秦岭地区常见蜱虫携带病原体流行病学特征分析
贺真，付婷，严敏，邵中军*
空军军医大学军事预防医学系军队防疫与流行病学教研室，陕西西安
收稿日期：2023年9月27日；录用日期：2023年10月20日；发布日期：2023年10月27日
摘要
目的：了解秦岭地区蜱虫种类及分布情况，为蜱虫及蜱媒传染病的防治提供依据。方法：采用动物体表逆毛捡拾法对2019年陕西省秦岭地区开展蜱类调查，通过形态学观察以及PCR检测明确秦岭地区蜱虫分布及携带病原体情况。结果：秦岭地区的蜱类采集活动中，共获得蜱虫267只，经鉴定均为长角血蜱。之后对其中采集的163只蜱针对6种病原体进行PCR检测。在秦岭地区的蜱类中，长角血蜱的立克次体感染率为18.4%，噬吞噬细胞无形体感染率为61.35%，巴贝西原虫感染率为0.61%，巴尔通体感染率为2.45%，新型布尼亚病毒感染率为3.07%，而莱姆螺旋体未检出。秦岭三个地区蜱虫携带病原体的阳性率均有差异(P<0.05)。并且携带病原体中存在四种混合感染类型，分别为立克次体与无形体混合感染、立克次体与巴尔通体混合感染、无形体与新型布尼亚病毒混合感染、无形体与巴贝西原虫混合感染。结论：长角血蜱为试验采集蜱虫中的优势蜱种；进行病原体检测发现噬吞噬细胞无形体具有较高感染率，不同地区蜱虫携带病原体分布有差异，并且存在病原体混合感染的情况，提示在蜱虫比较活跃地区及季节应该增强防范措施，避免叮咬感染。
关键词
蜱媒传染病，长角血蜱，混合感染
AnalysisofEpidemiologicalCharacteristicsofPathogensCarriedbyTicksinQinlingArea
ZhenHe,TingFu,MinYan,ZhongjunShao*
DepartmentofMilitaryEpidemiology,SchoolofMilitaryPreventiveMedicine,AirForceMedicalUniversity,Xi’anShaanxi
Received:Sep.27th,2023;accepted:Oct.20th,2023;published:Oct.27th,2023
ABSTRACT
Keywords:Tick-BorneDisease,Haemaphysalislongicornata,Co-Infection
ThisworkislicensedundertheCreativeCommonsAttributionInternationalLicense(CCBY4.0).
1.引言
蜱虫是一类分布广泛的媒介生物，可引起蜱媒传染病。蜱媒传染病是一类由媒介蜱传播、感染所引发的自然疫源性疾病[1]。蜱携带和传播的病原体种类数量繁多，包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体等，宿主动物分布广泛、流行环节复杂交错，且易受到自然环境和社会经济条件的影响[2][3]。几种蜱传疾病往往共存于同一疫源地，一种媒介蜱也可同时携带两种或两种以上的病原体，这极大地增加了宿主动物及人类复合感染的机率，极易造成蜱传疾病的流行和暴发[4][5][6][7]。
秦岭地处北纬32'~34'之间，介于关中平原和南面的汉江谷地之间，该地区自然资源丰富，生态系统物种繁多，地形复杂植被丰富，其独有的地理优势和独特的气候很适合蜱虫的生长和繁殖，因此秦岭地区就此成为蜱媒传染病的自然疫源地[8]。
2019年我们选取了蜱虫繁殖活跃的季节，对秦岭地区三个监测点：长安区、鄠邑区以及商南县的蜱虫携带病原体的情况进行调查研究，为秦岭地区的蜱媒传染病的流行病学研究提供依据，对秦岭地区蜱传疾病的防控具有一定意义。
2.材料和方法
2.1.材料
寄生蜱虫标本采集地点选取秦岭地区东段商南县、中段鄠邑区以及西段的长安区作为采集点，以三县位于山丘地去的农户家放养的羊、牛、犬作为研究对象，通过对家畜体表寄生蜱进行采集。
2.2.方法
2.2.1.蜱标本的采集
2019年5月~2019年8月以来我们在蜱虫活动高峰期进入采样点进行蜱标本的采集，并记录好采集地点的环境信息。主要采用动物体表检查的方法采集羊、牛、犬身上附着的寄生蜱。长安区124只，鄠邑区26只，商南县117只，共计采集267只蜱虫。
2.2.2.蜱标本的保存与运输
对于在家畜体表采集到的寄生蜱标本，直接放入大塑料瓶中，做到编号和登记。将活蜱放入后再放入干滤的纸条，随后将标本送到实验室，将其放入4℃冰箱内进行保存。
2.2.3.蜱虫标本拍照及形态学鉴定
对采集到的蜱虫标本用蒸馏水冲洗，再用75%乙醇固定，干燥后使用微生物电动视频检测系统对标本进行3D拍照，同时进行鉴定分类，之后放入80℃超低温冰箱保存。
2.2.4.蜱媒传播病原体DNA/RNA核酸提取
蜱虫标本病原体核酸的提取采用QiagenAllprepDNA/RNAMinikit试剂盒操作过程如下：
1)将每支装有蜱虫的EP管中加入3~4颗小钢珠，每管加入400μlRLT，蛋白酶K40μl，放入细胞组织粉碎仪研磨；
2)将EP管放入水浴55℃，10min；
3)全速离心，取上清入DNA柱，8000g离心，30s，离心套管内的滤液用来提取RNA；
4)将DNA离心柱中加入500μlAw1，8000g离心15s；
5)将DNA离心柱中加入500μlAw2，14,000g离心20min；
6)离心柱放入新EP管中，加入100μlEB，8000g离心1min；
7)将套管内的滤液350μl，加入等体积的350μl70%乙醇，将混合液放入RNA柱，8000g离心15s；
8)加入700μlRW1，8000g离心15s；
9)加入500μlRPE，8000g离心15s；
10)加入500μlRPE，8000g离心2min；
11)加入50μlRNase-freewater，8000g离心1min。
收集提取的RNA和DNA放置于80℃冰箱保存待检测。
2.2.5.蜱媒传播病原体的PCR检测
1)PCR扩增检测以提取的DNA核酸为模板，分别进行两轮的巢式PCR扩增。扩增体系为25μL，体系如下PCRTaq酶Mix12.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA2μL，ddH2O9.5μL。第一轮产物作为第二轮模板，体系同上进行PCR扩增，对第二轮产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特定片段长短
Table1.Primersandprobesequencesusedforpathogendetection
对目的基因阳性进行标记记录。
2)Real-TimePCR检测以提取RNA核酸为模板，进行一步法的RT-PCR。扩增体系为20μL，体系如下OneStepRT-PCRBuffer10μL，ExTaq酶0.4μL，RT-EnzymeMix0.4μL，ROXDye0.4μL，上下游引物各0.4μL，探针引物0.8μL，ddH2O5.2μL。
2.3.统计分析
使用SPSS20.0软件进行统计分析，不同地区的蜱虫病原体阳性携带率的差异使用卡方检验的方法，P<0.05为有统计学意义。
3.结果
3.1.蜱种类鉴定
2019年5月以来我们在秦岭三个检测点共采集到蜱标本267只，其中长安区124只，鄠邑区26只，商南县117只。经鉴定采集到的蜱标本均为硬蜱科血蜱属长角血蜱，结果显示以上三个观察点的优势蜱种为长角血蜱。
Figure1.Haemaphysalislongicornata
3.2.媒介蜱标本感染病原体情况
我们对采集的蜱标本中的163只蜱虫标本通过PCR方法进行检测，发现蜱标本中立克次体阳性携带30只，阳性率18.40%(30/163)；嗜吞噬细胞无形体阳性携带100只，阳性率61.35%(100/163)；巴贝西原虫阳性携带1只，阳性率0.61%(1/163)；巴尔通体阳性携带4只，阳性率2.45%(4/163)；新型布尼亚病毒阳性携带5只，阳性率3.07%(5/163)；莱姆螺旋体经检测均为阴性。
3.3.蜱虫地区分布差异情况
Table2.TickpathogencarriageindifferentregionsoftheQinlingMountainsin2019
Table3.Mixedinfectionstatusoftickpathogens
4.讨论
本研究采集蜱虫267只，其中全部为长角血蜱，表明该地区媒介蜱的优势蜱种为长角血蜱。采用PCR的方法检测163只蜱虫，检出5种病原体，分别为嗜吞噬细胞无形体、立克次体、新型布尼亚病毒、巴尔通体以及巴贝西原虫。其中嗜吞噬细胞无形体阳性携带率最高为61.35%，其次依次为立克次体阳性率18.40%，新型布尼亚病毒阳性率3.07%，巴尔通体阳性率2.45%，最低的为巴贝西原虫阳性率为0.61%。我们的研究提示长角血蜱也是该地区蜱媒传染病主要传播媒介之一。
本次通过对秦岭地区蜱虫携带病原体进行检测调查，共发现了4种类型的双重混合感染，混合感染率为12.27%，研究显示最常见的混合感染为立克次体与噬吞噬细胞无形体混合感染。混合感染是指两种或两种以上的病原体同时或者先后侵入同一机体造成的共同感染[16]。我们知道蜱虫可以携带多种蜱传病原体，通过叮咬将这些病原体传染易感人群。而混合感染的病原体往往通过协同作用可以影响疾病的发生、发展以及预后，从而导致疾病不同的严重程度，影响临床治疗[4][15]。
秦岭地区地形复杂、植被覆盖率高、生态物种丰富，是蜱媒传染病的自然疫源地。本次调查结果提示该地区蜱虫携带多种病原体，是人和动物诸多重要疾病的传播媒介，对进入该地区旅游或周边生活的人员存在潜在感染蜱媒的危害，因此有必要加强对这些蜱传疾病的防控。