①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG抗体，不作考虑）。
一抗类别或亚类
二抗
IgM
抗IgM
IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3
抗IgG、抗IgG1、抗IgG2a、抗IgG2b、抗IgG3
未知
抗IgG
②某些组织或细胞含有较多的Fc受体，如脾脏、淋巴细胞等，此时二抗需要选择抗IgGF(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体
WesternBlot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。内参即内部参照（InternalControl），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(HousekeepingProteins)。此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
内参使用方法
1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
2.普通内参：当靶蛋白分子量与所选内参分子量相差不大时，可先对靶蛋白进行显色检测，然后用Strip缓冲液洗掉膜上抗体，重新对内参蛋白进行显色检测。当靶蛋白分子量与所选内参分子量相差较明显时，可对转膜预染，根据蛋白质分子量将膜剪为两部分并分开进行靶蛋白和内参蛋白的显色检测。
内参抗体选择
常用的蛋白内参有GAPDH和β-actin或β-tubulin，内参的选择原则是选择与靶蛋白分子量相差5KD以上的内参，对不同的样本则需要根据实际情况进行选择。
1.根据物种选择
2.根据组织类型选择
以肌动蛋白actin为例，肌动蛋白actin在不同物种之间高度保守，且同一物种不同类型actin的序列相似性大于90%，使其很难获得特异性较好的抗actin抗血清。但同一物种不同类型actin的N段序列相似性仅50~60%，故N端序列常被用来制备抗actin的抗体。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌、横纹肌细胞和平滑肌细胞中，γ型分布于平滑肌细胞和非肌细胞中，β型分布于非肌细胞中，共六种actin蛋白。不同厂商生产抗β-actin抗体过程中选择的免疫区段在不同型actin之间的保守与否影响到抗体的组织特异性。选用β-actinN端的16个氨基酸序列制备的单多抗占大多数，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用β-actinC端16个氨基酸序列制备的抗体则可以在肌肉细胞中检测到actin的信号。
3.根据蛋白组分选择
提取细胞蛋白组分过程中，胞浆蛋白通常是最先提取出来的。离心全细胞裂解液所得的上清含胞浆蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，继续加大裂解程度即可提取到胞核蛋白，最后才能提取到胞膜蛋白。通过特殊的方法还可以从胞浆蛋白中提取到线粒体蛋白、叶绿体蛋白等。针对不同的细胞组分需要选择不同的内参抗体。
类目
内参
观测分子量
细胞总蛋白
GAPDH
36kDa
β-actin
42kDa
β-tubulin
55kDa
胞膜蛋白
Na+/K+-ATPase
100kDa
Integrin
90-160kDa
胞浆蛋白
caveolin-1
20-24kDa
Actin
Tubulin
50kDa
线粒体蛋白
VDAC1
35-37kDa
COXIV
17kDa
胞核蛋白
LaminA
65kDa,70kDa
LaminB
66-70kDa
HistoneH3
18kDa
PCNA
laminA/C
74kDa
Caveolin
TATAbindingprotein
鼠源：33-36kDa
人源：37-43kDa
Pax-5
45kDa
Rb
110kDa
c-Jun
43kDa,48kDa
c-Fos
62kDa
nucleoporinp62
61kDa
在选择细胞总蛋白内参时，GAPDH、β-actin、tubulin三种内参同时发生变化的情况很少。如出现这种情况，可用胞核内参甚至线粒体内参代替。另外，不同的实验目的应选择不同的内参，例如检验质核分离效果应选择胞浆蛋白内参actin，抽提的核组分中检测不到actin则表示质核分离效果较好。