本发明涉及硫酸软骨素提取方法，特别涉及一种从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法、由该方法提取的硫酸软骨素及应用。
背景技术：
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法、由该方法提取的硫酸软骨素及应用。
本发明技术方案如下：
一种从鲟鱼鱼骨中粗提取硫酸软骨素的方法，采用碱液提取之后盐析去除蛋白质的方法提取，具体的是在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h，之后取上清，加入3％(g/ml)的NaCl，90℃静置20min，过滤。
在上述方案的基础上，所述的鲟鱼的干燥软骨是由以下方法制得：除去鲟鱼软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎，加入5倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h；回收丙酮后，再加入5倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干。
在上述方案的基础上，除去鲟鱼软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织的方法是加热煮沸10min。
一种从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，具体步骤如下：
1)预处理、脱脂：除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎，加入5倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h；回收丙酮后，再加入5倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干鲟鱼软骨；
2)提取：在鲟鱼的干燥软骨中加入浓度为3％NaOH溶液，料液比1:6(g/ml)，在35℃下提取2h；
3)取上清，加入3％(g/ml)的NaCl，90℃静置20min，过滤；
4)酶解：用10％的NaOH调上清液pH至8.9，加入液体体积0.05％-0.06％的胰酶，在50-55℃下酶解，在酶解过程中，随时调pH至8.9；酶解完成后，将温度升至85℃，恒温水浴30min；
5)吸附：调水解液pH至6.8，加入体积1％的滑石粉，搅拌吸附1h，再用盐酸调pH至6.4，4600rpm离心20min，取上清；
6)沉淀、干燥：调pH至6.0，加入无水乙醇使乙醇体积分数达60％，搅拌，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置12h以上。收集沉淀，于60℃的干燥箱中干燥。
在上述方案的基础上，步骤1)中除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织的方法是加热煮沸10min。
在上述方案的基础上，步骤4)中的干燥条件为：60℃恒温真空干燥2小时、常温真空干燥24小时或真空冷冻干燥。
本发明的有益效果是：
本发明的提取方法较大幅度地提高了产品中有效成分氨基己糖的含量。另外，硫酸软骨素(CS)是通过低聚糖苷与蛋白质分子的丝氨酸残基相连，因此在稀碱－酶解法中，由于酶水解的肽链有一定特异性，释放出的硫酸软骨素可能仍连着多个氨基酸残基或多肽。本发明提取方法中还增加了升温盐析一步，降低蛋白酶的用量，生产成本降低，从而使产品的含氮量偏高的问题得到了一定程度上的解决。
附图说明：
图1为鲟鱼CS对小鼠胸腺肥大细胞数量的影响；
图2为CS对小鼠肝癌H227402肿瘤细胞体外培养生长的影响；
图3为CS对小鼠肝癌H227721肿瘤细胞体外培养生长的影响；
图4为CS对小鼠肝癌H22HepG2肿瘤细胞体外培养生长的影响；
图5为预防性灌胃CS给药对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响；
图6为预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响；
图7为预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响；
图8为预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后抑瘤率的影响；
图9为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响；
图10为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响；
图11为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响；
图12为鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后的抑瘤率；
图13为酶解过程中溶液pH的变化。
具体实施方式
本发明的具体实施方式如下：
现有技术中硫酸软骨素的提取方法为：
1)预处理：除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎。
2)脱脂：加入其体积5倍的丙酮，共2次，每次浸泡1h，回收丙酮后，再用其体积5倍的乙醚浸泡1h，回收乙醚，将鲟鱼软骨放在通风处自然干燥。
3)提取：取洁白干燥鲟鱼软骨，加入6倍体积2％的NaOH，室温静置6-8h。
4)盐解：加入相当于上清液总体积量2％的NaCl静置6-8h。过滤。
5)酶解：用10％的NaOH调上清液pH至8.9，加入液体体积0.03％的胰酶，在水解过程中，随时调pH至8.9；水解2.5h后，用三氯乙酸检查已至终点，将温度升至85℃，恒温水浴30min。
6)吸附：调水解液pH至6.8，加入体积1％的滑石粉，搅拌吸附1h，再用盐酸调pH至6.4，4600rpm离心20min，取上清。
7)沉淀、干燥：调pH至6.0，加入无水乙醇使乙醇体积分数达60％，搅拌，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置12h以上。收集沉淀，于60℃的干燥箱中干燥。
使用上述方法提取鲟鱼和鲨鱼鱼骨中的硫酸软骨素，并对提取产品进行检测，测定原理均是基于其组成的糖单位(D－葡萄糖醛酸和N－乙酰—D－氨基半乳糖)，硫酸基以及酸性粘多糖的大分子性质。本实验采用最为常用的比色法和凯氏定氮法。
1、氨基己糖含量的检测
氨基己糖的测定用比色法，又称Elson-Morgan法，测定原理是基于硫酸软骨素由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D氨基半乳糖组成，经盐酸水解可释放出氨基己糖，在碱性条件下与乙酰丙酮缩合，产物与对二甲氨基苯甲醛的酸醇溶液呈红色，于波长525nm处测定吸光度，以氨基葡萄糖做对照品，计算氨基葡萄糖含量，再换算成CS含量。其具体步骤如下：
1)水解
准确称取试样(成品软骨素)0.04－0.06g加入100ml量瓶，加入5ml3M盐酸，在沸水浴中加热60－80min，冷却，滴加20％NaOH液中和至pH7.0，定容，摇匀，过滤，滤液须在半小时内分析。
2)制作工作曲线
配制氨基葡萄糖盐酸盐的标准液(精确称取经105℃恒重的盐酸氨基葡萄糖25mg，置25ml容量瓶重，加水溶解，定容，取5.0ml溶液于100ml容量瓶中，定容，摇匀备用。在6支25ml比色管中分别加纯水4.00、3.75、3.50、3.25、3.00和2.75ml，加入标准液0、0.25、0.50、0.75、1.00和1.25ml，再各加入乙酰丙酮试液(2ml乙酰丙酮加48ml0.5mol/L的碳酸钠水溶液)1.00ml，在沸水浴中加热5min，最后加入对二甲氨基苯甲醛试液(0.8g对二甲氨基苯甲醛+25ml无醛乙醇+25ml盐酸)1.00ml，60℃水浴40min，冷却，以水作参比在λ＝525nm测定吸光度，按试液浓度绘工作曲线。
3)试样分析
硫酸软骨素水解过滤液的分析与上述工作曲线的制作操作相同，最后按照工作曲线计算其含量。
4)计算
氨基己糖含量％＝D/M×100％
D：样品测得的吸光度根据标准曲线所得方程计算的数值(g)；M：样品质量(g)
2、含氮量的检测
含氮量的测定用凯氏定氮法，其原理是在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转变为硫酸铵，加入强碱进行蒸馏，使氮逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出含氮量。其具体操作如下：
1)消化
称样品1-2g(精确到0.2mg)，小心放入消化瓶中(注意不3可粘附于瓶颈上)。加入无水硫酸钠和硫酸铜的混合物(无水硫酸钠：硫酸铜＝9：1)3g，取20ml浓硫酸慢慢加入，小心摇动，此时样品发生焦化。将消化瓶置于消化炉上，连接好流水吸收废气管道，打开电源加热，起初电压调大，待消化瓶内冒烟时调小电压，大量冒烟后再调大电压。加热至样品呈透明的浅蓝色或白色为止，关上电源，取出消化瓶自然冷却，而后，沿着消化瓶的壁注入少量蒸馏水，并将溶液移入100ml容量瓶内，用蒸馏水冲洗消化瓶几次，洗液全部注入容量瓶内，混合均匀。用蒸馏水定容至刻度线加塞，混和均匀后备用。
2)蒸馏
①连接好凯氏定氮装置，接通电源使产生蒸汽。
②取20ml2％硼酸溶液于150ml三角瓶内，并加入甲基红—溴甲酚绿混合指示剂1滴，此时溶液呈灰红色。然后将三角瓶置于冷凝管下，使管口浸入硼酸溶液液面下约0.5cm。
③吸取消化稀释液10ml，由漏斗处加入反应室内，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好。再加入40％氢氧化钠溶液10ml于漏斗,小心放松夹子，使氢氧化钠溶液慢慢流入反应室，此时反应室内有反应发生。即将流尽时，立即夹紧，用蒸馏水冲洗漏斗一次，使小心流入。留下少许水后立即夹紧，并再加入半漏斗的蒸馏水，以防漏气。
④打开蒸汽室开关，使蒸汽进入反应室，此时消化液翻腾，氨气被释放出来，并通过冷凝管，被三角瓶内硼酸溶液所吸收，待硼酸溶液变色后(约5min),或三角瓶内硼酸溶液增加1倍的体积，移入三角瓶，使液面离开冷凝管口，再蒸馏1min，并用蒸馏水冲洗冷凝管口。移开三角瓶，关闭电源。
3)标定
将无水碳酸钠在270℃—300℃灼烧至恒重(约一小时)。称0.20g，溶于50ml蒸馏水中，加2滴甲基红—溴甲酚绿混合指示剂，用刚配制的0.05gmol/LHCL溶液滴定，滴定终点溶液呈现灰红色，煮沸2min，冷却后，再滴定，滴定终点溶液呈现灰红色。
CHCL＝NaCO3(200mg)/(53×VHCL)
4)滴定
用0.1mol/l盐酸标准溶液滴定，到接收液的颜色由绿色变为灰红色即是终点。同样滴定试剂空白实验的接收液。
CB：含氮量；；NHCL:HCL的摩尔浓度；V1：样品所滴定的ml数；V2：空白滴定所用的ml数；m：样品重(g)
3、得率的计算
得率＝(m/M)100％
m：样品重(g)；M：软骨重(g)
用上述方法从鲨鱼和鲟鱼中提取的硫酸软骨素(CS)，检测结果见表1-1。
表1-1提取鲨鱼和鲟鱼的硫酸软骨素效果
从表1-1中可以看出，鲟鱼软骨的提取得率比鲨鱼软骨的高，提取出的样品中有效成分氨基己糖的含量也比鲨鱼的高。
一般来说，碱液提取可使软骨中的蛋白质降解并使其变性沉淀，同时释放出硫酸软骨素(CS)。碱浓度高，提取液中蛋白质等杂质少，产品含氮量低。反之，稀碱提取则蛋白质杂质多，含氮量多。但稀碱法能避免碱浓度过高引起的产品严重降解。
本发明具体实施方法
一种从鲟鱼鱼骨中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)预处理、脱脂：将鲟鱼软骨加热煮沸10min除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其它结缔组织，切碎，加入5倍体积的丙酮浸泡两次，每次1h；回收丙酮后，再加入5倍体积的乙醚浸泡1h后，回收乙醚，自然晾干鲟鱼软骨；
6)沉淀、干燥：调pH至6.0，加入无水乙醇使乙醇体积分数达60％，搅拌，使细粒聚集成大颗粒沉淀，静置12h以上。收集沉淀，60℃恒温真空干燥2小时、常温真空干燥24小时或真空冷冻干燥。
软骨前处理方法的对比
煮沸法：加水浸没鱼头或脊柱，加热煮沸10min，除去软骨上残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织后，将软骨切碎，然后依次用95％乙醇浸泡2h、丙酮浸泡1h，进行脱水、脱脂，并回收乙醇和丙酮，然后将软骨风干2-3h后，于60℃烘箱中烘干得干软骨。
浸泡法：加水浸泡鱼头或脊柱，室温自然解冻，然后再按与煮沸法一样的方法分离切碎软骨，用95％乙醇浸泡2h、丙酮浸泡1h，风干软骨2-3h，再在60℃烘箱中烘干得干软骨。
两种方法处理完后，分别测定鲟鱼干软骨的质量、氨基己糖含量和氮含量，并按下列公式计算软骨的得率。同时干软骨按头骨和脊柱分开保存备用。
软骨的得率＝干软骨重量/处理前的头或脊柱的重量
碱提的方法对比
进行3因素3水平的正交试验(表1-2)。碱液提取过程中每0.5h搅拌一次。碱提取液经4000g离心10min后，取上清测定该溶液体积、硫酸软骨素浓度、澄清度。
表1-2碱提取过程的正交实验表
盐解的方法对比
盐解对比实验：将碱提取液用盐酸调pH至8-9，平均分6份，分别加入1％(g/ml)NaCl、3％(g/ml)NaCl、5％(g/ml)NaCl、1％(g/ml)NaAc、3％(g/ml)NaAc、5％(g/ml)NaAc，90℃20min，用滤纸过滤后测其澄清度、盐解液体积，硫酸软骨素浓度和蛋白质浓度。
酶解的优化研究
1)酶解过程中的pH变化分别酶解后的0、5、15、25、35、45、60、80、120和160min时，用pH计测定酶解液pH值，了解其pH的变化规律。
产品干燥方法的对比
分别采用60℃恒温真空干燥2小时、常温真空干燥24小时或真空冷冻干燥对产品进行干燥，比较干燥效果。
测定方法
1、硫酸软骨素含量的测定
取样2ml，碱提取原液、盐解原液调pH6-7后稀释到12.5倍，酶解原液调pH6-7后稀释到12倍，用间苯三酚分光光度法测定硫酸软骨素含量。
2、蛋白质含量的测定
取样2ml，盐解原液调pH6-7后稀释10倍，酶解原液调PH6-7后稀释5倍，用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。
3、澄清度的测定
取样1ml，盐解原液、酶解原液稀释10倍于640nm下用分光光度法测定吸光度。
4、氨基己糖含量测定：Elson-Morgan法(如上)。
5、氮含量测定:微量凯氏定氮法。取样品0.5g-0.6g进行测定。
结果：
1、两种前处理方法对鲟鱼不同部位软骨的处理结果，见表1-3
不论采用鱼头还是脊柱，煮沸法的软骨得率都显著高于浸泡法(p<0.05)，对于头骨两种方法处理后，氨基己糖的含量无显著性差异(p>0.05)，而对于脊柱骨，煮沸法处理其氨基己糖含量显著高于浸泡法(p<0.05)。鲟鱼的软骨主要有头骨和脊柱骨，同一方法处理头骨和脊柱骨的得率无显著差异(p>0.05)；但采用同一种处理方法，其头骨中的氨基己糖含量显著高于脊柱骨(p<0.05)。加上鱼头的前处理要比脊柱容易的多，因此鲟鱼头骨应是提取硫酸软骨素的合适原料。
表1-3两种前处理方法对不同部位软骨的处理效果
注：同一列中或同一行中不同上标字母的数值之间差异显著(p<0.05)。
2、不同碱提条件下的提取效果
表1-4碱提的数据结果
注：X1、X2、X3指水平数据的平均差；R为极差；澄清度是稀释10倍的原液。
3、不同浓度的NaCl、NaAc盐解的比较
盐浓度升高，盐解效果提高，但硫酸软骨素的损失也增加。NaCl、NaAc两种盐之间无显著性差异(如表1-5)，但考虑到成本因素，盐解条件为3％(g/ml)NaCl，90℃作用20min较为合适的。
表1-5盐解的数据结果
4、不同酶解条件的水解结果
++表示浑浊，+表示微浑浊，—表示水解完全。
图13为酶解过程中溶液pH的变化，从图中可以看出：在酶解最初的50min内，由于酶解产生的氨基酸较多，pH波动较为剧烈。之后，随着蛋白质逐渐酶解完全，产生的氨基酸越来越少，溶液的pH值波动逐渐趋缓。因此，酶解过程调pH值，前50min是关键，要随时酶解液进行pH的监测调节。
5、干燥方法对硫酸软骨素色泽的影响
利用本发明的方法提取的鲟鱼硫酸软骨素效果如表1-7所示：
表1-7本发明方法提取鲟鱼的硫酸软骨素效果
本法实施例所制得的鲟鱼硫酸软骨素的生物活性验证
1、鲟鱼硫酸软骨素的免疫调节及抗炎抗过敏活性
材料
鲟鱼硫酸软骨素：本实验室制备。
试剂：鸡红细胞(chickenredbloodcells,CRBC)由市售鸡无菌取血，以阿氏液抗凝离心沉淀后配成10％和5％的鸡红细胞混悬液，保存于4℃冰箱，2w内使用。10％蛋清溶液。鲨鱼硫酸软骨素标准品购自Sigma公司。
实验动物：购自中国医学科学院医学实验动物研究所繁育中心(20±2)g清洁级KM小鼠，合格证号：scxk(京)2005-0013。并于集美大学水产学院SPF实验动物中心(syxk(闽)2007-001)饲养。
方法
2.1给药方法
清洁级昆明小鼠饲养于集美大学水产学院SPF实验动物中心。雌雄各半，随机分成鲟鱼CS高、中、低剂量组、鲨鱼ChS组和对照组等五组。给药剂量参考硫酸软骨素成人用药量，高、中、低剂量组分别为600，60，和6mg/kg；鲨鱼CS组采用鲨鱼硫酸软骨素对照品60mg/kg；对照组给生理盐水；灌胃给药0.5mL，1次/d，连续14d。
2.2鲟鱼CS对免疫器官重量指数的测量
清洁级昆明小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分成五组，连续灌胃14d后，在最后一次灌胃的24h后，称重，脱颈椎处死小鼠，剖取胸腺和脾脏并称重。
2.3鲟鱼CS对外周血白细胞分析
清洁级昆明小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分成五组，连续灌胃14d后，在最后一次灌胃的24h后，眼球采血0.1mL，以EDTA抗凝送往厦门第二医院血液检查科检验。
2.4鲟鱼CS对迟发型变态反应(DTH)
清洁级昆明小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分成五组，连续灌胃的第7天后每鼠腹腔注射10％CRBC致敏200μL，于第14天灌胃后24h，每只小鼠右后足垫注射10％CRBC20μL，用游标卡尺测量注射前、注射后1h及24h右足垫的厚度，计算其肿胀度。
2.5鲟鱼CS对体液免疫功能—血清溶血素含量的测定(CRBC免疫法)
清洁级昆明小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分成五组，连续灌胃7d，每鼠腹腔注射10％CRCB悬液200μL进行免疫。饲养7d后从小鼠眼眶取血并分离出血清测定溶血素含量。每只小鼠取10μL血清，用生理盐水稀释100倍。取稀释后血清1mL与0.5mL5％CRBC悬液、0.5mL10％补体混合，在37℃下保温30min，冰水浴上终止反应。离心到上清液，在540nm波长处比色，以不加血清的空白作对照。以吸光度数值作为判断血清溶血素的指标。
2.6鲟鱼CS对二甲苯诱发小鼠耳过敏性肿胀的测定
清洁级昆明小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分成五组，连续灌胃14d，末次灌胃后24h在小鼠的右耳正反两面涂抹20μL二甲苯致炎，左耳不做处理，4h后颈椎脱臼处死小鼠，剪下双耳，用9mm的打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，电子天平称重。用左、右耳片重量差值作为肿胀度。
2.7鲟鱼CS对蛋清致足垫炎的测定
清洁级昆明小鼠50只，体重(20±2)g，雌雄各半，随机分成五组，连续灌胃14d，于第14d灌胃后24h每鼠右后足垫注射20μL10％蛋清溶液，用游标卡尺测量注射前、注射后30min及4h右足垫的厚度，计算其肿胀度。
2.8统计学处理
用SPSS13.0软件对各个实验结果数据进行统计学分析，统计结果用“均数±标准差”表示，用ANOVA分析并做T检验，当P<0.05为差异显著，当P<0.01为差异极显著。
结果
3.1鲟鱼CS对免疫器官重量指数的影响
结果显示，鲟鱼CS的三个剂量组和鲨鱼ChS组的小鼠脾指数均极显著高于对照组(P＜0.01)，但三个剂量组间及其与鲨鱼ChS组间没有显著性差异(P>0.05)。对于胸腺指数,只有高剂量鲟鱼CS组(600mg/kg)显著性高于对照组(P＜0.05)，其他各组间没有显著性差异(P>0.05)(表1)。
3.2鲟鱼ChS对外周血白细胞数量的影响
三种剂量的鲟鱼CS组和鲨鱼CS组的外周血中的白细胞数量显著性高于对照组(P＜0.05)，白细胞中的淋巴细胞数量极显著增加(P＜0.01)，此外，与鲨鱼CS组相比，CS的中、高剂量组的白细胞数量均极显著增高(P<0.01)，主要也是由于淋巴细胞数量显著增加(P＜0.01)。且在60mg/kg和600mg/kg剂量时除淋巴细胞数增加外，还有中性细胞数显著性增加(P＜0.05)(见表1)。
表1鲟鱼CS对小鼠免疫器官重量指数及外周血白细胞数量的影响
与对照组比较：1P＜0.05，2P＜0.01
3.3鲟鱼CS对迟发型变态反应(DTH)作用的影响
与对照组和鲨鱼CS组相比60mg/kg和600mg/kg剂量组，在注射CRBC后1h小鼠右后足垫的肿胀度显著提高(P＜0.01)，而与对照组相比，低剂量组的肿胀度提高不显著(P>0.05)，同时鲨鱼CS组却显著提高了(P<0.05)；在注射24h后对照组和实验组对比注射前均出现显著性肿胀(P＜0.05)，且肿胀度明显高于对照组(P＜0.05)，以60mg/kg和600mg/kg剂量最为显著(P＜0.01)(见表2)。结果表明鲟鱼CS对DTH具有促进作用。
3.4鲟鱼CS对血清溶血素的影响
连续灌胃鲟鱼CS能显著升高血清溶血素的吸光度值，且随灌胃剂量增加呈上升趋势(见表2)。鲟鱼CS使血清溶血素升高说明其能促进CRBC抗体产生，并与体液免疫功能调节有关。
表2鲟鱼CS对迟发型变态反应小鼠足垫肿胀度及血清溶血素的影响
3.5鲟鱼CS对二甲苯诱发小鼠耳肿胀的影响
结果发现，雄性小鼠对二甲苯致鼠耳肿胀度显著高于雌性。同时鲟鱼CS能明显降低雄性小鼠对二甲苯致鼠耳肿胀度，在600mg/kg剂量最为显著。但6mg/kg剂量和60mg/kg剂量对雌性小鼠因二甲苯致鼠耳肿胀度无降低作用，而在600mg/kg剂量能显著降低雌性小鼠对二甲苯致鼠耳肿胀度(见表3)。表明鲟鱼CS能显著降低二甲苯致鼠耳肿胀度。
3.6鲟鱼CS对蛋清致足垫炎的影响
鲟鱼CS60mg/kg和600mg/kg剂量能显著降低因蛋清致炎引起足垫肿胀度，但6mg/kg剂量的足垫肿胀度与对照组差异不显著(见表3)。表明CS对蛋清致足垫炎肿胀度有抑制作用，并与其给药剂量有关。
表3鲟鱼CS对小鼠耳过敏性肿胀度及蛋清致足垫炎肿胀度的影响
通过上述实验证明，鲟鱼CS能提高小鼠胸腺和脾脏的器官指数，具有明显增重作用；同时使小鼠外周血白细胞数量特别是淋巴细胞数显著性增多并有一定的剂量浓度依赖关系。
本研究证明，鲟鱼CS能明显增加小鼠足垫肿胀度提高迟发超敏反应能力，并提升CRBC血清溶血素水平，提示鲟鱼CS能促进T淋巴细胞的活化，增强细胞免疫功能；且对机体特异性免疫功能有促进作用。
在本研究证明，鲟鱼CS能显著降低因二甲苯致敏引发的鼠耳肿胀度及对蛋清致足垫炎肿胀度有抑制作用，表明鲟鱼CS具有抗炎抗过敏活性功能。
鲟鱼硫酸软骨素对小鼠免疫器官肥大细胞数量的影响
鲨鱼硫酸软骨素标准品：购自Sigma公司。
2.1鲟鱼CS灌胃给药
取50只清洁级KM小鼠(4周龄,20g)，按雌雄各半随机分成五组，每组10只。各组分别灌胃鲟鱼CS600mg/kg、鲟鱼CS60mg/kg、鲟鱼CS6mg/kg、鲨鱼CS60mg/kg(标准品组)和生理盐水(对照组)。每间隔24小时灌胃0.5mL药剂一次。连续灌胃2周后脱颈椎处死小鼠称重。取出胸腺、脾脏置入卡洛氏固定液中固定。
2.2石蜡组织切片制作
样品组织经固定后，石蜡包埋，作5μm厚连续切片。每间隔5张取一张组织切片用二甲苯脱蜡，经梯度酒精至水化后采用改良甲苯胺蓝(MTB0.8％甲苯胺蓝，0.6％高锰酸钾，蒸馏水煮沸配制)染色，切片入MTB染液中浸染约30S，用90％酒精分色，切片均经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
2.3肥大细胞数量测定
40倍物镜下观察胸腺及脾脏组织内肥大细胞的形态特征和分布，每组选择5张甲苯胺蓝着色良好的切片，分别在40倍物镜下计数5个5mm2视野下的数量。
2.4统计处理
用SPSS13.0软件对各个进行统计学分析，统计结果用“均数±标准差”表示，用ANOVA分析并做T检验。当P<0.05为差异显著，当P<0.01为差异极显著。
3.1鲟鱼CS对免疫器官肥大细胞数量的影响
如图1所示，40倍物镜中可观察到肥大细胞聚集在结缔组织周围，多呈不规则型，染色呈紫红色。从表4中可看出鲟鱼CS能极显著增加小鼠胸腺内肥大细胞数量(P＜0.01)，在60mg/kg剂量下差异最大，由对照组(3.18±0.96)个上升到(8.36±3.42)个。而标准品组的鲨鱼CS能显著增加小鼠胸腺肥大细胞数量(P＜0.05)，但效果不如鲟鱼CS显著。还可看出鲟鱼CS能极显著增加小鼠脾脏肥大细胞数量(P＜0.01)，在6mg/kg剂量下差异最大，由对照组(2.56±0.57)个上升到(6.41±2.14)个。标准品组鲨鱼CS也能显著增加小鼠脾脏肥大细胞数量(P＜0.05)，但效果不如鲟鱼CS显著。各个鲟鱼CS剂量组之间对免疫器官肥大细胞数量的影响差异不显著，但与鲨鱼CS标准品组相比，差异显著(P＜0.05)。结果显示鲟鱼CS与鲨鱼CS相比更能促进小鼠免疫器官肥大细胞数量的增加。
表4鲟鱼CS对小鼠免疫器官重量指数和肥大细胞数量的影响
鲟鱼CS对肝癌H22肿瘤细胞体外培养的影响
材料和方法
1.1材料
1.1.1肿瘤细胞株：
肝癌H227402、H227721、H22HepG2细胞株
1.1.2主要仪器及设备:
倒置相差显微镜,CO2培养箱,高压蒸汽消毒锅，酶联免疫检测仪,pH计,十二孔,九十六孔培养板,电子天平,50ml细胞培养瓶25ml细胞培养瓶,2ml冻存管,离心机,净化工作台恒温水浴锅,恒温振荡器,显微镜数码照相机
1.1.3试剂及药品：
硫酸软骨素(CS),硝基蓝四氮哇(NBT),HEPESRPMI1640培养基，胎牛血清DMSO,对硝基酚磷酸二钠(PNPP)，磷酸氢二钠(NaZHPO),氢氧化钠，柠檬酸(C6H:07.HZO)，甲醇，碳酸氢钠，阿霉素(ADR)，磷酸二氢钠(NaHZPO)，柠檬酸三钠(Na3C6HSO7.ZHZO)，氯化钠,四氮唑蓝(MTT)，L-谷氨酸(L-Glu)，十二烷基磺酸钠(SDS)
1.2方法
1.2.1细胞培养：
购买H227402，H227721，H22HepG2细胞株(对ADR没有耐药性)。细胞悬于含10％胎牛血清的即Ml1640培养液并保存在50ml培养瓶中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。每三天更换一次培养液，定期观察细胞密度，及时进行传代。冻存细胞按照75％RPMll640十5％DMSO+20％胎牛血清的比例配制冻存液。取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2四噻唑蓝(MTT)法测定硫酸软骨素体外抑制肝癌细胞生长实验
1.2.2.1收集对数期细胞，取对数生长期细胞离心后调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。
1.2.2.35％CO2，37℃孵育24、48、72小时，倒置显微镜下观察。
1.2.2.4每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
1.2.2.5终止培养，小心吸去孔内培养液。
1.2.2.6每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
1.2.2.7同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)培养结束后每孔加入DMSOl50μl，震荡10min，用酶标仪在波长490nm处测定A值。实验重复3次。测定硫酸软骨素对肝癌细胞的增殖抑制作用。并用SPSS软件计算IC50值[16、21]。
1.2.2.8肿瘤细胞生长抑制率按以下公式计算：肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[(A对照组-A实验组)/A对照组]×100％
1.2.3统计处理
2.1CHS对小鼠肝癌H227402株细胞体外培养生长的影响：
鲟鱼硫酸软骨素对小鼠肝癌H227402细胞体外培养生长无明显影响(P>0.05,无显著差异)。但硫酸软骨素终浓度62.5ug/ml至250g/ml时，肝癌H227402细胞生长有增殖增加趋势，当继续增大浓度至500ug/ml和1000ug/ml时，肝癌H227402有增殖降低趋势(见表5，图2)。
2.2CS对小鼠肝癌H227721株细胞体外培养生长的影响：
鲟鱼硫酸软骨素对小鼠肝癌H227721肿瘤细胞体外培养生长无明显影响(P>0.05,无显著差异)，但硫酸软骨素终浓度62.5ug/ml至1000g/ml时，肝癌H227402细胞生长有增殖增加趋势。见表5，图3
2.3CS对小鼠肝癌H22HepG2株细胞体外培养生长的影响：
鲟鱼硫酸软骨素对小鼠肝癌H22HepG2肿瘤细胞有抑制作用(P<0.05，有显著差异)，特别是在硫酸软骨素终浓度为1000ug/ml和125ug/ml是有明显的抑制作用(见表5，图4)。
表5CS对小鼠肝癌H227402肿瘤细胞体外培养生长的影响
与对照组比较：*P＜0.05肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[(A对照组-A实验组)/A对照组]×100％
鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞的作用研究
实验动物：购自厦门大学医学院实验动物中心20g清洁级KM小鼠，并于厦门大学医学院SPF实验动物中心饲养。
肝癌H22肿瘤株由厦门大学医学院提供。
2.1预防性给药试验方法
清洁级KM小鼠(4周龄时20克种)雌雄兼用(同一批实验用同一性别)，24只随机分成四组：模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。其中CS剂量组给药剂量参考上海实业联合集团生产的ChS(国药准字号H31020329)成人用药量，高剂量组600mg/kg、中剂量组60mg/kg、低剂量组6mg/kg；空白对照组灌胃生理盐水，每只分别灌胃给药0.5mL。间隔24小时灌胃1次，连续10天。10天后无菌操作，取传代7天的荷肝癌H22小鼠腹水，细胞计数，用生理盐水稀释至浓度为2*107个m/l，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml(4*106个/只)。接种一周后连续观察并记录肿瘤大小(用游标卡尺测定肿瘤的长A宽B,体积V＝1/2AB2),以及小鼠生长状况18天，后颈椎脱臼处死小鼠，称瘤重，计算抑瘤率，进行疗效评价，并将结果进行统计学处理。
抑瘤率＝(模型对照瘤重-给药组瘤重)/模型对照瘤重*100％
2.2肝癌H22荷瘤小鼠治疗性试验方法
取24只清洁级KM小鼠(4周龄时20克种)雌雄兼用(同一批实验用同一性别)，无菌操作，取传代7天的荷肝癌H22小鼠腹水，细胞计数，用生理盐水稀释至浓度为2×107个m/l，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml(4×106个/只)。接种一周后，将24小鼠随机分成四组：模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。其中CS剂量组给药剂量参考上海实业联合集团生产的ChS(国药准字号H31020329)成人用药量，高剂量组600mg/kg、中剂量组60mg/kg、低剂量组6mg/kg；模型对照组灌胃生理盐水，每只分别灌胃给药0.5mL。间隔24小时灌胃1次，连续12天。灌胃后连续观察并记录肿瘤大小(用游标卡尺测定肿瘤的长(A)宽(B)，体积V＝1/2AB2)。在小鼠生长状况18天后。颈椎脱臼处死小鼠，吸去血液，修去脂肪、系膜，用电子天平称取其湿重。然后根据模型对照瘤重计算抑瘤率。进行疗效评价，并将结果进行统计学处理。
抑瘤率＝(模型对照瘤重-给药组瘤重)/模型对照瘤重×100％
2.3统计处理
用SPSS13.0软件对各个实验结果数据进行统计学分析，统计结果用“均数±标准差(±s)”表示，用ANOVA分析并做T检验，当P<0.05为差异显著，当P<0.01为差异极显著。
3.1预防性灌胃CS给药对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响
从表6中可看出，6mg/kg、60mg/kg和600mg/kg剂量组小鼠肿瘤接种后8天肿瘤体积都明显小于对照组(P＜0.05)；在肿瘤接种后8天到18天期间，6mg/kg剂量组和对照组肿瘤体积变化率明显高于60mg/kg和600mg/kg剂量组，其中60mg/kg剂量组肿瘤体积的变化率最低，6mg/kg剂量组和对照组肿瘤体积变化率无明显差异(P＜0.05)；在肿瘤接种后18天，6mg/kg剂量组肿瘤体积大于对照组，而60mg/kg和600mg/kg剂量组肿瘤体积仍明显小于对照组(P＜0.05)，(见表6，图5)。结果表明鲟鱼CS预防性给药一定浓度下对小鼠肝癌H22肿瘤细胞的生长具有抑制作用。
表6预防性灌胃CS给药对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响
注：与对照组比较：*P＜0.05
3.2预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响
从表7中可看出，6mg/kg、60mg/kg和600mg/kg剂量组在肿瘤细胞接种后小鼠的体重都大于对照组，其中60mg/kg剂量组在肿瘤细胞接种后小鼠的体重最大(P＜0.05)(见表7，图6)。结果表明鲟鱼ChS预防性给药一定浓度下对接种后小鼠的体重增长较对照组有促进作用。
表7.预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响
3.3预防性灌胃给药对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响和抑瘤率
从表8中可看出，6mg/kg、60mg/kg和600mg/kg剂量组的抑瘤率分别为5.74％、19.8％和12.71％(P＜0.05)；6mg/kg、60mg/kg和600mg/kg剂量组在肿瘤细胞接种后肿瘤重量都小于对照组，其中60mg/kg剂量组在肿瘤细胞接种后抑瘤率最大，肿瘤重量最小(P＜0.05)；6mg/kg、60mg/kg和600mg/kg剂量组都对小鼠肝癌H22肿瘤细胞有抑制生长的作用，其中60mg/kg剂量组最为显著(P＜0.05)(见表8，图7、8)。结果表明鲟鱼CS预防性给药一定浓度下对小鼠肝癌H22肿瘤细胞的生长具有抑制作用。
表8.预防性灌胃给药CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响和抑瘤率
3.4鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响
从表9和图9中可看出在肿瘤接种8天后，各剂量组使小鼠肿瘤体积减少并不明显，肿瘤接种12天后，三种剂量的鲟鱼CS均可使小鼠肿瘤体积显著减少(P＜0.05)，且在600mg/kg剂量的鲟鱼CS作用最为显著。在肿瘤接种15天后，三种剂量的鲟鱼CS均可使小鼠肿瘤体积显著减少(P＜0.05)。在肿瘤接种18天后，60mg/kg和600mg/kg剂量的鲟鱼CS均可使小鼠肿瘤体积显著减少(P＜0.05)，而6mg/kg剂量的鲟鱼CS使小鼠肿瘤体积减少不显著。结果表明鲟鱼CS能促进小鼠肿瘤体积减小，而高剂量鲟鱼CS均能显著促进小鼠肿瘤体积减小。
表9鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤体积的影响
3.5鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响
从表10和图10中可看出在60mg/kg和600mg/kg剂量组的鲟鱼CS能显著增加接种肝癌H22肿瘤细胞小鼠的重量(P＜0.05)，且在60mg/kg剂量下差异最为显著，由对照组(30.65±2.78)克分别上升到(38.24±4.25)克。60mg/kg和600mg/kg剂量组的鲟鱼CS剂量组之间对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响差异不显著，但与对照组和6mg/kg相比差异显著。结果显示鲟鱼CS能促进小鼠体重的增加。
表10鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后小鼠重量的影响
3.6鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响和抑瘤率
从表11、图11和图12中可看出各个剂量组的鲟鱼CS均使小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量显著减少(P＜0.05)。且在60mg/kg剂量下肿瘤重量减少最为显著。从对照组(0.424±0.125)克到(0.265±0.114)克。在6mg/kg、60mg/kg、600mg/kg剂量组的鲟鱼CS的作用下肿瘤抑瘤率分别为11.4％、37.5％、31.8％。可以看出在60mg/kg剂量的鲟鱼CS对肿瘤抑制效果最好。结果显示鲟鱼CS能使小鼠肿瘤重量减少，对肿瘤生长起到了一定的抑制作用。
表11鲟鱼CS对小鼠肝癌H22肿瘤细胞接种后肿瘤重量的影响和抑瘤率
肿瘤是机体局部组织的细胞在各种内在和外界的致癌因子长期作用下，逐渐发生持续性异常增生所形成的新生物。肿瘤是常见病,多发病,其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。目前,已有许多抗肿瘤药物应用于临床,但多因其副作用大而在应用上受到限制。因此,人们逐渐将注意力转向从动植物中提取副作用小的抗肿瘤有效成分。