具有独特性：需要独特的实验室装备和独立的训练
技术包括：显微镜术和制片染色技术、无菌操作技术、消毒灭菌技术、纯种分离培养技术、合成培养基技术、选择性和鉴别性培养基技术、深层液体培养技术、厌氧培养技术、菌种保藏、复壮技术、菌种选育技术等。
第一章微生物的纯培养和显微技术
计划学时：2
重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等的形态特征。
大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pureculture）。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。
第一节微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptictechnique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1.微生物培养的常用器具及其灭菌
2.接种操作
用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。
接种①
用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，并使斜面向上成水平状态。右手拧松棉塞，但不要取下。
接种②
右手拿接种环（如握钢笔），在火焰上烧灼灭菌。注意：有可能伸入试管内的接种环其余部分也要烧灼，特别是箍处。
接种③
在火焰边用右手无名指和小指夹住两个棉塞，将它们取下（不能放下）。同时左腕转动，烧灼管口一周，勿烧得过烫。注意：不要将酒精灯碰翻，以免烧伤。
接种④
将接种环伸入试管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。然后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。
接种⑤
在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜面培养基的底部，由里向外轻轻划蛇形细线，线要划密一些。注意不要将培养基划破，也不要使接种环接触到管壁或管口
接种⑥
抽出接种环，再用火焰烧灼管口，并在火焰上方将棉塞塞上。将接种环在火焰上烧红灭菌，接种致病菌时更要注意这点。将棉塞旋紧。注意：棉塞与火焰的距离要适当，以免棉塞燃烧。
二、用固体培养基分离纯培养
由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
4.稀释摇管法（dilutionshakeculturemethod）
用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式*。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。
对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。
通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。
对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。
1.利用选择平板进行直接分离
主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。
2.富集培养
富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。
六、二元培养物
分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难作到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。
在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。
七、微生物的保藏技术
1.传代培养保藏
由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在一般情况下，在实验室里除了采用传代法对常用的菌种进行保存外，还必须根据条件采用其它方法，特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此。
2.冷冻保藏
将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生物都能通过冷冻进行保存，细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5mol/L左右的甘油或二甲亚枫可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）虽不能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。
一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮保藏可达到—196℃。因此，从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看，该方法在迄今使用的各种微生物保藏方法中是较理想的一种。但液氮保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰箱保藏使用更为普遍。例如在各种基因工程手册中，一般都推荐在—70℃低温冰箱中保存菌株或细胞的某些特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如经诱导建立了感受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下，也可利用—20~30℃的普通冰箱保存菌种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内，常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结晶，而对菌体形成强烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种。
3.干燥保藏法
水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。
冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安瓿管的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌种保藏机构均采用此法作为主要的微生物保存手段。
除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜
对任何显微镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：
光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜配备有特殊的光学装置——环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构，是显微技术的一大突破，为此，其发明人F.Zernike获得了1953年的诺贝尔奖。
有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分为光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。
5.透射电子显微镜
由于显微镜的分辨率取决于所用光的波长，人们从本世纪初开始就尝试用波长更短的电磁波取代可见光来放大成像，以制造分辨本领更高的显微镜。1933年，德国人E.Ruska制成了世界上第一台以电子作为“光源”的显微镜----电子显微镜。其理论依据是：电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005nm，所以电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜（图2-10）。几十年来，电子显微技术发展很快，应用也日益广泛，对包括微生物学在内的许多学科的进步都起了巨大的推动作用。
6.扫描电子显微镜
扫描电子显微镜（ScanningElectronMicroscopeSEM）与光学显微镜和透射电镜不同，它的工作原理类似于电视或电传真照片。电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束扫到的地方就可激发样品表面放出二次电子（同时也有一些其它信号）。二次电子产生的多少与电子束入射角度有关，也即是与样品表面的立体形貌有关。与此同时，在观察用的荧光屏上另一个电子束也做同步的扫描。二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管和放大器又变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品上产生二次电子多的地方，在荧光屏上相应的部位就越亮，我们就能得到一幅放大的样品立体图像。
7.扫描隧道显微镜
在光学显微镜和电子显微镜的结构和性能得到不断完善的同时，基于其它各种原理的显微镜也不断问世，使人们认识微观世界的能力和手段得到不断提高，其中80年代才出现的扫描隧道显微镜（ScanningTunnelingMicroscope，STM）是显微镜领域的新成员，主要原理是利用了量子力学中的隧道效应。
近年来,在STM的基础上又发展出了另一种扫描探针式显微镜，原子力显微镜（AtomicForceMicroscope，AFM）。AFM也是利用细小的探针对样品表面进行恒定高度的扫描来对样品进行“观察”，但它不是通过隧道电流，而是通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面形貌的信息，因此，与STM不同，AFM可以用于对不具导电性，或导电能力较差的样品进行观察。
扫描隧道显微镜(图)
8.原子力显微镜
小结：微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的二个最重要的因素。它们与显微镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。
作业：
简述显微镜的种类、各种显微镜的性能及其在微生物学中的使用特点。
二、显微观察样品的制备
样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。一般来说，在利用显微镜观察、研究生物样品时，除要根据所用显微镜使用的特点采用合适的制样方法外，还应考虑生物样品的特点，尽可能地使被观察样品的生理结构保持稳定，并通过各种手段提高其反差。
1.光学显微镜的制样
光学显微镜是微生物学研究的最常用工具，有活体直接观察和染色观察二种基本使用方法。
(1)活体观察
可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗视野或相差显微镜下对微生物活体进行直接观察。其特点是可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性及生长过程中的形态变化如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程。
①压滴法（水浸片法）：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察；
②悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹玻载片上后进行显微镜观察。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林；
③菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。
插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
(2)染色观察
一般微生物菌体小而无色透明，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率与其背景相差很小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时，只能看到其大体形态和运动情况。若要在光学显微镜下观察其细致形态和主要结构，一般都需要对它们进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观察样品不同部位的反差。
染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化学固定二种方法。固定时应注意尽量保持细胞原有形态，防止细胞膨胀和收缩。而染色则根据方法和染料等的不同可分为很多种类，如细菌的染色，可简单概括如下：
A．死菌染色法
①正染色：简单染色法
鉴别性染色法（复杂染色）：革兰氏染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法、抗酸性染色法等
②负染色（反衬法）：荚膜染色法等
B．活菌染色法：用美蓝或氯化三苯基四氮唑（TTC）等作活菌染色
实验一细菌形态观察及单染色
一、实验目的
1.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
3.巩固显微镜(油镜)的使用方法。
4.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。
三、试剂与器材
1.材料大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
2.试剂吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。
3.器材显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。
四、实验内容
简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
五、关键步骤及注意事项
1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。
六、思考题
1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节
2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察
实验二革兰氏染色及芽孢染色
1.了解革兰氏染色法和芽孢染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
4.学习显微镜(油镜)的使用方法。
5.初步认识细菌的形态特征。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。
芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
1.材料：枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物
2.试剂革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95％乙醇、番红液)。5％孔雀绿水溶液
3.实验器材小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。
1.革兰氏染色法制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检。
2.Schaefer-Fulton氏染色法制片→染色→水洗→复染→水洗→镜检。
1.你认为要得到正确的改良的革兰氏染色结果必须注意哪些操作关键在哪一步为什么
2.现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。
3.你的染色结果是否正确如果不正确，请说明原因。
4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因
5.说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢
1.了解放线菌、霉菌形态观察的原理。
2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。
3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。
霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。
1.材料黑曲霉、青霉和根霉，细黄链霉菌或青色链霉菌，灭菌的高氏I号琼脂和灭菌的查氏培养基。
2.实验器材经灭菌的：平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等。
倒平板→接种→插片→培养→镜检
1.倒平板要厚一些，接种时划线要密。
2.插片时要有一定角度并与划线垂直。
3.观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。
4.如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。
1.镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝
2.你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？
1.观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。
2.学习鉴别死活细胞的实验方法。
酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水-碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
1.材料酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomycescalsbergensis)培养2天左右的麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。
2.试剂0.05％和O.1％吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。
3.器材显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。
1.美蓝浸片观察酵母培养→制片→染色→镜检→30分钟后再镜检
2.水-碘浸片观察
1.染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。
2.用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。
2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌
小结
1从混合在一起的微生物群体中得到特定的某一种微生物的纯培养，是研究和利用微生物的最重要的环节之一。无菌操作技术是微生物学的重要技术，而且广泛地被其它学科和生产实际所利用。
2通过稀释或划线等手段，在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯种分离手段。
3传代培养、干燥保藏、冷冻保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。
4微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的二个最重要的因素。它们与显微镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。
5在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物的重要依据之一。
微生物培养法
一、从历史发展的角度来分析，微生物培养技术的发展主要有这样几个特点：
1、从少量培养发展到大规模培养；
2、从浅层培养发展到厚层（固体）或深层（液体）培养；
3、从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；
4、从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；
5、从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；
6、从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；
7、从单纯利用微生物细胞到大量培养利用高等动、植物细胞；
8、从单纯发酵发展到混菌发酵（程序序列式发酵）；
9、从利用野生菌种发展到利用优选菌株以及“工程菌”，等等。
二、微生物培养条件
一个良好的培养装置，应在提供丰富而均匀的营养物质的基础上，能保证微生物获得适宜的温度和绝大多数微生物所必需的良好通气条件（厌氧菌例外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌污染等。
培养基
培养基(medium)培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。任何培养基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营养元素的要求又有很大差异。目前已使用的各种培养基都是前人经过反复实践，比较设计的成果。
培养基的基本成分
能源、碳源：自养微生物以二氧化碳为碳源，光或无机物为能源，在无机物组成的培养基中生长。例如化能自养型的氧化硫杆菌培养基中，加入粉末状硫为能源，以空气中的CO2为碳源。异养微生物以有机物为碳源和能源，培养基中常需加入葡萄糖、蔗糖或麦芽糖、乳糖等单糖或双糖，有的可利用淀粉、纤维素等多糖，或利用动物组织中的糖类。例如培养细菌常用的牛肉膏蛋白胨培养基，其中牛肉膏即为主要碳源和能源。(培养基配方见后，下同)。
氮源：自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等为氮素营养，例如氧化硫杆菌以(NH4)2SO4为氮源；异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮有机物为氮源。自生固氮菌利用空气中的N2为氮素营养，其培养基中无须加入氮源，称为无氮培养基。
矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，常由酵母膏、肝浸出液等提供。许多天然成分的原料如牛肉膏、麦芽汁、玉米粉、豆芽汁等，含有各种无机元素和生长因子，不需另外添加。
合成培养基：由化学成分已知的有机物和无机物配制而成。成分精确，重复性强。但营养局限，微生物生长缓慢。适用于菌种分离、选育、遗传分析及生物测定等。如培养放线菌的高氏培养基、培养霉菌的察氏培养基以及各种化能自养菌培养基等。
半合成培养基：由某些天然物质与少量已知成分的化学物质配制而成。营养全面，能有效地满足微生物对营养的需求。广泛应用于微生物的培养。如培养细菌用的牛肉膏蛋白胨培养基，培养霉菌的土豆葡萄糖培养基，工业生产中常用的玉米粉等天然物质加无机盐配制的各种发酵培养基等。
天然培养基：由化学成分不清楚或不衡定的天然有机物配制而成。成分复杂，但营养丰富全面。常用于实验研究和生产。如麦芽汁培养基、玉米粉培养基，以及生产中使用的麸皮、锯末等。
根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。
液体培养基：用各种营养成分加水配成，或用天然物质的浸汁(麦芽汁、豆芽汁等)制成。组分均一，适宜各类微生物的营养生长。广泛应用于实验研究及大规模工业生产中，有利于广泛获得大量菌体或代谢产物。
固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂，或用麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98℃，凝固点42℃，1.5～2％的水溶液在一般培养温度下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生物的分离培养、菌种鉴定和保藏。
半固体培养基：液体培养基中加入0.2～0.5％琼脂制成。用于观察细菌的运动、菌种鉴定及测定噬菌体的效价等。
根据培养基的用途，可分为选择培养基、鉴别培养基、加富培养基、基本培养基等。
选择培养基：根据某一类或某种微生物的特殊营养要求而设计的培养基，用于提高所需微生物的分离效率。如分离固氮微生物的无氮培养基、加入滤纸条或纤维素粉为碳源分离纤维分解菌的培养基。在培养基中加入某种化合物，可有效地分离出对这种化合物有抗性的微生物，例如在放线菌培养基中加入数滴10％的酚，可抑制细菌和霉菌的生长；加入一定量的青霉素、链霉素，可抑制细菌生长等。
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂，通过显色反应以鉴别不同的微生物。例如检查乳制品和饮用水中是否有肠道细菌污染所用的伊红-美蓝培养基。当大肠杆菌等肠道细菌生长时，发酵培养基中的乳糖，使加入的伊红-美蓝变色，在菌落上沉积为紫黑色，并呈现金属光泽。
培养基的制备方法以下为常规方法，如配方中有特殊规定或要求，以配方为依据。
1.根据配方，计算各种营养成分用量。一般药品可用普通药物天平称量，用量少的药品，可按比例配成高浓度溶液，再按所需量用移液管吸取。称好的药品放入玻璃烧杯或搪瓷杯中。
2.在另一容器中将所需量的水(一般可用自来水，有特殊要求时需用蒸馏水)加热，取全量的1/3左右倒入放药品的容器中，用玻璃棒搅拌，待药品全溶后，再将其余热水全部倒入。
3.若配制固体培养基，则称取1.5～2％的琼脂放入已溶化的营养液中，继续加热至琼脂全部溶解。加热中随时搅拌，防止溢出或糊底。烧糊的培养基营养物质破坏，并产生有毒物质，不宜再用。
4.待溶化的培养基稍冷却后，按配方要求调整pH值。先取10毫升培养基装入试管中，用pH试纸测其自然pH，再用1％NaOH(或1％HCl)调至所需pH，根据用量计算，换用10％NaOH(或10％HCl)调整所配全量培养基的pH。加碱(或酸)溶液时，应边滴加边搅拌，至应加量将近用完时，再次测试，最后调至要求的pH值。
5.配好的培养基，根据需要趁热分装至试管或锥形瓶中。分装需用漏斗，以免琼脂粘在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的1/3～1/2；装试管一般为试管高度的1/5～1/4，以免灭菌时培养基上溢，粘湿棉塞。
6.用预先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞既有利于通气，又有滤菌作用，故松紧、大小应适当，以免使用时影响操作(如图)。
最后用牛皮纸或报纸包住棉塞，扎紧在瓶颈或试管上方，以免灭菌时水蒸汽沾湿棉塞或脱落。
7.灭菌后取出的固体培养基，根据需要可将试管立即斜放，冷凝后即成斜面培养基，用于菌种扩大培养及保藏；锥形瓶中的培养基，倒入无菌培养皿中，冷凝后即制成平板培养基，可用于菌种的分离、鉴定等。液体培养基冷却后可直接根据需要接入菌种。
培养基配方举例
1．氧化硫杆菌培养基
粉状硫10克，MgSO40.5克，(NH4)2SO40.4克，FeSO40.01克，KH2PO44克，CaCl20.25克水1000毫升，自然pH。
2．牛肉膏蛋白胨培养基(常用的细菌培养基)
牛肉膏5克蛋白胨10克NaCl5克水1000毫升pH7.2～7.4琼脂15～20克
3．高氏一号培养基(常用的放线菌培养基)
可溶性淀粉20克KNO31克K2HPO40.5克MgSO40.5克NaCl0.5克FeSO40.01克水1000毫升琼脂15～20克pH7.4～7.6
4．察氏培养基(培养霉菌用)
蔗糖20克NaNO33克K2HPO41克KCl1克MgSO40.5克FeSO40.01克琼脂20克水1000毫升自然pH
5．无氮培养基(培养自生固氮菌用)
葡萄糖10克NaCl0.2克KH2PO40.2克CaSO4·2H2O0.1克MgSO40.2克CaCO35克琼脂20克水1000毫升自然pH
6．伊红-美蓝培养基(检查肠道细菌用)
蛋白胨10克K2HPO42克乳糖10克琼脂25克水1000毫升，pH7.62％伊红水溶液2毫升0.5％美蓝水溶液2毫升。
将乳糖、伊红、美蓝分别灭菌后，加入灭菌的培养基中摇匀，倒平板。
7．马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，常用的真菌培养基）
马铃薯块茎（去皮）200克葡萄糖20克K2HPO41克MgSO40.5克琼脂20克水1000毫升自然pH
培养基的分装
按上图所示，将培养基趁热分装到洁净的试管中，培养基的高度约为试管高度的1／5。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。
加棉塞
培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好，加棉塞时，应使棉塞长度的2／3在试管口内，如上图所示。
高压蒸汽灭菌锅
搁置斜面
当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。
三、微生物的厌氧培养技术
食品微生物检验技术
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。2.意义：大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
国家标准方法与美国FDA的标准方法比较
1．MPN检索表：
MPN为最大可能数(MostProbableNumber)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
国家标准和进出口行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。
MPN计数法简介
原理:MPN计数属于一种统计方法，可以用它来对低浓度的微生物进行评价(如微生物数量<100／g或者<100／mL)。‘按这种方法，样品应系列稀释，以便接种物中有时(但不是总是)含有活的微生物细胞。
MPN法是基于以下假设的：
①细菌随机分布于样品中；
②细菌是既不成团也不成簇生长在一起的；
③培养基和培养条件允许每一种微生物都能进行良好的生长。
(一)MPN分析(FDA)
A.步骤如下：
(1)将来自某种环境的样品按图4．1所示的步骤进行稀释。
(2按系列稀释程序，去1ml样品移至每个稀释度的3个试管内，需做标记。
(3)在37℃下培养48小时。
B.MPN检测结果
(1)记录出现沉淀和产气的试管，并按大肠菌群疑似阳性试管报告结果。48h后，用MPN表来确定疑似大肠菌群的数量，按MPN／mI计。
(2)从所有产气试管中取一环生长的菌体，转移至盛有BGB的液体培养基试管中，用于证实是否是大肠菌群。试管需在37℃下培养48h。
(3)将试管置于紫外灯下照射，出现荧光的试管即为大肠杆菌阳性试管，并做记录。需要提示的是，紫外灯下观察试管时需要戴眼罩，以保护眼睛。
(一)MPN表的使用
本实验中给出的：MPN表，来自于美国食品与药物管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)的《细菌学分析手册》(BacteriologyAnalyticalManual，BAM，1999)。该表是建立在0．1、0．01和0．01g三种接种量水平上的。我们从100、10-1、10-2和10-3等稀释度中各取1mL，则它们按稀释系列就转化成为1mL、0．1mL、0．01mL和0．001mL接种量了。
(1)选择三个稀释度作为MPN表的参考，这是运用MPN表进行判定的关键。
①选取有最大稀释度(即最高稀释度)的所有阳性试管，以及仅次于最大稀释度的两个较高稀释度的试管。
例如，按照我们的稀释程序，如果你得到的阳性试管是：100稀释度有3/3管(即3个试管中有3个呈阳性)，10-1稀释度有3/3管，10-2稀释度有l／3管，10-3稀释度有1／3管，则我们就选用3-1-1的MPN表。
②如果没有两个较高稀释度可用的话，则应选择三个最高稀释度的结果进行
判定。
例如，如果阳性管数为：100稀释度有3／3管、10-1稀释度有3／3管、10-2也稀释度有3／3管、10-3稀释度有1／3管作为结果，则我们就选用3-3-1的MPN表。
③如果不是所有稀释度的所有试管都呈阳性，则选择具有阳性反应的三个最低稀释度的结果进行判定。
例如，如果我们的结果是：100稀释度有0／3管，10-1稀释度有1／3管，10-2稀释度有0／3管，10-3稀释度有0／3管，则我们应要选用0-1-0的MPN表。然而，由于我们选用1、0．1和0．01的稀释度来对应MPN表中的0．1、0．01和0．001，所以MPN表中的数值需要除以10。无论何时采用100稀释度的结果时，这肯定都是正确的。
(2)当选择三个稀释度后，可以用表4．1的数值来获取MPN／mL。
(3)如果选用10-1～10-3的稀释度，可以直接用MPN表中的数据。
如果用100～10-2的稀释度，则你需将从MPN表中获得的数据除以10，因为这是一个0.1、0.01、0.001g的MPN表。
大肠杆菌检测
大肠杆菌(E.coli)属于大肠菌群中的一员，当对大肠菌群进行计数时，大肠杆菌是被计算在整个大肠菌群中的。然而，某些鉴别性培养基或者选择性培养基与大肠菌群的计数没有关系，可以被专门用来评价大肠菌群中大肠杆菌的数量水平。由于仅仅检测一个种的存在情况，所以与大肠菌群计数相比，大肠杆菌的计数工作要更加专一，而且，鉴于少数的大肠杆菌血清型带有致病性，所以部分研究人员相信，较大肠菌群而言，大肠杆菌可以更加准确地反映致病菌的存在状况。
就传统的MPN检测而言，我们可以用添加4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG)荧光底物的十二烷基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基(LST)来检测大肠菌群和大肠杆菌,因为大约90％的大肠杆菌会产生β-D-葡糖苷酸酶，这种酶能分解MUG产生荧光物质，并且在长波紫外灯照射下可以看见这种荧光物质，从而可以采用这种方法鉴别出疑似的试管中是否有大肠杆菌生长。
本实验中用到的细菌培养基
(1)含有MUG的十二烷基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤：该培养基含有胰蛋白胨(氮源)、乳糖(碳水化合物)、磷酸缓冲液、(NaCl)、十二烷基硫酸盐和MUG。其中：
①该培养基中的选择性物质：即十二烷基硫酸钠，它能抑制革兰氏阳性菌和芽孢菌的生长。
②该培养基中的鉴别性物质：a．乳糖发酵产生的气体(杜氏小管)；b．大肠杆菌产生的β一D一葡糖苷酸酶分解MUG后产生的荧光物质。
(2)亮(煌)绿胆汁(BGB)肉汤：该培养基含有蛋白胨(氮源)、乳糖(碳水化合物)、牛胆汁和亮绿。其中：
①该培养基中的选择性物质：即亮绿和牛胆汁，它们能抑制革兰氏阳性菌的
生长。
②该培养基中的鉴别性物质：a．产气(杜氏小管)；b．产酸，即亮绿在pH为4时会变为黄色。
(3)大肠杆菌或大肠菌群测试片：该培养基是以紫红胆汁琼脂培养基(VRBA)为基础经改良而成的，主要有酵母浸膏、蛋白胨、胆盐、乳糖、氯化钠、中性红和结晶紫。
其中：①该培养基中的选择性物质：即胆盐和结晶紫，它们能抑制革兰氏阳性菌的生长。
②该培养基中的鉴别性物质：a．能利用乳糖的菌形成紫红色的菌落；b．不能利用乳糖的菌落呈粉色。经β-D-葡糖苷酸酶分解后的底物周围会出现从无色变成蓝的沉淀。
快速检测技术——测试片(Petrifilm)计数技术
测试片(Petrifilm)计数技术诞生于20年以前，目前使用的测试片配方很多。测试片是一种微型的干燥平板，平板中含冷却的凝胶物质。当将1mL样品倒平板时，液体样品会湿润培养基。
测试片计数的主要优点有：
①不需要进行培养基的制备和灭菌；
②面积小，20个测试片在培养箱中所占的空间与两个平板所占的空间相当；
③培养后产生的气泡容易发现，按照实验室定义，这一点在确定大肠菌群时特别有效。
测试片计数的不足之处有：
①菌落面积小，菌落计数困难；
②当用较低的稀释度倒平板时，食物颗粒或许会被当作菌落来计数。
若采用大肠杆菌测试片，则β-D-葡糖苷酸酶的活性更加明显；但若此时在测试片法中不用MUG而是用显色底物，则在每个菌落周围形成的蓝色沉淀也能很好地说明存在疑似大肠杆菌的β-D-葡糖苷酸酶活性。
（二）在大肠杆菌测试片上进行平板计数
（1）按MPN要求，准备系列稀释液；
（2）对每个稀释度的测试片进行标注；
（3）将测试片置于超净工作台上，每一次按一个稀释度做平板；
（4）取出上层测试片，加入1ml稀释液于干燥的平板上；
（5）轻轻将培养基上的测试片展开，防止气泡生成；
（6）用塑料模具轻轻地把样品压实，覆盖住培养基；
（7）按照生产商提供的说明，将平板移至37℃：下培养24h。
B.大肠杆菌测试片测试结果
(1)对菌落数在25～50cfu／mI的测试片以及未产生过多气体的测试片进行计数。产气过多的平板因菌落太多而难以计数，即所谓的TNTC平板。
(2)大肠菌群能发酵乳糖(菌落呈红色)并产气(气泡可以被滞留在杜氏小管中)。带有白色泡沫的菌落不能作为大肠菌群来计数。对呈现红色和蓝色的菌落进行计数，并运用这些数据去计算大肠菌群的数量，大肠菌群按cfu／ml计。
(3)将那些呈蓝色且产生气泡的菌落计作大肠杆菌，并用这些数据去计算大肠杆菌的数量，大肠杆菌按cfu／m1计。
验证MPN
(1)在BGB肉汤培养基中，那些既产酸又产气的试管中所含的微生物可以被确认为大肠菌群。
(2)用MPN表中已证实的数据来计算确定的大肠菌群数量(按MPN／ml计)。选择适宜的三种稀释度来制表，同时用表4．1来确定每毫升样品中大肠菌群的MPN。
(3)如果采用l0-1—10-3的稀释度，可直接从表中读取MPN值，如果用100—10-2的稀释度，则MPN值必须除以10，因为结果是基于0．1、0．01、0．001g的MPN表获得的。