人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）说明书
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核酸提取试剂
（柱提法）
【产品名称】
通用名称：人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）
【包装规格】10人份/盒
【预期用途】
该产品用于定性并分型检测宫颈脱落细胞样本和生殖泌尿道分泌物中人乳头瘤病毒(HPV)基因型别，包括：15种高危
型别：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73,82(MM4)；3种疑似高危型别：26，53，66；10种低
危型别：6，11，40，42，43，44，54，61，81(cp8304)，83(MM7)。
人乳头瘤病毒（HPV）是一种诱发外生殖器良性病变和女性子宫颈癌的主要病原体。人乳头瘤病毒有许多不同的基因
型，依据不同型别与宫颈癌发生危险性的高低可将其分为低危型和中高危型HPV。低危型HPV常引起外生殖器尖锐湿疣等
检测，对于宫颈癌的早期诊断和治疗具有一定的意义。
【检验原理】
本试剂盒针对人乳头瘤病毒基因组晚期区L1区设计特异引物和28型探针，并将特异性探针包被在尼龙膜上，再通过
生物素标记的引物进行靶片断扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，通过杂交、洗膜，靶标中的型特异性片断会和
特异性探针结合；最后进行显色和结果分析，从而可检测人乳头瘤病毒(HPV)28种基因型DNA。
【主要组成成分】
注：不同批号试剂盒中各组分不得混用。
需自备的试剂：去离子水，无水乙醇等。
【储存条件及有效期】
核酸提取试剂（柱提法）室温保存，PCR试剂保存于-20±5℃，反向点杂交试剂保存于2～8℃，试剂盒有效期为6
个月。
PCR试剂应避免反复冻融。
效期内稳定性：运输条件下（-20±5℃储存的试剂使用泡沫箱加干冰密封运输，开箱时干冰未消耗完；2～8℃储存的
试剂使用泡沫箱加冰皇密封运输）72小时内不影响本试剂盒的检测性能；试剂使用时开瓶（复融）24小时内其检测性能
不受影响；试剂使用前反复冻融次数不应超过6次。
试剂盒生产日期及失效日期见产品包装标签。
【适用仪器】
ABI9700、ABI2720，PTC-200PCR仪。
【样本要求】
1.适用标本类型：宫颈脱落细胞样本和生殖泌尿道分泌物。
1
2.受检需知
（950μL溶液Ⅱ+100μL溶液Ⅲ+0.5μL稀释10倍的溶液
Ⅳ）×2N
检查前不要做阴道冲洗，不要在阴道内用药物；
检查前24小时内最好避免性生活。
3.标本采集：
宫颈样本：医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转4－6周以获取足量的上
皮细胞，然后取出宫颈刷置于盛有2mL生理盐水的无菌小试管中备检。若样本黏液过多或者含血量过多应该尽量重新取样。
女性尿道样本：首先使用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用棉拭子插入尿道约2CM，然后捻动拭子，最后将拭子放
入细胞保存液中，密闭送检。采集尿道样本时，受检者必须在采集前2个小时禁止小便。
男性尿道样本：取尿道分泌物或使用细小的尿道拭子，插入男性尿道2-4CM，然后捻动尿道拭子取出分泌物，最后将
尿道拭子放入细胞保存液中，密闭送检。
标本应立即用于测试，4℃保存不应超过1个星期，-20℃保存不应超过3个月。
4.运送：标本运送应采用0℃冰壶。
【检验方法】
1．样本处理与DNA提取
1.1.实验前准备
1.1.1抑制物去除液（浓缩液）中加入2.5mL的无水乙醇，并在管盖上打勾。室温保存。
1.1.2去离子液（浓缩液）中加入11mL的无水乙醇，并在管盖上打勾。室温保存。
1.1.3蛋白酶K（干粉）中加入625μL的洗脱液，充分混匀，溶解。-20℃保存。
1.1.4CarrierRNA（干粉）中加入50μL的洗脱液，充分混匀，溶解。-20℃保存（CarrierRNA为白色或半透明物质，
请仔细检查，确保其完全溶解）。
注：a.如将病毒裂解液、抑制物去除液不恰当地放置在低温时，可能会出现结晶沉淀。37℃温育至其消失即可；
b.使用前须将裂解液与50μLCarrierRNA混合，颠倒10次，充分混匀，最好现用现配，配制方法如下：
1.2核酸提取试剂(柱提法)操作步骤
1.2.1.转动宫颈刷或棉拭子，将宫颈刷或棉拭子上的细胞洗脱于2mL生理盐水中，挤干棉拭子。取1mL洗脱液转至1.5mL
离心管中，10,000rpm离心3分钟，去除大部分上清，保留约200μL左右液体，同时取阴阳性质控品100μL，加水补足
200μL参与全部提取过程；
1.2.2向其中加入50μL的蛋白酶K，再加入200μL的病毒裂解液（已含CarrierRNA），盖紧管盖，漩涡振荡15秒以
充分混匀，高速离心10秒（防止温育时产生气泡），72℃10分钟。同时可将洗脱液置于72℃预热；
1.2.3加入250μL无水乙醇，振荡15秒，将混合液全部吸至离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟；
1.2.4将离心柱装至新的收集管，加入500μL的抑制物去除液，室温下12,000rpm离心1分钟；
1.2.5将离心柱装至新的收集管，加入500μL的去离子液，室温下12,000rpm离心1分钟，重复2.1.5步骤一次；
1.2.6弃收集管中废液，然后将离心柱-收集管于室温下最大转速离心3分钟以除去残余的乙醇；
1.2.7将离心柱取出，放置于新的1.5mL离心管。打开离心柱盖子，72℃放置2分钟（使用干式恒温器，不能使用水浴
锅）；
1.2.8在离心柱的膜的正上方小心加入72℃预热的洗脱液60μL，盖紧离心柱管盖,室温静置2分钟后，最大转速离心1
分钟。离心管内即为病毒核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于-20℃。
2．PCR扩增（在仪器上按照下列条件进行PCR循环程序的设置）
取PCR反应管若干，分别加入提取好的样本DNA和HPV阴阳性质控品DNA各20μL，6,000rpm瞬时（5秒）离心后，
将各反应管放入PCR仪，按下列条件上机进行扩增：
50℃3分钟，95℃预变性15分钟，然后按94℃40秒→55℃40秒→72℃40秒扩增40个循环，最后72℃延伸7分钟。
3．杂交操作
3.1杂交试剂配制
2
3.2杂交过程：
3.2.1杂交
将PCR扩增产物98℃变性8分钟，然后立即置于冰水混合物中2分钟以上；
取5mL（或者15mL塑料管）塑料离心管，放入标有待检样本编号的HPV分型杂交膜条，加入4mL杂交液Ⅰ和与膜条编号
相对应的变性后的PCR产物40μL，拧紧管盖，并将离心管平放入42℃水浴摇床中，低速转动（100～150rpm），杂交1
小时；将杂交液Ⅱ放入水浴摇床中预热至42℃，备用。
3.2.2结合
取出HPV分型杂交膜条，用清水清洗1分钟，然后5张膜条/管，转入装有20mL预热杂交液Ⅱ的50mL离心管中，加入
20μL溶液Ⅰ，42℃水浴摇床中，低速转动（100～150rpm）结合10分钟（每管10mL杂交液Ⅱ，加入10μL溶液Ⅰ，可
放入2－3张膜条结合；每管20mL杂交液Ⅱ，加入20μL溶液Ⅰ，可放入5张膜条结合）
注：杂交液Ⅱ需先预热至42℃，放入膜条后再加入溶液Ⅰ,每管一次最多5张膜条进行结合。
3.2.3洗膜
取出HPV分型杂交膜条，转入装有预热杂交液Ⅱ的50mL离心管中，42℃水浴摇床中，低速转动（100～150rpm）洗膜10
分钟（每管20mL杂交液Ⅱ，可洗2－3张膜条；每管30mL杂交液Ⅱ，可洗5张膜条,每管一次最多可洗5张膜条）
3.2.4显色
根据样本的数量，按照3.1表中显色液的配制方式配制所需的显色液，放入洗涤后的HPV分型杂交膜条，在20～25℃避
光显色3～10分钟，取出膜条放入20mL溶液Ⅱ中终止显色2－3分钟，弃溶液Ⅱ，加入20mL纯水，轻摇2～3分钟取出。
用吸水纸吸去膜条表面水分，尽快在扫描仪上扫描膜条（若不能立即进行扫描，请冻存于-20℃）。
4.结果分析
参照达安膜条斑点识别分析系统操作说明书的要求，使用扫描仪扫描膜条，设定相应的参数并输出扫描结果，然后采
用该软件进行数据分析，详见软件使用操作说明书。
5.质量控制
5.1CC点：信号值应≥cutoff值，且为边缘清晰的蓝色圆点，则杂交过程正常。否则需要重新检查杂交过程。
5.2PC位点：信号值应≥cutoff值，表示采样、DNA抽提和PCR过程正常。若结果阴性，表示DNA抽提或PCR过程不成功，
或未采集到宫颈或疣体脱落细胞，该样品应重复实验或重新采样。
5.3HPV阳性质控品：CC点应呈阳性；PC点应呈阳性；HPV18分型位点为阳性；其它位点应为阴性。
5.4阴性质控品：CC点应呈阳性；其他位点应为阴性。
以上各项同时满足的条件下本次实验有效，否则全部试验应重新进行。
【阳性判断值或者参考区间】
所有结果判断以软件计算的信号值为准。信号值反映的是斑点的积分光密度（IOD）。
显色控制点（CC）IOD≥cutoff值为显色正常，当低于这个数值时将显示“ERROR”，原因是可能没有在正确的斑点
区域选取，或者杂交过程出现异常。
CC点、PC点和各型别位点cutoff参考值根据统计学方法计算得出，已预设在分析软件中。
【检验结果的解释】
RDB膜条上各型HPV探针排列如下：
注：CC点为显色控制点，显色表示杂交过程正常；PC点为内参点，显色表示采样，DNA提取，PCR过程正常；其余各点代
表HPV各型。
1.阴性、阳性判定标准：各位点信号值的cutoff值已在软件中设置好，分析结束后软件自动生成信号值和相应的型别。
2.检测结果阳性的，表明该样本有HPV病毒的DNA存在，检测结果阴性并不能排除样本含有病毒，只能说明样本含有的
病毒浓度低于本试剂盒的检测下限。
3.对于检测过程中，膜条出现多个点阳性代表不同型别的HPV病毒混合感染，但不能计算出其具体的比例。
4.如果临床样本只出现CC点阳性，则建议重新取样或者重新提取DNA。
5.常见型别附图
1）单一型别的阳性结果
3
HPV16型HPV18型HPV6型
1.最低检测量：本试剂盒对试剂盒检测范围内的28种基因型标本的最低检测量均为5×10拷贝数/mL。
2）混合感染的阳性结果
HPV16，82型HPV16，6型HPV6,81型
3）阴性结果
正常阴性结果异常阴性结果
注：异常阴性结果需要重新提取DNA或者重新取样再复检。
【检验方法的局限性】
1.低于本试剂盒最低检出量浓度的样品无法分型。
2.除HPV（28型），未在本试剂盒设计范围内的HPV其他型别不能分型。
3.本试剂盒只能检测待检样本中的人乳头瘤病毒基因组，不能确定待检样本是否有人乳头瘤病毒（HPV）颗粒。
【产品性能指标】
2.特异性：试剂盒与沙眼衣原体（CT）,解脲支原体（UU）,单纯疱疹病毒2型（HSV2）,巨细胞病毒（HCMV）无交叉反应。
样本中含血液或者脓液浓度小于30mg/mL(约25%)时，对检测结果无影响。
3.精密性：本试剂盒批内及批间的积分光密度值（IOD值）的变异系数（CV%）均≤50％。
4.试剂盒的临床研究试验结果显示：阳性符合率为100%，阴性符合率为100%，总符合率为100%。
【注意事项】
1．本试剂盒仅用于体外检测。
2．实验前请仔细阅读本说明书。
3．为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样品应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜；样本的处理建议在
要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
4．实验人员必须进行专业培训，PCR实验室应与杂交室分开.PCR实验应分别在样品处理区，PCR加样区，扩增区和杂交室分
别进行。各区应相对分隔。人和实验用物品应从样品处理区→PCR加样区→扩增区→杂交室单向流动，PCR试剂盒不可存放
于杂交区。
5．为试剂和标本准备阶段提供负压超净工作台，实验过程中请穿工作服，PCR室和杂交室工作服应分开，带一次性手套，
使用自卸管移液器。
6．对每次实验进行质量控制。
7．标本处理：标本处理需严格按照说明书进行操作。
8．PCR反应使用的小塑料管、吸头等应高压灭菌并一次性使用。
9．标记并核对DNA扩增管与膜条的编号，使之一一对应。
10．杂交全过程需避免用手接触膜条，应用镊子夹取膜条边角进行操作。避免划破膜条，并用铅笔在边角标记。油性笔标记
会影响信号分析的准确性。
11．室温低于20℃时，杂交液Ⅰ、杂交液Ⅱ中的SDS易结晶析出，使用时需温浴(40℃～50℃)使之溶解。
13．反应结束后，膜条进行扫描时务必先用吸水纸吸干表面水分，并且平整地放到扫描仪上。在图片预览时膜条上不出现
水渍和皱褶现象，否则会影响信号分析结果的准确性。
14．标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。
15．实验完毕用10%次氯酸或70%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器。
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