本发明属于医疗领域用动物模型领域，特别涉及小鼠模型。
背景技术：
胶质瘤是颅内最常见的原发难治性脑肿瘤，目前国内、外各实验室都在广泛开展胶质瘤的基础研究，包括胶质瘤的发生机制、生物学行为、基因通路与生物治疗和基因治疗等，在一定程度上提高了疗效，并改善预后。作为基础研究的平台，建立人脑胶质瘤原位移植模型至关重要。如今此类动物模型研究虽比较成熟，但都存在一定缺陷：以普通balb/c裸鼠建立的肿瘤模型，不能很好的示踪并分辨肿瘤和源于宿主的肿瘤微环境细胞；利用balb/c裸鼠与免疫功能正常的荧光小鼠杂交而来的荧光裸鼠，因其遗传学性状不稳定，其子代荧光表达并不稳定。为此，本发明旨在建立一种稳定表达绿色荧光蛋白的近交系免疫缺陷小鼠，从而为直观高效稳定地揭示肿瘤细胞与宿主组织之间复杂的关系奠定基础。
自从1907年美国杰克逊实验室的c.little首次培育出第一株近交系动物dba小鼠以来，近交系小鼠因为遗传背景一致，体积小，繁育快，易于重复操作，与人有许多共患疾病，而被做为医药研究的首选动物。一百年来，近交系品种不断增多，利用小鼠与人类类似疾病的特点在病因学、发病机制及预后等领域作出了突出贡献。1962年，英国格拉斯医院grist在近交系小鼠中，偶然发现了个别先天性胸腺发育不良的裸鼠，由此产生了免疫缺陷动物。人类细胞可以在免疫缺陷小鼠体内生存增殖，具有不同遗传背景和不同免疫缺陷表型的动物，大大推动了肿瘤学和免疫学等研究领域的发展。随着基因工程技术的发展，培育出的基因工程小鼠更具有应用价值，因而培育新的实验动物品种品系，更好的为实验研究服务，目前依然是个十分重要的任务。
目前转基因绿色荧光小鼠因其全身组织器官均能发出绿色荧光，适用于研究外源性组织或细胞(常用另一种荧光标记)在该小鼠体内与宿主(小鼠)组织细胞相互作用的体内研究，但该小鼠因免疫功能健全，不能移植人的组织或细胞于其体内并成活，因此无法用于人类组织细胞的体内荧光示踪实验研究。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明建立了一个既与亲本c57bl/6-tg(cag-egfp)－样稳定表达egfp，又与免疫缺陷小鼠(balb/c背景)一样具有免疫功能缺陷的近交新品系。利用同源导入法建立的新品系稳定表达egfp的模型小鼠，为人胶质瘤原位移植示踪研究胶质瘤及其肿瘤微环境奠定坚实基础。
本发明我们利用c57bl/6绿色荧光蛋白转基因小鼠和免疫功能缺陷小鼠(balb/c裸鼠)进行交配，通过动物杂交-回交的方式向其体内导入egfp基因，培育表达增强型绿色荧光蛋白基因的近交品系balb/c裸鼠，并进一步对其遗传背景、生物学特征、绿色荧光蛋白表达规律进行了分析。在此基础之上，采用瘤细胞或者肿瘤组织块接种的方式，建立了人脑肿瘤原位接种动物模型，并对该模型的荧光表达强度及荧光稳定性、模型制备成功率、可重复性等指标经行了评价，取得良好成果。
根据本发明的一个方面，提供了一种建立绿色荧光balb/c裸小鼠模型的方法，方法如下：
选取雌性c57bl/6-tg(cag-egfp)小鼠与雄性foxn1nu小鼠杂交得到f1子代均为有毛荧光小鼠，筛选其中♀小鼠，待其性成熟后与亲代♂foxn1nu交配(回交)得f2；产生f2子代性状分离，筛选其中♀有毛荧光鼠与亲代♂foxn1nu回交，完成一个回交循环；此回交循环过程一共进行10代，得到f10，达到第十代符合标准,十代以后(包含第十代)就可以用于肿瘤示踪研究,建立绿色荧光balb/c裸小鼠模型。
在一些实施方式中，在f10子代中筛选♀有毛荧光鼠与♂荧光裸小鼠杂交，筛选其中荧光亮度高的子代，以此建立血缘扩大群及生产群。
在一些实施方式中，筛选其中♀有毛荧光鼠表型的鉴定方法为：孕鼠生产后，利用有无体毛的特征来辨认新生仔鼠是否为裸小鼠，无毛为裸小鼠；
性别判断方法为通过肛门与生殖器的距离辨别；荧光的初步判断方法为使用荧光成像仪判断是否为发绿色荧光的荧光鼠。
在一些实施方式中，绿色荧光balb/c裸小鼠需经过基因型筛选，待筛选的小鼠出生10d前后剪尾(＜0.5cm)，在56℃热水浴应用蛋白酶k消化6h，基因组dna抽提试剂盒提取dna，紫外分光光度计测od值，稀释为100ng/μl作为dna模板；pcr反应体系为20μl，其中pcrmix10μl，上下游引物各1μl，模板dna1μl，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，共30个循环，末次循环后72℃延伸7min，1.5％琼脂糖凝胶电泳，判读结果。
在一些实施方式中，上下游引物为egfp-f和egfp-r，序列如下：
egfp-f序列为seqno.1：5′-tgccgttcttctgcttgtc-3＇，
egfp-r序列为seqno.2：5＇-ccaggagcgcaccatctt-3＇，
目标产物长度203bp。
在一些实施方式中，f10需经过生化位点检测，生化位点检测的检测位点为akp1、car2、ce2、es1、es3、es10、gpd1、gpi1、hbb、idh1、mod1、pgm1、pep3和trf，所述检测位点即14个遗传位点基因表型均为纯合则达到达到了建立近交系的标准。
在一些实施方式中，建立绿色荧光balb/c裸小鼠所需的近交系荧光裸鼠pep3位点为b型。
本发明还提供了使用建立绿色荧光balb/c裸小鼠模型的方法建立的动物模型的应用，本发明建立的动物模型在脑肿瘤移植模型中的应用。
附图说明
图1是纯合子(nu/nu,无毛)和杂合子(nu/+,有毛)在多模式小动物成像系统的470nm蓝光激发下成像图；
图2是鼠尾组织egfp的rt-pcr电泳；
图3是海马齿状回nestin免疫荧光染色图；
图4是所建立近交系荧光裸鼠神经干细胞与其分化细胞egfp表达量的比较图；
图5为u87细胞接种第10代纯合子肿瘤状态图；
图6为颅内移植瘤模型照片；
图7为肿瘤在近交系裸鼠颅内生长情况图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1绿色荧光balb/c裸小鼠模型的建立
1.主要材料及仪器设备：
balb/c裸小鼠、绿色荧光蛋白转基因鼠c57bl/6-tg(cag-egfp)购自南京大学模式动物研究所(scxk苏2010-0001)；独立通风笼架购自苏州冯氏实验动物设备有限公司(ivc-ⅱ)；生物安全柜购自新加坡忆思洁净设备有限公司(esco)；小动物多模式活体成像仪(in-vivoimagingsystemfxpro)购自kodak公司。荧光手电筒购自nightsea公司，pcr仪(ab公司)，流式细胞仪(bd公司)，荧光倒置显微镜(nikon公司)，co2培养箱(德国heraeus公司)。sly系列动物脑切片模具购自北京硕林苑科技有限公司。冰冻切片机购自德国leica公司，冰冻切片机(leica，germany)，荧光电筒(nightsea，usa)，小动物多模式活体成像仪(kodak，usa)，立体定向仪(zh-蓝星c，淮北)。
2.近交系荧光裸鼠的繁育：
3.近交系荧光裸鼠的鉴定：
(1)表型，孕鼠生产后，利用有无体毛的特征来辨认新生仔鼠是否为裸小鼠、肛门与生殖器的距离辨别性别、荧光成像仪用于初步辨别是否为发绿色荧光的荧光鼠；
(2)基因型，出生10d前后剪尾(＜0.5cm)，在56℃热水浴应用蛋白酶k消化6h，基因组dna抽提试剂盒提取dna，紫外分光光度计测od值，稀释为100ng/μl作为dna模板；pcr反应体系为20μl，其中pcrmix10μl，上下游引物各1μl，模板dna1μl，94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，共30个循环，末次循环后72℃延伸7min。1.5％琼脂糖凝胶电泳，判读结果(引物序：seqno.1:egfp-f：5′-tgccgttcttctgcttgtc-3＇，seqno.2:egfp-r：5＇-ccaggagcgcaccatctt-3＇，产物长度203bp)；
(3)微生物和遗传学检测，按gb14922.1-2011、gb14922.2-2011和gb/t14927.1-2008标准分别进行，其中遗传生化位点委托中国食品药品检定研究院完成。外周血淋巴细胞检测，心脏抽血，上流式细胞仪，对anti-mousecd19pe-cyanine7，anti-mousecd3apc进行评估；
实施例2绿色荧光balb/c裸小鼠结果及判定
1.绿色荧光balb/c裸小鼠特征
在图1中1,2分别是无毛和有毛鼠，2号鼠因毛发不表达egfp而不发绿色荧光；3-5分别为脑的水平、矢状和冠状位厚切片，显示海马、嗅球等部位的荧光较强；6,7分别是脑海马冰冻切片和骨髓细胞涂片，显示其绿色荧光较强。
2.foxn1nu.b6-cag-egfp/su品系小鼠血液学检测及基因表达鉴定
如图2所示m为分子量标志物；泳道1：balb/c裸鼠；泳道2-5：近交系绿色荧光裸鼠oxn1nu.b6-cag-egfp/su；泳道6：c57bl6-egfp小鼠。
3.foxn1nu.b6-cag-egfp/su生化位点检测
表1
如上表1所示，对6只第10代近交系荧光裸鼠进行生化位点检测，14个遗传位点基因表型均为纯合，达到了建立近交系的标准，其中13个位点与balb/c鼠一致；而在pep3位点，近交系荧光裸鼠是b型，有别于balb/c鼠的a型。
实施例3皮肤移植实验
流式细胞仪分析balb/c裸鼠近交系外周血淋巴细胞为mhcclassi型，约94％的外周血淋巴细胞为d型，与balb/c鼠表型一致。从第10代中随机取有毛6周龄鼠9只(6周龄雌性有毛小鼠)10％水合氯醛200mg/kg腹腔注射麻醉，于小鼠背部取直径0.8cm皮肤，修剪内侧面皮下组织至真皮层。与取自另一只小鼠的相同大小皮片交换，间断缝合，对皮片加压包扎，观察皮片生长状态。移植皮肤的生长状态:术后第10天,皮片对位良好，皮下无积液,30d以后皮肤表面可见微绒毛生长，提示所植皮肤已经成活。持续观察3个月以上，移植皮片生长良好，未发生免疫排斥反，植皮成功率100％。
本发明方法得到的foxn1nu.b6-cag-egfp/su具有如下特性：(1)按国家标准(gbt14927.1-2008)检测的14个生化遗传位点基因表型均为纯合，与balb/c鼠14个生化遗传位点比对，有13个吻合，唯pep3为b型，有别于foxn1nu裸小鼠的生化遗传标记位点a型；(2)鼠尾组织rt-pcr、荧光激发下所见的幼体和成体鼠都能证明其高表达egfp并发出强烈的绿色荧光，两种检测方法的结果对鉴别是否表达egfp或发绿色荧光是一致的，基于rt-pcr需要剪鼠尾组织，是一种创伤性检测，已被活体荧光检测法替代而不作为常规检测方法；(3)繁殖能力：所建立近交系生长在ivc系统内，按spf级别管理，定期抽哨兵鼠作微生物检测进行监测，每胎产仔6-8只，如能及时淘汰离乳率达100％，其中nu+/+和nu+/-天然比例各占－半，毛发和外周血红细胞以外的所有器官组织和细胞都发绿色荧光，6-8周龄成年鼠体重22-30g左右。
实施例4本发明方法建立的模型应用
本发明方法建立的foxn1nu.b6-cag-egfp/su品系小鼠动物模型可以用于动物模型在脑肿瘤移植模型的建立。
1.egfp免疫缺陷鼠(foxn1nu.b6-cag-egfp/su品系)的饲育
饲养于苏州大学实验动物中心小鼠独立送风(ivc)系统内【使用许可证号syxk-(苏)2012-0045】
2.nestin免疫荧光染色
依此滴加兔抗小鼠nestin抗体及alexafluor594标记山羊抗兔二抗(lifetechnologies公司)，常温避光孵育1h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)复染核10min，最后用抗荧光淬灭封闭液封片，荧光显微镜下观察。
4.神经干细胞培养
胎脑神经干细胞的原代培养：取本发明方法培育的第10代妊娠17d的雌性绿色荧光小鼠，全身麻醉后处死并取出胎鼠全脑，剪碎后加入0.25％的胰酶消化5～10min。用含10％胎牛血清(美国gibco公司)的改良的eagle's培养基(美国gibco公司)终止消化并反复吹打制成单细胞悬液，1000rpm离心5min，用无血清dmem培养基重悬细胞，调整细胞密度以1×107/ml接种于75ml培养瓶中，加入干细胞培养基dmem+2％b27+20ng/m1碱性成纤维细胞生长因子(bfgf，美国gibco公司)，置于37℃、5％co2孵箱中培养，5～7d传代1次。形成的神经球以20～30个细胞球每毫升接种于24孔培养板中，加入含10％fbs(胎牛血清)的dmem培养基。诱导分化5～7d后以免疫荧光染色检测神经干细胞分化前后egfp表达情况。
5.将红色荧光蛋白基因转染胶质瘤细胞系的u87-rfp细胞用微量注射泵接种于5只6周龄雌性f10代纯合子裸小鼠颅内(每只鼠1×105个细胞)，利用活体成像系统每周观测肿瘤生长情况。
颅内接种后第5、9、14、21和30天，荷瘤鼠麻醉仰卧于小动物活体成像仪内，进行活体荧光显像。动态活体成像结束后处死荷瘤鼠，然后将荷瘤鼠脑置于sly冠状位脑切片模具中，制作1mm厚连续脑切片。取冠状位第3～4张切片(肿瘤接种的位置)行oct包埋剂包埋，在冰冻切片机上进行5μm厚连续薄层切片，相邻切片行常规he染色。
6.统计学分析
所有数据均采用统计软件spss18.0进行处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。其中，两样本均数比较采用独立样本t检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析(anova)，以p＜0.05表示差异有统计学意义。
6.结果与分析
6.1绿色荧光蛋白在免疫缺陷近交系鼠脑组织中表达的定位分析：
所建立近交系鼠脑组织egfp阳性表达，绿色荧光下可见海马齿状回少数细胞呈圆形。以红色荧光蛋白(rfp)标记的抗巢蛋白(nestin)荧光抗体染色后在红色荧光下仅圆形细胞可见，图像融合后可见nestin-egfp双阳性黄色细胞，提示海马齿状回nestin染色阳性的神经干祖细胞亦可表达egfp(如图3)。鼠胎脑原代神经干细胞球及传代至7代的分化细胞均在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光，且荧光强度稳定持续，两种细胞荧光分光光度计结果统计无明显差异(图4)。
图3为海马齿状回nestin免疫荧光染色图，a,b-1：egfp阳性细胞为绿色，b-2：nestin阳性细胞为红色。b-3：为在融合像上见到了为数不多的egfp-nestin双阳性的黄色细胞。(标尺：a,100μm；b,20μm)(放大倍数:a,100倍b,400倍)
图4为所建立近交系荧光裸鼠神经干细胞与其分化细胞egfp表达量的比较图，a:近交系荧光裸鼠的胎脑原代神经干细胞，在荧光显微镜下发明亮的绿光b：传代至7代的分化细胞，在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。c:两种细胞荧光分光光度计结果统计无明显差异(标尺：a,100μmb,100μm放大倍数：a,100倍b,100倍)(标尺：a,b20μm)
6.2胶质瘤细胞系皮下接种致瘤实验
图5为u87细胞接种第10代纯合子肿瘤状态图，如图5所示，肿瘤细胞接种于小鼠右侧颈后肩部皮下，四周后肿瘤生长至长径约13mm，肿瘤大小基本均一。
6.3胶质瘤细胞系原位接种致瘤实验
图6为颅内移植瘤模型照片，如图6所示，a：分别为接种u87-rfp后5、9、14、21和30d在活体成像系统下所见；b：接种30天后致瘤鼠脑大体解剖所见；c:接种30天后致瘤鼠脑切片。
图7为肿瘤在近交系裸鼠颅内生长情况图，如图7所示a：颅内移植瘤he染色；b：颅内移植瘤冰冻切片在荧光显微镜下呈现红-绿双色荧光；c：活体成像系统下可见致瘤小鼠全身呈现绿色，颅内移植瘤呈现红色。(标尺：a，200μmb，200μm)(放大倍数：a，40倍b，40倍)。
结论
本发明方法构建的balb/c背景荧光模型裸鼠采用同源导入近交系繁育法，遵循保持近交动物同基因型和基因纯合性的原则及遗传质量控制的标准：其构建经由10代以上的杂交-回交导入法培育得到，群体性基因高度纯合、稳定，动物个体均一，反应性一致，突变性状能稳定遗传。该品系具有同基因性、均一性及遗传上的高度稳定性。为了鉴定其遗传纯度，先后采用皮肤移植实验、h-2单倍型检测及生化标记检测对该小鼠基因的纯合性进行了测定。此外，皮肤移植是近交系遗传监测中较有说服力的方法，它是通过同种同品系异体皮肤移植是否发生免疫排斥反应来判断动物的组织相容性抗原(mhc)抗原是否一致的免疫学检测方法。鉴于所建荧光模型裸小鼠自身的免疫功能缺陷，故选取转入基因为杂合子的有毛鼠(免疫功能正常)进行皮肤移植实验，9只实验鼠在100d的观察期内，没有发生急性及慢性免疫排斥反应，植皮成功率为100％(9/9)。通过该品系杂合子有毛小鼠间皮肤移植实验表明，无论突变基因是纯合型还是杂合型，该品系小鼠mhc抗原一致，进一步证实了小鼠的基因具有高度的同源性，即所建荧光模型裸小鼠达到了国际认可的近交系标准。
冰冻切片nestin免疫荧光染色证实在海马齿状回中神经干细胞分布和egfp的强阳性表达区相一致(图3)。荧光显微镜下可见，体外分离的egfp荧光模型裸鼠胎脑神经干细胞球在原代和传代培养7代后仍具有稳定的绿色荧光，诱导其分化后的egfp仍呈强阳性表达，同时，在蛋白水平均证实其持续稳定。因此egfp能稳定持续地高水平的遗传。
利用本发明方法的模型鼠建立的双色荧光示踪的人胶质瘤原位移植模型，利于对颅内肿瘤生长状况进行直接观测。该品系动物已达到近交系标准，故而是在动物生存期内进行药物治疗性对照研究的更好选择。
本发明方法成功培育balb/c背景的近交系荧光裸鼠，并对其脑组织中荧光分布规律进行初步探讨；在此基础上成功建立胶质瘤皮下及原位移植模型。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。