本发明涉及发光细菌的综合毒性检测方法领域，具体涉及一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法。
背景技术：
土壤作为人类赖以生存的场所，含有多种污染物，如持久性有机污染物与农药、挥发性有机物和多环芳烃类有机物等。每种污染物不仅有各自的毒性，而且各种污染物质混合、相互作用也会产生潜在的毒性。现有检测技术多局限于检测单一污染物毒性，无法测定污染物的复合污染效应。因此，开展土壤的综合毒性检测工作有重要意义。
我国是农业大国，建立准确可靠、灵敏度高和符合国际标准的农田土壤污染物检测技术，从整体上提高我国农业产地环境中污染物综合毒性检测能力，为我国农产品的种植以及农田土壤的修复提供重要的理论依据以及指导意见，保证农产品的质量安全和避免国际间的贸易争端，具有非常重要的理论和实践意义。
技术实现要素：
技术方案：一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一.对土壤样品进行预处理：在待检测土壤区域中采用随机多点取样法选取采样点，采集耕层土壤内的土样后，将土样混合均匀，置于土壤袋后在室温下阴凉处风干，去除植物残根，磨碎后于室温避光保存备用；
步骤二.样品的浸提：称取步骤一制备的土样，过尼龙筛后用甲醇索氏提取，减压旋转蒸发浓缩，加入乙二醇后将该混合物继续浓缩备用；
步骤三.浸提液的毒性检测：取培养后的发光细菌培养液，加入步骤二制备的样品浸提液、15wt.％nacl溶液和纯净水，混匀后静置，测定发光强度；
步骤四.样品毒性的表达：测量步骤三静置后混合液的发光抑制率、氯化汞当量浓度。
作为优选，所述步骤一选取5个采样点。
作为优选，所述步骤二中称取3～5g步骤一制备的土样，过2mm尼龙筛后用甲醇索氏提取16h，减压旋转蒸发浓缩至5ml，加入3～5ml乙二醇，然后将混合物继续浓缩至5ml备用。
作为优选，所述步骤三中发光细菌为明亮发光杆菌t3。
作为优选，所述步骤三培养后的发光细菌培养液、样品浸提液、15wt.％nacl溶液和纯净水的体积比为1：2：4：13。
作为优选，所述步骤三取50μl培养后的发光细菌培养液，加入100μl样品浸提液、200μl15wt.％nacl和650μl纯净水。
作为优选，所述步骤三中培养后的发光细菌培养液的制备过程如下：取培养基含酵母浸出液0.5g、胰蛋白胨0.5g、甘油0.3g、nacl3g、na2hpo40.5g、kh2po40.5g和蒸馏水100ml混合均匀，调节ph值至6.5～7.0；第一代斜面菌种在20℃温度下培养24h后，立即接入第二代斜面培养12h后备用；将上述菌龄满12h的新鲜斜面菌体接入盛有50ml培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20℃、210r/min振荡培养，每2h测定1次培养液发光强度。
作为优选，所述步骤三中取培养16～18h后的发光细菌培养液。
作为优选，所述步骤三中混匀后静置15min。
作为优选，所述步骤四中通过dxy-2型生物毒性测试仪检测浸提液对发光细菌的发光抑制率。
2.选择甲醇/乙二醇作为浸提液对样品中的毒性物质进行浸提，先用对毒性物质具有很好浸提效果的甲醇对样品液进行浸提。由于，甲醇对发光细菌具有强毒性，因此无法对毒性物质提取液直接进行发光度检测。需要再用对发光细菌低毒的乙二醇对毒性物质进行萃取，然后用乙二醇最终提取液进行发光度检测。
附图说明
图1为本发明所述检测方法流程图；
图2为实施例1所述土壤样品综合毒性检测结果柱状图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，参照图1，所述方法包括以下步骤：
(2)样品的浸提：称5.0g土样，过2mm尼龙筛。用甲醇索氏提取16h，用其对污染土壤进行提取后，再在提取物中加入对发光细菌低毒的乙二醇，然后通过旋转蒸发去除甲醇，以获得土壤甲醇提取物的乙二醇溶液，浸提出土壤样品中的毒性物质。对照处理用水代替乙二醇，其余条件不变。
由于土壤中的污染物多为不溶于水的物质，因此本发明利用有机溶剂对毒性物质进行抽提。以蒸馏水为对照，分别测定了甲醇、乙二醇、二氯甲烷对发光细菌的生物毒性。结果参照表1，甲醇对发光细菌具有强毒性，而乙二醇的毒性较小。但甲醇对土壤中毒性物质的抽提效率较乙二醇高，因此本发明首先采用甲醇对土壤进行抽提，然后在甲醇提取物中加入对发光细菌低毒的乙二醇，最后通过旋转蒸发去除甲醇，以获得土壤甲醇提取物的乙二醇溶液作为土壤生物测定所需的最终浸提液。
表1不同有机溶剂对明亮发光杆菌t3发光强度的影响
(3)浸提液的毒性检测:利用发光细菌法测定污染物生物毒性时可选用发光细菌冻干粉或新鲜细菌培养液。但由于发光细菌冻干粉价格昂贵(进口冻干粉约为50美元/支)，因此本实施例使用发光细菌的新鲜培养液。发光细菌培养液制备如下：取培养基含酵母浸出液0.5g、胰蛋白胨0.5g、甘油0.3g、nacl3g、na2hpo40.5g、kh2po40.5g和蒸馏水100ml混合均匀，调节ph值至6.5～7.0。第一代斜面菌种20℃培养24h后，立即接第二代斜面培养12h备用。将上述菌龄满12h的新鲜斜面菌体接入盛有50ml培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20℃、210r/min振荡培养，每2h测定1次培养液发光强度。具体测定方法为，取50μl培养液，加入200μl15wt.％nacl、750μl纯净水，混匀放置15min，利用dxy-2型生物毒性测试仪测定发光强度。
在本实施例培养条件下，发光细菌在前10h的培养阶段处于延滞期，不发光。进入对数生长期后发光强度迅速增加，培养20h时其发光强度趋于稳定。因此本试验采用培养16～18h的新鲜菌液进行毒性试验。
取50μl培养16h的发光细菌培养液，加入100μl样品浸提液、200μl15wt.％nacl和650μl纯净水，混匀后静置15min，利用dxy-2型生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值。
(4)样品毒性的表达：发光抑制率＝(对照组发光强度-样品发光强度)/对照组强度×100％，通过发光抑制率，来表征土壤的综合毒性水平。发光抑制率越大，样品浸提液的毒性越大，发光抑制率越小，样品浸提液的毒性越小。样品的发光抑制率与毒性级别关系见表2。
表2样品的发光抑制率与毒性级别关系
根据步骤(3)测定的发光强度，计算出3次平行测定的发光抑制率，计算结果参照图2，三次测定结果分别为21.8％、25.5％和25.6％，其最终的发光抑制率测定结果为24.3％，毒性等级为ⅰ级，毒性级别为微毒。