-提示感染细胞膜脂动力学成为抗病毒靶点-
艾滋病病毒蛋白Gag重组富集脂质微域—
细胞膜是包围细胞的最外层的膜，由蛋白质和脂质构成。细胞膜采用由外层和内层构成的脂双层结构，但其构成脂在外层和内层有很大的不同。外层的主要构成脂质是鞘磷脂。鞘磷脂对胆固醇有很高的亲和力，共同形成脂质微域。众所周知，脂质微域在各种生理功能和感染病情中具有重要作用，但其在细胞膜中的分布仍有许多不清楚的地方。人类免疫缺陷病毒HIV-1是艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)的致病病毒。截止到2022年，全世界共有3,900万人感染)，是对公众健康的威胁。因此，迫切需要阐明HIV-1的感染复制机制，并将其应用于制药治疗。HIV-1感染细胞后，在复制周期后期病毒的结构蛋白Gag在细胞膜内层形成多聚体[4]结构。这个多聚体结构成为支架，在此基础上组装病毒的构成成分，新的病毒粒子从细胞膜出芽。出芽时，新的病毒粒子将感染细胞的细胞膜脂质作为覆盖自身的包膜获得(图1)。
图1以1HIV-1Gag为立足点释放新病毒粒子的结构
HIV-1感染细胞后，Gag蛋白在感染细胞的细胞膜内层多聚化，形成新病毒粒子出芽释放的支架。
本研究在HIV-1Gag在细胞膜内层多聚化至出芽的过程中，需要对细胞膜外层脂质微域的分布动态进行可视化定量。通常病毒粒子的形成除了病毒基因组以外还需要来自病毒的蛋白质。另一方面，众所周知，如果在细胞内只表达Gag蛋白，就能产生不具有感染性和复制功能的病毒样粒子VLP(Virus-likeparticle)，本研究也使用了该实验系统。另外，为了可视化细胞膜外层的脂质或脂质微域，我们使用了对富含鞘磷脂的脂质微域特异性的探针(结合蛋白质)NT-Lys和对富含胆固醇的脂质微域特异性的探针D4。病毒的尺寸为直径100~150纳米(nm、1nm为10亿分之一米)，脂质微域的尺寸为直径5~50nm，在通常的荧光显微镜的分辨率极限(约250nm)以下，因此在这些结构的观察测量中具有超分辨率如果在培养细胞中暂时过剩表达Gag蛋白质，24小时后到达细胞膜，观察到直径约100nm的Gag集聚的结构。在该细胞的培养基中加入荧光标记的NT-Lys或D4，即可荧光标记细胞膜外层的脂质微域(图2)。
图2细胞膜外层脂微域和内层Gag蛋白可视化
鞘磷脂、富含胆固醇的脂质微域分别用融合荧光蛋白的NT-Lys、D4从外侧标记。另一方面，内层的Gag蛋白质通过在细胞内表达融合了荧光蛋白质的Gag蛋白质而可视化。左边是标识的示意图，右边是荧光显微镜图像。
通过超分辨显微镜的测量，发现Gag蛋白质隔着细胞膜与鞘磷脂或者富含胆固醇的脂质微域同程度地共存。另外，发现该共定位依赖于Gag多聚体的形成而增加。富含鞘磷脂的脂质微域大小通过表达Gag蛋白而增加，而富含胆固醇的脂质微域大小没有改变。这些结果意味着Gag蛋白会聚集富含鞘磷脂的脂质微域，形成较大的结构域(图3)。
图3Gag蛋白引起的富含鞘磷脂的脂质微域大小变化
Gag蛋白的表达显著增加了脂质微域的大小，但在不能形成多聚体的突变体(Gag-WM)中未见变化。数值为微域直径的平均值±误差。
然后，我们测量了脂质微域的动态，验证了Gag蛋白的效果。结果表明，Gag蛋白能抑制富含鞘磷脂的脂质微域的运动。研究还表明，无论有无Gag蛋白，富含胆固醇的脂质微域总是被抑制活动。另外，为了评价Gag蛋白对两个不同脂质微域的相对分布动态的效果，利用FLIM-FRET测量了两个探针之间的距离构成比率。结果表明，Gag蛋白使两种脂质微域相近。以上结果提示，Gag蛋白首先在细胞膜内层到达鞘磷脂或富含胆固醇的脂质微域的背面，然后捕获邻近富含鞘磷脂的脂质微域形成较大的脂质域。于是，最终可以产生包膜中含有鞘磷脂、富含胆固醇的膜的病毒粒子。最后验证了Gag蛋白多聚化时形成的膜曲率对脂质微域重组的影响。Gag蛋白突变体中，膜曲率小的突变体P99A和EE形成平的多聚体，膜曲率大的突变体l表现出出芽的VLP不与细胞膜分离，VLP与膜相连的表现型。通过FLIM-FRET测量调查了细胞膜脂微域对这些突变体的分布，结果显示，不能形成膜曲率的P99A、EE与不表达Gag蛋白的样品，膜曲率大的l与野生型Gag蛋白显示了同样的模式(图4)该结果表明，膜曲率在接近、重组膜曲率富含鞘磷脂的脂质结构域和富含胆固醇的脂质结构域中起着作用。
图4脂微域对不同膜曲率Gag蛋白突变体的相互作用
标记富含鞘磷脂的脂质微域的EGFP-NT-Lys的荧光寿命因附近存在标记富含胆固醇的脂质微域的mCherry-D4而缩短。利用这一性质，可以根据荧光寿命的不同调查两者的接近程度。橙色的点相当于显微镜图像的各像素，每个像素中具有平均荧光寿命t1(纵轴)的脂质微域存在的比例(横轴)以曲线表示。无Gag蛋白时(DA)可见两种分布，但表达Gag蛋白野生型(WT)或l时荧光寿命t1短分布的比例增加。也就是说，可以看出两个脂质微域很接近。另一方面，表达P99A和EE后，显示出与没有Gag蛋白时和不能多重化的突变体WM同样的分布模式。这表明膜曲率对使两个不同的脂质微域接近很重要。
理化研究所开拓研究总部佐甲细胞信息研究室主任研究员佐甲靖志客座主管研究员小林俊秀(斯特拉斯堡大学研究总监)斯特拉斯堡大学(法国)研究员富重齐生研究生MaazBinNasim(火星人)研究员(研究当时)村手源英(现理研脑神经科学研究中心电镜技术支援单元技师)技术人员BrigittePolletPascalDidier教授(帕斯卡尔迪迪)副教授JulienGodet(朱利安·戈德特)高级技官LudovicRichert(路德维希·理查德)教授YvesMély(伊夫玛丽)
本研究是由Agencenationalederecherchesurlesidaetleshépatitesvirale18365(研究代表者:小林俊秀)、Agencenationaledelarechercheaa20r417c(研究代表者)理研糖皮质激素计划(研究代表:佐甲靖志)的资助下进行的。
理化研究所开拓研究总部佐甲细胞信息研究室主任研究员佐甲靖志客座主管研究员小林俊秀