2.1有机溶剂/去污剂病毒（S/D）灭活法
过去，人们发现甲肝病毒能通过消化道传播，乙肝病毒通常不能通过消化道传播，但是在胆汁分泌障碍人群体内，乙肝病毒能通过消化道传播的概率较高。后来，科学研究发现，这与胆汁能溶解乙肝病毒的脂包膜有关。根据以上原理，通过研究和临床观察发现，使用Triton-X45这类的非离子型表面活性剂（去污剂）和磷酸三丁酯（有机溶剂）能够有效破坏类似乙肝病毒的类脂膜：类脂从病毒表面脱落，使病毒失去黏附和感染细胞的能力，从而达到灭活病毒的效果，且对蛋白质分子的结构的影响也非常小[4]。这种方法就是有机溶剂/去污剂病毒（S/D）灭活法。
因S/D法具有较高病毒去除作用、蛋白相容性高、易于插入到现有或新开发的纯化工艺中等优点[16]，人们便将这种灭毒方法用于血浆、血液制品和生物制品[8,17,18,19]。S/D法作为血浆病原体灭活技术，是最早得到医疗界的认可，并投入临床中的。因为S/D法满足了以下三点：①能完全有效灭活胞内、胞外病原体及附着在细胞上的病原体；②所选试剂能选择性地进入细胞且不损伤细胞；③经处理后的红细胞不产生新抗原或者抗体，对人体无害。因为S/D病毒灭活处理对多种不同的包膜病毒都能发挥有效的病毒灭活作用,且有良好的临床安全性，因此其通过美国FDA许可,以用于浓缩的人血液Ⅷ因子的病毒灭活,并已广泛用于生物制品的生产[9,10,11,12]。
在使用S/D法时需要注意：①待灭活的制品中，可能存在颗粒性物质会将病毒包裹其中，这会使S/D试剂无法接触到病毒。因此，需要对制品事先进行1μm或更高的精度的过滤以避免这种风险。②加入S/D后制品应充分混匀，如果加入S/D后再进行过滤，应确保过滤后S/D浓度仍在有效范围内。③S/D试剂要能够与混合容器内每一滴制品接触（特别是罐壁、灌顶上附着的制品可能在灭活工艺结束后又滴入罐内），因此通常是将加入S/D后的制品混合均匀后，泵入另外的容器内恒温，执行灭活程序。④病毒灭活间与后面的生产工序间需要分开，以免造成交叉污染。
S/D法缺点也比较明显：这种灭活方法仅对脂包膜病毒有效，对于非脂包膜病毒无任何效果。而且，虽然S/D法现在被广泛应用于临床，但也存在基因毒性、处理物及其衍生物残留﹑灭活后部分凝血因子减低等问题。
2.2低pH孵放技术
低pH孵放法，是一种化学病毒去除/灭活技术，常用于单克隆抗体的病毒灭活工艺。其原理是利用病毒表面抗原在低pH值的条件下，电荷会发生改变，蛋白质的空间结构也会发生不可逆的改变，从而使病毒丧失侵染细胞的能力。简单来说，低pH孵放法是破坏病毒包膜的完整性、阻断病毒与宿主受体结合的途径，使病毒无法感染宿主细胞，起到灭活病毒的作用[20,21,22,23]。
低pH孵放法虽然因其操作过程简单、病毒灭活效果好，成为重组蛋白药物纯化工艺中常用的关键步骤，但低pH环境容易使重组蛋白不稳定，产生聚体、降解等质量问题。相比较而言，由于抗体类免疫球蛋白在低pH环境普遍表现更加稳定，因此低pH孵放法主要应用在IgG类产品。另外，低pH孵放法具有方法简单、经济实惠、容易操作等特点，已被用于伪狂犬病毒、猪细小病毒、流感病毒等病毒的灭活[5,6]。
2.3纳米膜过滤技术
纳米膜过滤技术是一种通过孔径大小过滤来滤除病毒的技术，多用于血液制品和生物制品中的病毒去除，其可以有效去除非脂包膜病毒。作为生物制品净化过程中最常用的技术之一，其目的是达到有效的净化效果，保证生物制品的安全[25]。得益于生物治疗产品如单克隆抗体、干细胞产品、血液成分、生物制剂和疫苗不断增长的需求，未来几年全球病毒过滤市场预计呈现增长的趋势。
为了判断生产工艺的影响，需要使用模拟实际工艺的缩小模型进行病毒去除试验。如果生产工艺中有压力释放过程的话，做病毒验证实验方案时要考虑这一因素。实际生产过程中的流路一般会有阀门，在模拟时可以使用旋塞来代替阀门，尽可能使用试验流路接近实际的生产环境。如果观察到病毒漏出，可以通过改变过滤条件来降低或消除风险。压力释放的影响取决于具体情况，应设想在预想不到的压力释放的情况下，是继续过滤，还是更换滤膜，针对不同的蛋白提前采取对应措施是有意义的。
2.4紫外灯照射法
紫外灯杀毒法的主要仪器是紫外线杀菌灯。紫外线杀菌灯通常也被称为紫外线消毒灯或紫外线荧光灯，是一种利用紫外线的杀菌作用进行灭菌消毒的灯具。紫外线杀菌灯消毒原理主要是在特定的波长范围（灯波长为200~275nm,杀菌作用最强的波段是250~270nm）以及足够高的剂量下，通过辐射损伤和破坏微生物的核酸功能来杀灭微生物等病原体[26]。具体来说，是紫外线对核酸的作用引起细菌和病毒等微生物细胞中DNA或RNA相邻嘧啶分子间形成异常的化学键，从而阻碍DNA或RNA的复制，而且在紫外线灯杀菌的过程中还会产生臭氧，臭氧本身就能从外而内的逐步破坏病毒结构，从而造成微生物细胞死亡，以达到消毒的目的[13,14,15]。
紫外线消毒具有性能稳定、使用维护便捷、运行成本低、对环境友好等优点,但是紫外线穿透能力弱，仅对直接照射的物体表面有消毒作用,所以消毒处方时应保证每张处方的正反两面均受到照射。另外，紫外线可对皮肤黏膜造成损害,因此使用时应避免直接照射到人[14,15]。
紫外线灯在使用过程中会产生臭氧。臭氧的浓度过高会使人产生头晕、恶心等症状，甚至会引发呼吸道的病变。而长期错误使用紫外线灯会对人眼睛产生危害：诱发结膜、角膜等疾病，严重的甚至会影响视力。不仅如此，如果长期照射到皮肤上，轻者会出现红肿、瘙痒等症，重者甚至会引发皮肤癌[14,15]。
3.小结
当前广泛使用的病毒灭活方法有S/D法、低pH孵放法、膜过滤法、紫外法等，本文也对这些方法进行了一些介绍。虽然每种病毒灭活方法都可以灭活常见的病毒，但每种方法都有其局限性。国内IND申报时，一般选择低pH和膜过滤这两个工艺。国外进行申报时，除了选择低pH和膜过滤这两个工艺，还需进行层析工艺（层析法最常用的是亲和层析和离子交换层析。层析法是目前常用的样品不同组分分离技术，利用各组分与固定相亲和力的差异或相互作用不同的原理，实现病毒与样品分离的目的）。
去除/灭活病毒的理想方法有2个特性：①可以部分去除病毒或者破坏病毒的活性和结构。②维持生物制品的生物活性、理化性质。
当掌握对某种病毒的精准去除/灭活或能够对产品中所有的病毒进行去除/灭活，并保证产品功能性质完整时，消毒后的产品才能具有效益和继续增加效益。