.【检验方法】
无论是否包含提取试剂或测序试剂，申请人应从头详细描述完成完整检测所需的全部步骤，包括血浆游离DNA的提取、文库构建、文库定量、片段扩增及上机测序。该类产品操作程序较多，作为产品使用说明书该项内容应当尽量详细，以能够指导用户进行操作，其中应当包括各步骤的注意事项及配合使用物品的技术参数、仪器厂家和型号（如PCR仪，生物分析仪等）和反应条件，以半导体测序为例：
8.1DNA提取：DNA提取方式，提取试剂盒货号或注册证号；DNA提取液的短期和长期保存方式，冻融次数等。
8.2文库构建：末端修复、接头连接、缺口修复、PCR扩增；所构建的文库短期和长期保存方式，冻融次数等。
8.3文库定量；描述对于定量后文库浓度和质量的要求，以及何种情况进行文库的重新构建。
8.4测序模板的制备：混合文库、PCR、模板富集。
9.【参考值】
明确设定参考区间所使用的算法及验证参考区间所使用的样本例数及类型。如使用软件，则应明确软件名称、唯一标识号、生产厂家及医疗器械注册证书编号；如暂未拿证，应空出相应内容，在软件名称后注明（医疗器械注册证书编号：）。
10.【检验方法的局限性】
10.1本试剂盒作为胎儿染色体非整倍体筛查检测，其结果仅供临床参考，不能作为诊断的唯一依据。对患者的临床诊断应采用金标准方法（染色体核型分析）并结合其症状/体征、病史及其他实验室检查等情况综合进行。该产品不能对胎儿染色体结构异常进行检测。
10.2本试剂盒适用于孕妇外周血血浆样本检测，不适用于其它样本检测。
10.4以下几种情况的孕妇样品可能会出现假阳性或假阴性结果，需要结合其他检测结果进行综合判断：
10.4.1孕妇本人为染色体非整倍体疾病患者、其他染色体疾病患者或携带者；
10.4.2胎儿染色体异常中的平衡易位，嵌合型三体异常会影响检测；
10.4.3怀有双胎或者多胎（三胎及三胎以上）的孕妇；
10.4.4近期接受过移植手术、干细胞治疗；近期接受过免疫治疗或输注过异体血制品；
10.4.5孕妇本人为肿瘤患者；
10.4.6通过体外受精-胚胎移植（IVF-ET）方式受孕的孕妇；
10.4.7体重严重超重的孕妇。
10.5样本采集、运输及处理不当、未按说明书操作均有可能导致假阳性或假阴性结果；描述在样本采集，保存、运输中需遵循的原则及注意事项，例如：
10.5.1只可使用EDTA抗凝采血管进行取样；
10.5.2颠倒混匀时动作应轻柔，防止溶血；
10.5.3全血离体后必须在8小时内进行血浆分离；
10.5.4血浆分离过程中注意不要吸到中间层的白细胞；
10.5.5血浆样本反复冻融次数应不超过2次；
10.5.6禁止将普通EDTA抗凝样本和血浆样本在室温状态下放置；
10.5.7血浆样本寄送采用干冰运输。
11.【产品性能指标】
按照分析性能评估资料内容详述以下性能指标：最低检出限、企业内部参考品符合率、微缺失微重复评价、嵌合体评价、精密度、干扰试验、特异性。各项评估应包括评估方法、数据和结果。应将临床评价的试验结果纳入。包括临床试验机构数量、样本例数、试验结果等内容。
（十）临床评价资料
1.研究方法
研究方法包括前瞻性研究也可纳入部分回顾性研究。前瞻性研究是指对临床需要正常进行产前诊断的孕妇采集样本与金标准检测进行对比分析；回顾性研究是指对临床研究单位样本库中已有金标准确认的样本进行重新检测，其结果与原金标准结果进行对比分析。
统计学分析一般选用交叉四格表的形式总结本试剂盒测序结果和金标准检测结果并进行卡方或kappa检验，与金标准比对进行敏感性、特异性分析，计算阳性预测值、阴性预测值。对于以上统计值，均应做统计假设，并报告95%置信区间。
2.临床研究机构及人员
临床研究机构应为已取得产前诊断技术服务资质的医疗机构，且为卫计委开展高通量基因测序产前筛查与诊断临床应用试点。人员应为经过专门培训的取得资质的人员。机构和人员应遵循《产前诊断技术管理办法》、《母婴保健专项技术服务许可及人员资格管理办法》，机构取得《母婴保健技术服务执业许可证》人员取得《母婴保健技术考核合格证书》。
3.适用人群及样本量
适用人群为孕龄12周以上（包含12周）的孕妇。样本量依据统计学及胎儿染色体三体发病率计算，根据其临床预期用于产前筛查的用途，建议总例数不少于10000例，除了选择前瞻性样本外，也可以包括回顾性样本。
前瞻性样本应至少为2000例，试验要求能够筛选出一定数量的T21阳性、至少5例的T18阳性、至少1例的T13阳性。全部10000例样本中，T21、T18、T13阳性例数应分别符合统计学意义，如其中前瞻性样本未筛查出符合要求的阳性病例数量，则应继续增加样本例数进行筛查。无论是前瞻性还是回顾性样本，均应可以溯源。
4.其他要求：
对于临床试验中可能会出现用于核型分析的细胞培养不出导致金标准检测数据缺失的情况：
4.2核型分析属于有创检测，如孕妇拒绝再次穿刺导致的金标准数据失访，可接受的失访率应控制在≤5%，且失访数据应说明原因。另外，临床试验结果的客观内容（包括失访率等）建议在产品说明书中明示。
5.临床试验方案
5.1.1各临床研究机构的方案应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。临床试验方案的修改过程和版本要记录在案，且每次改动应记录原因。
5.1.2整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。如有特殊事项，应向国家食品药品监督管理总局医疗器械注册管理司提出申请。
5.2临床试验方案还应详细阐述如下内容：
5.2.1临床研究单位选择、临床主要研究人员简介；对临床试验的整体管理情况、质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行的规定；
5.2.2临床背景、病例纳入/排除标准、样本的预期选择例数及标准。其中须注意，病例纳入/排除标准应严格制定并实施，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性，对于编盲的方式应有详细描述；
5.2.3样本类型，样本的收集、处理及保存等；
5.2.4数据预处理、统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。
6.临床试验报告：
临床实验报告包括各机构的临床试验报告以及临床总结报告。根据《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求，临床试验报告应该与方案呼应并相一致，对方案执行情况及试验结果进行详述：
6.1样本例数（总结报告应为各机构的样本例数、阳性检出例数等）、孕妇年龄分布情况、建议以列表方式给出具体例数及百分比。
6.2对检测精密度、质控品测量值的抽查结果评估。
6.3具体试验过程，及试验过程中需要说明的问题，研究过程中是否涉及对方案的修改。
6.4申报试剂批号、有效期及所用机型等信息，配合使用的试剂、耗材及仪器的厂商信息、货号及产品医疗器械注册证书号。强调：临床试验研究应使用与说明书描述一致的配套使用试剂及仪器。
6.5统计学分析：数据预处理、差异数据的重新检测与否以及最终是否纳入数据统计、对异常值或缺失值的处理。另外考虑到对不同年龄段孕妇样本的阳性检出率可能存在一定差异，故建议对不同年龄段孕妇样本分别进行统计分析。
6.6讨论和结论：对总体结果进行总结性描述并分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。
7.上市后需完成的工作
上市后需继续搜集至少10家临床机构、总数不少于10万例临床使用数据作为临床补充资料在产品下一次延续注册时提交，并使用该试剂检测的全部结果（包括阴性、阳性）与卫生主管部门关于胎儿染色体产前诊断技术标准以羊水穿刺核型分析和出生随访结果作为金标准进行对照。对于出现在灰区的样本（Z值临界值区域）应进行分析总结。该项临床资料应当由出具数据各临床机构主管部门签章。此外，申请人还应总结上市期间假阳性和假阴性的例数和并详细分析产生原因。
附件2：《胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒:（高通量测序法）技术审查指导原则》（征求意见稿）意见征集表
填写要求：征集资料的内容包括企业信息（境内生产企业见表1、境外生产企业见表2）及意见内容（见表3），企业需按照表3要求反馈意见，并具体阐述提出意见的理由及相应的依据。征集意见信息统一以word文档通过电子邮件方式报送，格式如下：